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Suivi de la fonctionnalité des jonctions communicantes par la technique de gap-FRAP sur des modèles in vitro (2-D, 3-D) et ex vivo : Intérêt pour le diagnostic du cancer

Abbaci, Muriel 21 October 2008 (has links) (PDF)
Ce travail de recherche s'inscrit dans un axe de diagnostic du cancer via le développement d'une méthode optique pour la caractérisation fonctionnelle de tissus. La technique de gap- FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) permet l'étude quantitative de la fonctionnalité des jonctions gap. La majorité des cellules néoplasiques se caractérisent par une modification du niveau d'expression et/ou de la fonctionnalité des jonctions gap par comparaison à leurs homologues saines. La technique de gap-FRAP permet en conséquence de discriminer les cellules cancéreuses en fonction de la communication intercellulaire gap jonctionnelle (CIGJ). Particulièrement utilisée in vitro, cette technique restait cependant anecdotique ex vivo. Nous avons validé la faisabilité du transfert de cette méthode sur tissus et organes ex vivo. A partir de cellules de statuts différents en expression et en distribution des connexines, nous avons caractérisé la calcéine-AM comme étant une sonde fluorescente adaptée pour des mesures sur tissus. Puis nous avons développé un modèle d'ingénierie systéme pour l'analyse comparative des données de recouvrement de fluorescence sur des modèles bi et tridimensionnels. Nous avons transposé ces conditions préalablement définies sur organe entier ex vivo : la vessie de rat. Un marquage multiple a été optimisé avec une sonde fluorescente pour le tracking des cellules cancéreuses dans la vessie ex vivo, un marqueur pour l'identification histologique de l'urothélium et la calcéine-AM pour mesurer la CIGJ. Le gap-FRAP a été utilisé pour la première fois pour différencier le degré de communication intercellulaire gap jonctionnelle entre le tissu sain et néoplasique sur un organe entier ex vivo, ouvrant des perspectives pour le diagnostic du cancer de la vessie corrélé à la modification de la CIGJ.
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Chirurgie fonctionnelle des epilepsies réfractaires: nouvelles approches physiopathologiques, diagnostiques et thérapeutiques; Surgery for refractory epilepsy: New concept regarding physiopathology, diagnosis and treatment.

Colligon, Frédéric 21 May 2007 (has links)
Beaucoup de progrès restent à réaliser dans la compréhension de la physiopathologie ainsi que dans la prise en charge thérapeutique de lépilepsie. De nombreux patients restent réfractaires au traitement médical et sont susceptibles dêtre de bons candidats à un traitement chirurgical. Lapport de nouvelles techniques dimagerie est une avancée importante dans la définition des crises et dans la localisation du foyer épileptogène et a permis daméliorer le résultat du traitement chirurgical par une meilleure sélection des candidats. La première partie de notre travail est une introduction générale où sont principalement exposées les techniques actuelles dexploration de lépilepsie ainsi que les résultats à long terme du traitement chirurgical chez 399 patients souffrant dépilepsie réfractaire, de manière à préciser le rôle de la chirurgie ainsi que les facteurs pouvant influencer le résultat postopératoire. La prise en charge des crises dépilepsie réfractaire dont le foyer épileptique se localise au niveau de zone fonctionnelle reste difficile et controversée. Il existe des arguments historiques et physiologiques justifiant une exérèse chirurgicale du foyer au niveau de zones fonctionnelles telles que le cortex sensitivomoteur mais il nexiste pourtant pas dans la littérature moderne de série qui permette dévaluer lefficacité de ce traitement et de le comparer avec dautres techniques chirurgicales comme par exemple les transsections sous- piales multiples. Dans la deuxième partie de ce travail, nous présentons une série de cinq patients provenant de la série des 399 patients exposée dans la première partie de notre travail, qui ont tous bénéficié dune résection corticale au niveau du cortex sensitivomoteur. Nous montrons que la difficulté du traitement de ces patients nest pas tant le geste chirurgical mais la définition et la localisation exacte du foyer épileptogène. Nous démontrons également que la mise au point exhaustive et précise de cette pathologie, en utilisant les méthodes dinvestigation décrites dans la première partie, permet de sélectionner les candidats de manière optimale avec des résultats postopératoires satisfaisants. La physiopathologie des crises dépilepsie est encore mal définie. Le mécanisme le plus souvent évoqué est un déséquilibre synaptique entre les afférences excitatrices et inhibitrices, une anomalie des canaux ioniques membranaires ou encore un trouble du métabolisme neuronal ou glial au niveau dun foyer où les neurones présentent une activité anormale. Une des questions primordiales à éclaircir est de savoir si cest le neurone qui est hyperexcitable, le réseau neuronal présent au sein du foyer ou les deux. Les structures gliales formées par les astrocytes et les oligodendrocytes jouent-elles un rôle accessoire ou primordial dans ce phénomène ? En dehors du rôle que pourraient jouer les connexions synaptiques dans le phénomène épileptique, les jcs semblent être importantes dans le mécanisme physiopatholgique des crises. Elles pourraient favoriser la synchronisation de lactivité épileptique ainsi que la propagation de celle-ci vers les régions cérébrales avoisinantes. La troisième partie de notre travail explore le rôle que pourrait jouer les jcs dans le phénomène épileptique. Les épilepsies mésiotemporales associées à une sclérose hippocampique sont les épilepsies dont le traitement chirurgical est le plus fréquemment proposé lorsque les crises deviennent réfractaires au traitement médical. Lobtention de tissu est dès lors aisée ce qui nous a permis détudier lexpression des jcs au niveau de tissus hippocampiques provenant de patients épileptiques et de la comparer avec celle déterminée au niveau dhippocampes provenant de patients non épileptiques et obtenus postmortem. Notre objectif est de savoir si cette éventuelle contribution au phénomène épileptique est liée à une augmentation de lexpression des jcs au niveau des tissus épileptiques et, si oui au niveau de quels types cellulaires (neurones, astrocytes) et de quelles régions de lhippocampe (gyrus dentelé, CA1 à CA4, subiculum)
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Implication des connexions dans les effets de l'ischémie cardiaque /

Patoine, Dany. January 2007 (has links) (PDF)
Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 76-82. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.
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Influence des ratios de co-expression précis Cx43 : Cx45 sur la formation des canaux de jonction et leurs propriétés électriques / Influence of Cx43 : Cx45 accurate co-expressed ratios on gap junction channels formation and their electricals properties

Dupuis, Sebastien 16 December 2016 (has links)
Les canaux de jonctions (CJ) composés des connexines (Cxs) assurent la communication intercellulaire directe qui par leur propriétés électriques régulent la propagation du potentiel d’action (PA) cardiaque. Dans les myocytes ventriculaires Cx43 et Cx45 exprimées à des niveaux et ratios physiopathologiques variables assurent cette fonction. Cette étude détermine la contribution de Cx43 et Cx45 dans la formation des CJ et leurs propriétés électriques. La lignée cellulaire épithéliale de foie de rat exprimant la Cx43 endogène et transfectée de manière stable pour exprimer des ratios Cx43:Cx45 précis a été utilisée. Les propriétés électriques des CJ ont été obtenues par double voltage clamp sur paires de cellules. L’expression de la Cx45 diminue le couplage électrique et augmente la dépendance au potentiel de jonction indépendamment du ratio. Les cinétiques de désactivation sont ralenties avec l’augmentation du niveau d’expression de Cx45 et les cinétiques de restitution sont modifiées en fonction du ratio. Les conductances unitaires suggèrent la formation de CJ composés de Cx43 et Cx45. La diminution du niveau d’expression de Cx43 par ARNi anti-Cx43 entraine une diminution du couplage électrique tandis que les autres propriétés électriques restent inchangées. Ces résultats montrent une contribution spécifique de Cx43 et Cx45 dans la régulation de la formation et des propriétés électriques des CJ caractérisées. Ces propriétés seront corrélées à la participation des CJ dans la régulation de la propagation du PA en fonction des profils d’expression des Cxs en conditions physiologiques et pathologiques. / Gap junction channels (GJCs), composed of connexins (Cxs) allow a direct intercellular communication that ensures the cardiac action potential (AP) propagation. Cx43 and Cx45 co-expressed in ventricular myocytes with changing expression levels and ratios in the healthy and the diseased heart ensure this function. The purpose of this study is to determine the contribution of Cx43 and Cx45 on the formation of GJCs and their electrical properties. Rat Liver Epithelial cells that endogenously express Cx43 and stably transfected to co-express accurate Cx43:Cx45 ratios have been used. The electrical properties of GJCs at each ratios were obtained by performing dual voltage clamp recordings on cell pairs. Expression of Cx45 decreases the electrical coupling and increases the voltage dependence independently of the ratio. The kinetics of deactivation are slowed with the increases of Cx45 level of expression and the kinetics of recovery are modified in a Cx43:Cx45 ratio dependent manner. Unitary conductances suggest a formation of GJCs composed by Cx43 and Cx45. The decreases of Cx43 level of by a SiRNA treatment induces a decrease of the electrical coupling, while other electrical properties are not affected. Our data show a specific contribution of Cx43 and Cx45 in regulation of the GJCs characterized by specific electrical properties. Such properties will be correlated to the function of GJCs in regulating the AP propagation in the specific patterns of expression of Cxs in the healthy and diseased heart.
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Régulation des jonctions communicantes chez les complexes ovocyte-cumulus de porc au cours de la maturation in vitro

Santiquet, Nicolas 19 April 2018 (has links)
Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.
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Expression hétérologue de la connexine humaine 43 dans Escherichia coli / Heterologous expression of human connexin 43 in Escherichia coli

Silacheva, Maria 10 March 2014 (has links)
Les protéines membranaires (PMs) sont les composants fonctionnels principaux des membranes biologiques. Les processus cellulaires fondamentaux sont régulés à l’aide des PMs. Malgré leur importance et leur intérêt scientifique et pharmaceutique, les structures des PMs ne représentent qu’une partie mineure des structures 3D répertoriées. Les PMs humaines sont des cibles particulièrement intéressantes mais parmi plus de 7000 PMs humaines, seules 30 structures ont été élucidées.Les raisons principales qui rendent les PMs très difficiles à étudier sont leur faible abondance et leur nature hydrophobe. En effet, le niveau d’expression des PMs dans leur environnement naturel est habituellement faible et la surexpression hétérologue aboutit souvent à une protéine inactive.Les connexines font partie de la famille des PMs intégrales de vertébrés. Elles sont largement exprimées dans tout le corps et sont impliquées dans les processus essentiels à un fonctionnement physiologique normal. En s’oligomérisant elles établissent des canaux intercellulaires qui forment des jonctions lacunaires. La communication des jonctions lacunaires joue un rôle essentiel dans la fonction des tissus et le développement des organes. Ainsi, les mutations génétiques des connexines provoquent des désordres héréditaires. Les connaissances actuelles portent principalement sur la physiologie des connexines et la perméabilité des pores. Difficiles à produire pure, homogène et en quantité suffisante pour la cristallisation, l’unique structure de résolution atomique de jonction lacunaire est un polymère de la connexine 26. La connexine 43 (Cx43), protéine de jonction lacunaire la mieux étudiée, est exprimée dans tout le corps humain. Les études structurales de microscopie électronique ont montré que le domaine cytoplasmique C-terminal de Cx43 (Cx43CT) est flexible et diminue la qualité de diffraction des cristaux 2D. La troncation de la majorité de Cx43CT améliore la résolution des segments transmembranaires de Cx43. Tronqué au niveau du résidu 263, le mutant Cx43-263T est néanmoins capable de former des cristaux 2D et de s’assembler en jonctions lacunaires. L’œuvre présenté est consacré à l’étude de Cx43, Cx43-263T et Cx43CT.L’optimisation des codons du gène de la connexine et la minimisation de la stabilité de la structure secondaire d’ARNm ont considérablement augmenté l’expression de Cx43 et Cx43-263T. De nouvelles procédures de purification de Cx43-263T et Cx43 ont été élaborées. La protéine purifiée a été reconstituée en polymère amphiphile amphipol A8-35 et caractérisée par des approches de SEC, DLS et SAXS. Des techniques indépendantes ont montré l’auto-assemblage de Cx43-263T fonctionnelle en hexamères.Cx43 homogène a été surexprimée dans E. coli, purifiée et caractérisée par SEC, DLS, DSC et SAXS. L’oligomérisation a été mesurée en fonction de la concentration.Cx43-263T et Cx43 fusionnées à la protéine Mistic ont été surexprimées dans E. coli. La séparation de Mistic de la connexin a été testée avec différentes protéases, jonctions, conditions de clivage et soit in vivo soit in vitro. Toutes les constructions ainsi générées ont démontré une haute résistance aux protéolyses spécifiques. Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane protein constructs) est une séquence de protéine de B. subtilis, qui permet l'adressage des PMs intégrales dans la membrane. Mistic a été surexprimée chez E. coli et la protéine homogène a été purifiée avec divers détergents. Alors que la structure tertiaire de Mistic, solubilisée avec de l'oxyde de lauryldimethylamine, est déjà déterminée, la structure native de Mistic dans un milieu lipidique, qui permettrait de comprendre sa fonction, n’est pas encore disponible. Dans le travail présenté ici, Mistic a été reconstituée dans des lipides différents et utilisée pour des essais initiaux de cristallisation in meso. Mistic a de plus été utilisée pour la production d’anticorps anti-Mistic. / Membrane proteins (MPs) are major functional components of biological membranes. Keycellular processes are regulated with the help of MPs. Despite high importance and greatscientific and pharmaceutical interest, structures of MPs represent only a tiny fraction of all3D structures in Protein Data Bank. Human MPs are particularly challenging targets. Out ofmore than 7000 human MPs, structures of only about 30 were elucidated.The main reasons which make MPs so difficult to study are their low natural abundance andhydrophobic nature. Expression level of MPs in their natural sources is usually rather low.Heterologous overexpression often leads to inactive protein.Connexins comprise a family of vertebrate integral MPs that are widely expressed throughoutbody and involved in a wide variety of processes essential for normal physiological function.They are able to oligomerize and form intercellular channels which compose gap junctions.Gap junctional communication plays crucial role in normal tissue function and organdevelopment. Connexin gene mutations cause a number of inherited disorders.By now a wealth of knowledge is available about physiology of connexins and their channelpore permeability. However, atomic resolution structure of gap junction channel formed byonly one connexin family member (connexin 26) was determined. This is mostly explained bydifficulty to produce sufficient for crystallization amount of pure and homogenous protein.Connexin 43 (Cx43) is the best-studied gap junction protein, and it is widely expressedthroughout the human body. Initial structural studies by electron microscopy have shown thatflexible C-terminal cytoplasmic domain of Cx43 (Cx43CT) worsens diffraction quality of 2Dcrystals. Removal of most of the Cx43CT improved resolution of transmembrane segments ofCx43. Truncated at residue 263 mutant of Cx43 (Cx43-263T) still was able to form2D crystals and assembled into gap junctions. Thus, the present work is dedicated to the studyof three forms of Cx43, namely Cx43-263T, Cx43CT, and full-length Cx43.Performed in our work connexin gene optimization for E.coli codon bias and minimization ofstability of mRNA secondary structure significantly enhanced expression of Cx43 and Cx43-263T. Procedures for Cx43-263T and Cx43 purification were developed. The purified proteinwas reconstituted into amphipathic polymer amphipol A8-35 and characterized by SEC, DLS,and SAXS. Applied independent techniques showed self-assembling of purified Cx43-263Tinto hexamers demonstrating its functionality.Cx43CT was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity. The protein wascharacterized by SEC, DLS, TSA, and SAXS. The concentration-dependent oligomerizationwas established.In the beginning of our project Cx43-263T and Cx43 were overexpressed in E. coli usingMistic fusion protein. A number of constructs providing various linkers and proteaserecognition sites were generated. To remove Mistic from the produced proteins in vivo and invitro cleavage were tested. All generated constructs demonstrated high resistance to specificproteolysis in wide range of conditions.Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane proteinconstructs) from B. subtilis was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity usingdifferent detergents. While the tertiary structure of solubilized in lauryldimethylamine oxideMistic was determined earlier, the native structure of Mistic in lipid environment elucidatingits function is not available yet. In the present work Mistic was reconstituted into differentlipids and used for initial in meso crystallization trials. Additionally, Mistic was used forproduction of anti-Mistic antibodies.
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Implication des connexions dans les effets de l'ischémie cardiaque

Patoine, Dany 12 April 2018 (has links)
L'ischémie cardiaque est une condition bien connue pour induire un déséquilibre ionique général dont une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire, et une déplétion de la concentration d'ATP intracellulaire. Dans ce travail, nous avons donc étudié son effet sur l'ouverture des hémicanaux, structures à l'origine de la formation des jonctions gap, mais dans l'état où ils ne sont pas appariés pour former un canal intercellulaire. Pour ce faire, nous avons transfecté l'ADNc de la Cx43 dans des cellules CHO que nous avons soumises à une simulation d'ischémie et des bloqueurs d'hémicanaux ont été utilisés pour confirmer leur ouverture spécifique. Les résultats ont montré une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire non spécifique à la présence d'hémicanaux. Par ailleurs, la conductance membranaire a été significativement augmentée par l'expression d'hémicanaux et réduite suite à l'application d'un inhibiteur. Ces résultats suggèrent l'implication des hémicanaux dans les dommages conséquents à l'ischémie cardiaque.
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Modélisation de la migration de cellules tumorales : évolution in vitro de sphéroïdes de cellules issues de glioblastomes

Aubert, Marine 23 June 2008 (has links) (PDF)
Le glioblastome est une tumeur cérébrale maligne particulièrement agressive et le pronostic vital des patients atteints par cette tumeur est très mauvais. La médiane de survie est de l'ordre de 12 mois même lorsqu'une stratégie thérapeutique a pu être mise en place. Un des facteurs qui pourrait expliquer la dificulté à traiter ces tumeurs par voie chirurgicale est l'invasion des cellules tumorales dans le tissu sain environnant. De plus, les mécanismes à l'origine de ce phénomène sont, en partie, méconnus. L'objectif que nous nous étions fixé pour mon travail de thèse était de s'intéresser à ces mécanismes d'invasion en étudiant la migration in vitro de cellules tumorales issues de glioblastomes. Pour cela, nous avons créé un modèle de migration microscopique, basé sur un automate cellulaire, reproduisant la migration de cellules tumorales sur deux substrats différents : substrat de collagène et monocouche d'astrocytes. Les cellules migrent selon des règles prédéfinies et dépendant des interactions (de contact ou à plus longue portée) introduites. La confrontation des simulations avec les expériences a permis de valider le modèle et de mettre en évidence deux phénomènes : une communication par contact entre cellules tumorales et entre cellules tumorales et astrocytes (cette dernière favoriserait l'invasion des cellules tumorales) et la sécrétion à partir de la masse tumorale d'une substance chimio-répulsive favorisant sur la migration des cellules. Afin de décrire l'évolution d'une masse tumorale plus réaliste, nous avons construit et validé un modèle macroscopique (équation de diffusion non linéaire) à partir de l'automate, en tenant compte des interactions entre cellules tumorales.
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Caractérisation morphologique, biochimique et physiologique des protéines de jonction lacunaire, les connexines 46 et 50, dans les cellules folliculo-stellaires TtT/GF de l’hypophyse antérieure

Garcia, Christopher 04 1900 (has links)
Les cellules folliculo-stéllaires (FS) de l'hypophyse antérieure possèdent une forme étoilée et étendent de longues projections cytoplasmiques qui forment des pseudo-follicules entourant les cellules endocrines. Les cellules FS sont connectées entre elles par des jonctions lacunaires (des fois aussi connu sous le nom de jonction communicante) formant ainsi un réseau tridimensionnel continu. Un des rôles principaux des cellules FS est le maintien du microenvironnement de l'hypophyse antérieure, une activité qui est en partie réalisée par la sécrétion de divers facteurs de croissance et de cytokines. Ces messagers chimiques, y compris le bFGF, le VEGF, l’IL-6 et l’IL-1 contrôlent de nombreux processus cellulaires tels que l’expression des gènes d’hormones. Notre intérêt est de déterminer si la communication entre les cellules FS contribue à leur activité régulatrice. Dans notre étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire TtT/GF qui partage de nombreuses caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques avec les cellules FS. Les jonctions lacunaires/communicantes sont formées par l’association de deux connexons de cellules adjacentes qui unissent le cytoplasme des cellules connectées et permet la diffusion de petites molécules. Chaque connexon est formé par l’oligomérisation de six protéines connexine (Cx) de la famille α, β ou γ. Les connexons, intégrés dans la membrane d’une vésicule du cytoplasme, se migrent vers la membrane cellulaire où ils s’incorporent dans la couche bilipidique. L’expression de la Cx43 (α) par les cellules FS est régulée en réponse à des facteurs de croissance et des cytokines. Des changements dans le microenvironnement de l'hypophyse antérieure causés par des molécules de signalisation sont susceptibles de modifier la Cx43, en particulier l’état de phosphorylation de la protéine. Ces modifications de la Cx43 peuvent ensuite déclencher des changements du comportement de jonctions lacunaires/communicantes formées par la Cx43, comme leur perméabilité et le renouvellement de la protéine Cx43. Les tissus expriment généralement plus d’un type de connexine. Jusqu’aujourd’hui, la Cx43 est la seule connexine à avoir été identifiée dans les cellules FS. Le cristallin exprime les connexines α: Cx43, Cx46 et Cx50. Leur expression est modulée par des facteurs de croissance. Notre hypothèse de travail a été de vérifier si la Cx46 et la Cx50 étaient exprimées par les cellules FS et si celles-ci contribuaient au rôle modulateur des cellules FS hypophysaires. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé la Cx46 et la Cx50 dans la lignée cellulaire TtT/GF. Nous avons identifié les produits de transcription de Cx46 et de Cx50 par la technique d’analyse northern blot (PCR). Par la suite, les protéines Cx46 et Cx50 ont été identifiées en utilisant des anticorps dans des analyses western blot. Par microscopie confocale, nous avons déterminé la co-localisation de la Cx46 avec certaines marqueurs d’organites : réseau trans-Golgien, endosomes précoces et lysosomes. La Cx50 co-localise avec des marqueurs du réticulum endoplasmique, du réseau cis-Golgien et des endosomes précoces. Un protocole d’isolation des membranes résistantes aux détergents non-ionique a révélé que la Cx46 et la Cx50 n’étaient pas associées à des radeaux lipidiques ni aux cavéoles. Cependant, la microscopie confocale a montré une co-localisation cytoplasmique de la Cx50 et de la flotilline-1. Nous avons poursuivi l’étude sur la localisation de la Cx46 dans le noyau en utilisant une technique d’isolation des fractions enrichies en noyau. Nous avons établi que plusieurs isoformes de la Cx46 sont exclusivement associées au noyau. De plus, avec la microscopie confocale nous avons démontrée une co-localisation de la Cx46 avec un marqueur du nucléole/corps de Cajal. Nous avons démontré un effet du bFGF sur l'expression temporelle de la Cx46 et de la Cx50. L’expression de la Cx46 diminue au cours de longues expositions au bFGF tandis que les niveaux de Cx50 augmentent de façon transitoire au cours du traitement. Dans une autre étude nous avons démontré des changements importants dans les niveaux de la Cx46 et de la Cx50 dans l’hypophyse antérieure des visons durant le cycle de reproduction annuel. Notre étude démontre que les cellules FS expriment la Cx46 et la Cx50. Nous avons aussi établi que la Cx46 et la Cx50 sont localisées dans différentes structures sous-cellulaires, ce qui suggère des rôles différents dans les cellules FS pour ces protéines de jonction lacunaire/communicante. Il est possible que la Cx46 et la Cx50 ne jouent pas un rôle majeur dans la communication intercellulaire dans les cellules FS quiescentes. Nos résultats suggèrent que la Cx46 et la Cx50 peuvent avoir d'autres fonctions : des isoformes de la Cx46 peuvent contribuer à la biogenèse des ribosomes tandis que la Cx50 pourrait avoir un rôle dans la communication dans les cellules stimulées au bFGF. Nos études établissent une base pour des recherches futures. / The folliculo-stellate (FS) cells of the anterior pituitary are star-shaped and extend long cytoplasmic processes forming pseudo-follicles encircling hormone-secreting cells. Dispersed throughout the anterior pituitary gland, FS cells are joined to form a continuous three dimensional network through communicating gap junctions. One of the primary roles of FS cells is the maintenance of the anterior pituitary microenvironment, accomplished through the expression and secretion of various growth factors and cytokines. These chemical messengers, including bFGF, VEGF, IL-6 and IL-1 mediate a range of cellular processes such as hormone gene expression. Our aim is to study whether intercellular communication among FS cells contributes to the modulatory activity of the FS cells within the anterior pituitary gland. To pursue this, we use the TtT/GF cell line that shares many morphological, physiological and biochemical characteristics with FS cells. Gap junctions are formed by the joining of two connexons/hemichanels from adjacent cells that link their cytoplasms allowing for the passive diffusion of small molecules. Connexons/hemichannels are themselves formed by the oligomerization of six connexin (Cx) proteins from the family α, β or γ, which then migrate into the lipid bilayer of the cell membrane. FS cells express Cx43 (α-connexin), which is regulated in response to growth factors and cytokines. Changes in the anterior pituitary microenvironment due to signaling molecules results in modifications to Cx43, particularly in the phosphorylation status of the protein. Such alterations yield alterations in the physiological behaviour of Cx43 gap junctions such as permeability and turnover. Tissues generally express more than one connexin type and to date, Cx43 has been the sole connexin to be identified in FS cells. The ocular lens expresses the α-connexins: Cx43, Cx46 and Cx50, which are modulated by growth factors that are also present in the anterior pituitary. Based on these facts, we hypothesize that Cx46 and Cx50 are also expressed by the FS cells and contribute to the FS modulatory role in the anterior pituitary gland. In the present study, we have identified and characterized Cx46 and Cx50 in the TtT/GF cell line. We identified Cx46 and Cx50 transcripts through northern blots and identified the corresponding protein products using antibodies and western blot analyses. Through confocal microscopy, we determined that Cx46 co-localized with the organelle markers: trans-Golgi, early endosomes and lysosomes. Cx50 co-localized with markers for the ER, cis-Golgi and early endosomes. An isolation procedure using a non-ionic detergent we showed that neither Cx46 nor Cx50 were associated to lipid rafts or caveolae. However, confocal microscopy showed a cytoplasmic co-localization between Cx50 and flotillin-1. We pursued a finding that localized Cx46 to the nucleus and using a nuclear isolation technique, demonstrated that several isoforms of Cx46 are exclusively located in the nuclear compartment. Furthermore, with confocal microscopy we found a co-localization of Cx46 with a nucleolus/coiled body marker. We demonstrated an effect of bFGF on the temporal expression patterns of Cx46 and Cx50 and showed that Cx46 levels decreased over longer exposures to the growth factor while Cx50 levels transiently increased. Lastly, drastic changes were noted in an in situ study of Cx46 and Cx50 in the male and female mink anterior pituitary during the annual reproductive cycle. Our study indicates that addition to Cx43, FS cells also express Cx46 and Cx50. We also demonstrated that Cx46 and Cx50 localize to different sub-cellular structures, suggesting different roles in the FS cells. While they may not play a major role in intercellular communication in quiescent FS cells, our results suggest that Cx46 and Cx50 may serve other functions: Cx46 isoforms may contribute to ribosome biogenesis and Cx50 may have communication-related responsibilities in stimulated cells. Importantly, our identification and characterization studies provide a foundation on which future studies can be built.
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Les astrocytes et la détection hypothalamique du glucose : rôle métabolique et implication des connexines astrocytaires

Allard, Camille 30 November 2012 (has links) (PDF)
L'hypothalamus est fortement impliqué dans la régulation nerveuse de l'homéostasie énergétique. Il existe dans cette structure des neurones spécialisés (gluco-sensibles) qui détectent notamment l'hyperglycémie puis déclenchent des réponses adaptées comme le maintien de la glycémie, en stimulant la sécrétion d'insuline ou encore le rassasiement. Les astrocytes sont suspectés de participer à la détection neuronale du glucose. Dans l'ensemble du cerveau, il existe un couplage métabolique entre astrocytes et neurones. Le lactate, issu de la métabolisation du glucose par les astrocytes, est transporté par les neurones par des transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). De plus, il a récemment été montré que les jonctions gap (GJ), à l'origine de la formation de réseaux au sein des astrocytes sont indispensables au passage du glucose de la circulation sanguine vers les neurones en activité. Ces GJ astrocytaires sont formées majoritairement de connexines 43 et 30 (Cxs).Mon travail de thèse s'est orienté suivant deux axes, qui ont visé à étudier le rôle des astrocytes dans la détection hypothalamique du glucose et du lactate. Dans un premier temps, nous avons montré que le lactate, comme le glucose, est détecté au niveau central et induit une sécrétion d'insuline. Dans un modèle de rat hyperglycémique pendant 48h (qui présente aussi une hyperlactatémie), nous avons montré que la détection du glucose et du lactate est altérée. Ces modifications ne sont pas dues à une variation de l'expression protéique des MCTs astrocytaires ou neuronale de l'hypothalamus.Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle des Cxs astrocytaires. La Cx43 est très exprimée autour des micro-vaisseaux sanguins de l'hypothalamus médio-basal (MBH), un site présentant de nombreux neurones gluco-sensibles. L'expression de la Cx30 est plus diffuse dans cette structure. Nous montrons également que l'expression protéique des Cxs astrocytaires varie très rapidement suite à des modifications du statut métabolique (jeûne, réalimentation, hyperglycémie). Afin d'évaluer l'implication de la Cx43 astrocytaire (majoritaire) dans la détection hypothalamique du glucose, nous avons inhibé son expression dans le MBH, in vivo, en injectant des siRNA permettant d'inhiber la synthèse de cette protéine. L'inhibition de la Cx43 (30% à 72h) induit une diminution de la prise alimentaire sans modification du poids, de la glycémie et de l'insulinémie comparée aux témoins. Suite à l'injection carotidienne de glucose (censée mimer une hyperglycémie), la sécrétion d'insuline est fortement inhibée chez les animaux siCx43. De même, l'effet satiétogène du glucose semble inhibé chez ces animaux lors de la réalimentation après un jeûne.Ces résultats montrent pour la première fois, de façon intégrée, l'importance des connexines, et probablement des réseaux astrocytaires, lors de la détection hypothalamique du glucose. Ces nouvelles données renforcent l'importance du rôle métabolique des astrocytes lors de fonctions neuronales précises

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