Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is an important process in embryonic development, tissue repair, inflammation, and cancer. During EMT, epithelial cells disassemble cell-cell adhesions, lose apicobasal polarity, and initiate migratory and invasive processes that allow individual cells to colonize distant sites. It is the means by which non-invasive tumors progress into malignant, metastatic carcinomas. In vitro, EMT occurs in two steps. First, cells spread out, increasing in surface area and pushing the colony borders out. Then cells contract, pulling away from neighboring cells and rupturing cell-cell junctions, resulting in individual highly migratory cells. Recent discoveries indicate that calcium signaling is central in EMT. Both previous data with patch clamping and new calcium imaging data show a series of calcium influxes in cells induced to undergo EMT with hepatocyte growth factor (HGF). It has also been shown that blocking calcium signaling prevents EMT from progressing normally. However, it is not known if calcium alone is sufficient to drive EMT behaviors. By experimentally triggering calcium influxes with an optigenetic cation channel, the behaviors that calcium influxes induce can be determined noninvasively, without use of drugs that may have secondary effects. The results of using the optigenetic set up along with live cell imaging are that cells become more motile and disrupt normal epithelial cell-cell adhesions. This behavior is believed to be due to increased cell contractility downstream of calcium signaling, and is dependent on Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII). When cells are pre-treated with CaMKII inhibitor before HGF addition, they undergo the spreading step of EMT without subsequent cellular contraction and rupture of cell-cell junctions. CaMKII is a protein kinase that is activated by binding Ca2+/calmodulin, and is a known downstream component of calcium signaling. CaMKII is known to affect the actin cytoskeleton by both physically bundling actin filaments to increase their rigidity, and through signaling by activation of myosin light chain kinase (MLCK), which has a role in stress fiber formation. Immunofluorescence did not show colocalization of CaMKII with actin, ruling out regulation through actin bundling. However, CaMKII does appear to have a role in stress fiber formation. EMT induced with HGF treatment results in increased numbers of stress fibers as well as trans-cellular actin network formation, both actin structures decorated with non-muscle myosin II (NMII). CaMKII inhibition not only blocks these actin formations, but it also decreases stress fiber levels below basal unstimulated levels in cells that have not been treated with HGF. This suggests that CaMKII has a role in regulating contractility through cellular actin networks, indicating a mechanism for calcium's role in cellular contractility in EMT.

Mon travail de thèse fut de développer différents projets en vue de mieux comprendre la dynamique et l'organisation des réseaux d'actine, ainsi que les mécanismes moléculaires à l'origine de la production de force grâce à différents systèmes reconstitués biomimétiques. Dans un premier temps, je me suis intéressée à l'étude de l'organisation spatiotemporelle des réseaux dynamiques d'actine et de ses protéines associées durant la propulsion de particules recouvertes de promoteurs de nucléation des filaments d'actine (Achard et al, Current Biology, 2010 et Reymann et al, accepté à MBoC). J'ai notamment suivi en temps réel l'incorporation de deux régulateurs de l'actine (Capping protein, protéine de coiffe et ADF/cofilin, protéine de fragmentation) et montré que leurs actions conjuguées assurent un contrôle biochimique de l'assemblage d'un réseau complexe d'actine, mais gouvernent également les propriétés mécaniques de ce réseau. Par ailleurs, afin de mieux caractériser les propriétés mécaniques de ces réseaux d'actine en expansion, j'ai développé un système biomimétique novateur utilisant la procédure de micropatrons ou "micropatterning" qui permet un contrôle spatial reproductible des sites de nucléation d'actine. Cela m'a permis de montrer comment des barrières géométriques, semblables à celles trouvées dans les cellules, peuvent influencer la formation dynamique de réseaux organisés d'actine et ainsi contrôler la localisation de la production de forces. (Reymann et al, Nature Materials, 2010). De plus, l'incorporation de moteurs moléculaires dans ce système versatile, nous a permis d'étudier la contraction induite par des myosines. En particulier, j'ai pu montrer que les myosines VI HMM interagissent de manière sélective avec différentes architectures d'actine (organisation parallèle ou antiparallèle, réseau enchevêtré), aboutissant à un processus en trois phases: tension, puis déformation des réseaux d'actine fortement couplée à un désassemblage massif des filaments. Aussi, ce phénomène de désassemblage massif induit par la myosine est intimement dépendant de l'architecture du réseau d'actine et pourrait, de ce fait, jouer un rôle essentiel dans la régulation spatiale des zones d'expansion et de contraction du cytosquelette in vivo.

Deux raisons majeures justifient la nécessité de développer de nouvelles techniques dinvestigation en cardiologie équine : premièrement, il ny a pas dévidence que lincidence des baisses de performance dorigine cardiaque chez le cheval soit en diminution et deuxièmement, aucune nouvelle technique dinvestigation cardiaque na été développée en cardiologie équine depuis lavènement de léchocardiographie Doppler entre la fin des années 80 et le début des années 90 (Reef et al., 1989, Reef 1991, Long et al., 1992). Léchocardiographie de stress est la seule technique qui permette le diagnostic dune dysfonction myocardique induite par lexercice. Or, ce problème, qui est caractérisé par un manque danomalies significatives lors de lexamen au repos, a été rapporté chez 5 à 8 % de chevaux examinés pour baisse de performance (Reef 1997, Martin et al., 2000). De plus, léchocardiographie de stress pourrait être utile pour lévaluation clinique du comportement des insuffisances valvulaires lors de lexercice, afin de préciser leur pronostic (Gehlen 2005b). Dans le cadre de la recherche, léchocardiographie de stress pourrait savérer constituer un outil utile pour lévaluation de la relation entre les maladies valvulaires et une éventuelle dysfonction ventriculaire. Léchocardiographie de stress réalisée post-exercice a déjà été décrite dans le contexte de linvestigation des dysfonctions myocardiques induites par lexercice chez le cheval. Malheureusement, léchocardiographie de stress post-exercice ne reproduit que partiellement les conditions présentes lors de lexercice (Durando et al., 2002). Un exercice maximal ou tout au moins proche du maximum est nécessaire pour induire des changements des paramètres échocardiographiques mesurables pendant la période suivant immédiatement larrêt de lexercice (Reef 1997). Cest une procédure techniquement exigeante qui doit se satisfaire dimages de mauvaise qualité en raison de la respiration intense après un exercice soutenu. De plus, la chute rapide de la fréquence cardiaque après exercice limite la sensibilité du test. Linduction pharmacologique du stress, comparable à celle utilisée en médecine humaine pour poser le diagnostic et évaluer le pronostic sur certains patients souffrant de pathologies coronariennes, a été décrite chez le cheval pour surmonter les limitations de léchocardiographie de stress post-exercice, mais le protocole de stimulation pharmacologique utilisé sest cependant avérée myocardiotoxique (Frye et al., 2003). Le but de nos études était de développer un protocole pharmacologique qui permette de réaliser une échocardiographie de stress dans lespèce équine, qui soit bien toléré et facile à réaliser, et qui induise des modifications qui miment lexercice de la manière la plus proche que possible. Dans la première étude, nous avons comparé dune haute dose conventionnelle de dobutamine par rapport à une faible dose de dobutamine chez des poneys prémédiqués avec de latropine. En préambule à cette étude, nous avons en effet suspecté que les effets secondaires et le manque daugmentation de la fréquence cardiaque en réponse à ladministration de dobutamine chez le cheval pourraient être dus à lactivation dun réflexe hypertenseur au niveau du nerf vague en réponse à ladministration de cette molécule. Ces effets pourraient donc être évités en prémédiquant les patients avec un agent vagolytique tel que latropine. Dans notre étude, des poneys prémédiqués avec de latropine ont été soumis à des doses de dobutamine 8 fois plus faibles que dans un groupe recevant la dose conventionnelle de dobutamine. La stimulation cardiaque, évaluée sur base du débit cardiaque mesuré par échocardiographie Doppler comme indicateur de performance cardiaque globale, était légèrement plus haute et les effets secondaires étaient moins communément observés dans le groupe prémédiqué à latropine. De plus, la réponse en fréquence cardiaque et volume déjection montrait moins de variabilité entre sujets dans le groupe prémédiqué à latropine que dans le groupe recevant la dobutamine à la dose conventionnelle. Cette étude a démontré que dans lespèce équine, le protocole datropine conjugué avec de faibles doses de dobutamine présente de nombreux avantages par rapport aux autres types déchocardiographie de stress. La deuxième étude avait pour but didentifier les paramètres échocardiographiques les plus utiles à mesurer durant une échocardiographie de stress chez le cheval. Six chevaux en bonne santé ont subi le protocole de stress pharmacologique décrit dans la première étude et à chaque stade de la stimulation pharmacologique, les paramètres des modes échocardiographiques bidimensionnel (mode-B) et temps-mouvement (mode-M) ont été mesurés. Les modifications échocardiographiques les plus importantes ont été induites au niveau des paramètres suivants du mode-M : le diamètre interne du ventricule gauche (LVID) en systole, lépaisseur de la paroi libre du ventricule gauche en systole et diastole, lépaisseur du septum interventriculaire en systole et diastole, et la fraction de raccourcissement. Les modifications dans les paramètres du mode-B, bien que moins prononcées, ont reflété les changements observés dans le mode-M. Cependant, les mesures en mode-M prenaient davantage de temps et montraient une plus grande variabilité due aux erreurs de mesure que celles réalisées en mode-B. De plus, les changements entre les doses successives de dobutamine utilisées dans notre protocole pharmacologique nétaient pas toujours significatifs. Dun point de vue pratique, labandon dune dose sur deux de dobutamine dans ce protocole aurait donc peu de répercussion sur les résultats et permettrait de réduire considérablement le temps du test. Sur base des deux premières études réalisées, le protocole de stimulation pharmacologique qui a été adopté pour les études suivantes consistait en une prémédication au moyen dun bolus de 35 µg/kg datropine par voie intra-veineuse (IV) suivie par une perfusion de dobutamine à des doses cumulatives de 2, 4, 6 et 8 µg/kg/minute. Le but de la troisième étude était de comparer les modifications échocardiographiques en réponse à ce protocole de stimulation pharmacologique avec celles obtenues après un exercice. Dans cette étude, 6 chevaux sains ont subi un exercice submaximal sur tapis roulant, et ont été comparés à 6 chevaux sains soumis au challenge de stimulation pharmacologique. Dans les 2 groupes, les paramètres échocardiographiques en mode-M ont été mesurés à une fréquence cardiaque au repos ainsi quà une fréquence cardiaque de 80, 100, 110, 120, 130 et 140 battements par minute. La difficulté majeure rencontrée dans le groupe soumis à lexercice sur tapis roulant était la chute rapide de la fréquence cardiaque après arrêt de lexercice, tel que rapporté précédemment dans la littérature, ce qui empêché lobtention denregistrements échocardiographiques à des hautes fréquences cardiaques chez certains chevaux. De plus, chez certains de ces chevaux, la qualité des images était limitée à cause des mouvements de lanimal et sa respiration. Les paramètres échocardiographiques du mode-M nétaient pas significativement différents entre les deux groupes investigués, à lexception du diamètre interne du ventricule gauche en systole à 100, 110 et 120 bpm, diamètre qui était plus petit dans le groupe stimulé pharmacologiquement que dans le groupe stimulé par exercice. En outre, dans le groupe exercice, la plupart des modifications significatives des paramètres échocardiograpiques ne se manifestaient quà des fréquences cardiaques de 130 et 140/minute. Ces résultats confirment que pour quune échocardiographie de stress mette en évidence des anomalies induites par lexercice, lintensité de leffort réalisé au cours du test doit être très importante et les images échocardiographiques doivent être obtenues très rapidement après larrêt de leffort. La sensibilité du test lors déchocardiographie de stress post-exercice reste dès lors discutable. Les 3 premières études réalisées dans le cadre de ce travail ont montré que le protocole de stimulation pharmacologique consistant en une prémédication à latropine suivie de faibles doses de dobutamine est bien toléré chez le cheval sain et que les modifications des paramètres échocardiographiques en mode-M, à lexception du diamètre interne du ventricule gauche en systole, sont similaires à celles observées suite à un effort submaximal sur tapis roulant. La différence observée entre les deux types de stimulation pourrait être expliquée par une post-charge plus basse lors de la stimulation pharmacologique quen réponse à un exercice. Cependant, lévaluation des conditions de charge du cur nécessite la mesure de paramètres précis. La pré-charge et la post-charge cardiaque, de concert avec la fréquence cardiaque et la contractilité du myocarde, constituent des déterminants majeurs des performances cardiaques. La réponse de la fréquence cardiaque à un protocole de stimulation atropine/faible dose de dobutamine a été étudiée en profondeur dans la première étude. Lobjectif de la quatrième étude était dévaluer la réponse des trois autres composants de la performance cardiaque, à savoir la pré-charge, la post-charge et la contractilité, au test de stress pharmacologique mis au point dans les 3 premières études du travail. Dans cette étude, 6 chevaux adultes sains ont été soumis au test de stimulation pharmacologique mis au point dans les études précédentes. La période de pré-éjection a diminué avec laugmentation de la stimulation pharmacologique, mais na pas été modifiée par ladministration datropine ce qui confirme les études réalisées chez lhomme et le chien, chez qui ni le pacing ni laugmentation de la fréquence cardiaque induite par latropine nont altéré ce paramètre (Hassan and Turner 1983, Pipers et al., 1978, Harris et al 1967). Par contre, dans notre étude le temps déjection a montré une corrélation négative avec la fréquence. Ces résultats confirment létude de Lightowler et al (2003), qui a montré une forte corrélation négative entre le temps déjection et la fréquence cardiaque dans lespèce équine. De nombreuses études ont proposé lutilisation du rapport période de pré-éjection/temps déjection comme paramètre de mesure de la fonction systolique indépendant des conditions de charge chez lhomme (Weissler et al., 1968, Cokkinos et al 1976). Dautres études ont cependant démontré une corrélation significative entre ce paramètre et la fréquence cardiaque (Pipers et al, 1978; Spodick et al 1984). Dans notre étude, le rapport période de pré-éjection/temps déjection na pas été modifié durant la stimulation pharmacologique, ce qui est probablement dû à laddition de différents facteurs opposés. En général, une augmentation de la pré-charge associée à une réduction de la post-charge induit des changements des temps dintervalles systoliques suggérant une augmentation du travail myocardique, et inclut une réduction de la période de pré-éjection et du rapport période de pré-éjection/temps déjection (Hassan and Turner, 1983, Weissler 1977, Lewis et al 1977). A linverse, une réduction de la pré-charge associée à une augmentation de la post-charge induit des changements des temps dintervalles systoliques suggérant une diminution du travail myocardique et inclut une augmentation de la période de pré-éjection et du rapport période de pré-éjection/temps déjection et une réduction du temps déjection (Hassan and Turner, 1983, Weissler 1977, Lewis et al 1977). Les effets de la post-charge et des agents inotropes sont plus complexes car une augmentation ou une diminution de la post-charge prolonge le temps déjection alors que les inotropes positif et négatifs induisent une diminution de ce paramètre (Atkins and Snyder 1992). La vitesse de raccourcissement des fibres circonférentielles est considérée comme une mesure indépendante de la pré-charge de la contractilité, mais est affectée par la post-charge (Atkins and Snyder 1992). Pour surmonter linfluence de la fréquence cardiaque sur ce paramètre, une formule corrigeant ce paramètre pour la fréquence cardiaque (Colan et al 1984) a été utilisée dans notre étude. Tant avec ou sans correction pour la fréquence cardiaque, la vitesse de raccourcissement des fibres circonférentielles a augmenté significativement avec la stimulation à la dobutamine. Une constatation similaire a été observée chez des chiens (Lang et al 1986) et chez lhomme (Colan et al 1984), et démontre leffet inotrope positif de la dobutamine. Dans le cadre clinique, la résistance vasculaire systémique est communément utilisée comme paramètre dévaluation de la post-charge ventriculaire. Elle est estimée sur base de la différence entre la pression artérielle systémique moyenne et la pression auriculaire gauche moyenne, multipliée par un facteur de conversion de 80 dyne * cm-2/mmHg, et divisée par le débit cardiaque. Cette formule a été validée par angiographie (Grossmann and McLaurin 1980). Klabunde (2004) a suggéré que dans les conditions cliniques, la pression auriculaire gauche peut être négligée dans cette formule, ce qui facilite la mesure de la résistance vasculaire systémique en pratique. Au cours dun exercice sub-maximal chez le cheval, il a été démontré que par rapport au repos, le débit cardiaque augmente approximativement 4 fois (Thomas et al.,, 1983), alors que la pression artérielle systémique augmente dun facteur 1.7 (Hornicke et al, 1977). Théoriquement, cela devrait être associé à une chute de 68% de la résistance vasculaire systémique. La dobutamine est connue pour réduire la résistance vasculaire systémique dans plusieurs espèces animales et chez lhomme (Leier et al 1977). Dans notre étude, la dobutamine a effectivement réduit ce paramètre dune valeur de 324 à une valeur de 137 dyne * s/cm5, soit une chute de 58 %, ce qui représente les changements du même ordre que ceux observés lors dun exercice sub-maximal dans cette espèce et suggère une chute de la post-charge du ventricule gauche. Cependant, la résistance vasculaire systémique ne reflète pas exactement la post-charge du ventricule gauche puisquelle ne tient compte que du tonus vasomoteur périphérique (Lang et al 1986). La post-charge ventriculaire est en effet définie comme la force sopposant au raccourcissement de la fibre ventriculaire durant la phase déjection (Weber et al., 1982, Nichols and Pepine 1982). Cette force nest que très grossièrement évaluée sur base de la pression artérielle périphérique, du tonus vasomoteur périphérique, ou de la résistance vasculaire systémique, et doit plutôt être évaluée sur base du stress éprouvé par la paroi ventriculaire durant léjection. Ce stress fait intervenir à la fois des facteurs internes et des facteurs externes au myocarde. Selon le principe de La Place, le stress de la paroi ventriculaire est directement proportionnel à la dimension et à la pression et inversement proportionnel à lépaisseur de la paroi (Gould et al., 1974, Weber and Janicki 1980, Grossmann et al., 1975). Dans notre étude, le stress de la paroi, estimé sur base de la formule : WS = MAP * (LVIDs / LVFWs * ( 1+ LVFWs/LVIDs)) 0.34, ou MAP est la pression systémique moyenne, LVIDs est le diameter interne du ventricule gauche en fin de systole, LVFWs est lépaisseur de la paroi libre du ventricule gauche, et 0.34 est en facteur de conversion pour transfomer mmHg en g/cm² (Lang et al., 1986), na pas changé significativement durant la stimulation pharmacologique, ce qui pourrait être dû à la somme des effets de la diminution de la dimension du ventricule gauche et de laugmentation de la pression artérielle systémique moyenne et de lépaisseur de la paroi libre du ventricule gauche. En conclusion, cette quatrième étude de notre travail a démontré que les intervalles de temps systoliques et la vitesse de raccourcissement des fibres circonférentielles (corrigée ou non pour la fréquence cardiaque) ont changé significativement en réponse au protocole de stimulation pharmacologique, ce qui suggère une modification de la performance ventriculaire chez les chevaux subissant un test de stress à la dobutamine. La post-charge ventriculaire gauche diminue significativement en réponse au test de stimulation pharmacologique lorsquelle est évaluée sur base de la résistance vasculaire systémique, alors quelle diminue seulement légèrement en réponse à ce test lorsquelle est évaluée sur base dune mesure du stress de la paroi ventriculaire gauche. La mesure combinée du débit cardiaque et de la pression artérielle systémique au repos et au cours dun test de stimulation cardiaque maximale, tel que réalisé dans nos précédentes études, permet la mesure dun paramètre appelé la capacité de pompe cardiaque (Tan 1987, Tan et al., 1989). En médecine humaine, ce paramètre a été démontré comme constituant un paramètre fiable destimation du pronostic chez des patients souffrant dinsuffisance cardiaque chronique (Tan 1987, Tan et al., 1989, Williams et al., 2001, Cotter et al., 2003, Fincke et al., 2004, Williams et al., 2005, Garcia-Gonzales et al., 2006, Hodges et al., 2006, Bromeley et al., 2006). Ce paramètre na par contre jamais été validé et testé en cardiologie équine. Lobjectif de la dernière étude de notre travail était de tester la faisabilité de la mesure de la capacité de réserve cardiaque chez le cheval sain sur base du test de stimulation pharmacologique développé dans nos 4 premières études. Pour cette étude, la capacité de pompe cardiaque a été évaluée à la fois par échocardiographie Doppler et par thermodilution chez 6 chevaux adultes sains. Les résultats obtenus ont permis de constater que le protocole de stimulation pharmacologique développé permet la mesure de la capacité de pompe cardiaque chez le cheval adulte sain. La valeur de ce paramètre savère être du même ordre de grandeur par kilo de poids vif que celle obtenue chez lhomme. Cependant, les résultats obtenus par thermodilution différaient de ceux obtenus par échocardiographie doppler à des hauts niveaux de stimulation cardiaque. Des études complémentaires devraient dès lors être réalisées pour vérifier la validité de techniques dévaluation non invasives (échocardiographie doppler et mesure de la pression artérielle par oscillométrie) pour la mesure de la capacité de pompe cardiaque chez le cheval. Lensemble de nos études a donc permis de mettre au point un protocole de stimulation cardiaque pharmacologique qui permet une évaluation qualitative et quantitative de la fonction myocardique lors dune stimulation chez le cheval adulte sain. A lavenir, ce protocole dévaluation de la fonction myocardique sous stimulation devrait être appliqué chez des chevaux montrant une intolérance à leffort inexpliquée ou souffrant de différentes pathologies cardiaques afin de valider son utilité en tant quoutil de diagnostic et de pronostic en médecine équine.

The lymphatic system is an extensive vascular network responsible for the transport of fluid, immune cells, proteins and lipids. It is composed of thin-walled vessels, valves, nodes and ducts, which work together to collect fluid, approximately 4 L/day, from the interstitium transporting it back to the systemic network via the great veins. The failure to transport lymph fluid results in a number of disorders and diseases. Lymphedema, for example, is a pathology characterized by the retention of fluid in limbs creating extreme discomfort, reduced mobility and impaired immunity. In general, there are two types of edema: primary edema, being those cases that are inherited (i.e. genetic predisposition), and secondary edema, which develop post-trauma or injury of the lymphatic vessels. With the onset of breast cancer and radiation therapies, the prevalence of secondary edema is on the rise. Clinical studies have shown that up to 80% of women who undergo nodal-dissection surgery develop lymphedema in their arms within 3-5 years of the surgery. Unfortunately, there is no cure or remedy for lymphedema stemming from our lack of understanding of the lymphatic system. The goal of this study was to evaluate lymph flow both experimentally and analytically to better understand the mechanisms regulating lymph transport. In particular we investigated the effects of pressure, volume loads and valve resistance on lymphatic function in the rat mesentery. Our experimental results were then used to develop computational and constitutive models to emulate the dynamic behavior of lymph transport. Collectively, the data illustrate the mechanics of lymphatic contractility and lymph flow. In particular, lymph flow and pumping significantly increased post edemagenic stress in the rat model. Furthermore, lymphangions exhibited highly nonlinear pressure-diameter responses at low pressures between 3-5 cmH2O. These experimental results strongly suggest the regulation of lymph flow via changes in pressure, shear stress and vessel diameter. Furthermore, the computational and constitutive models from this study provide great insight into lymphatic function characterizing the mechanical properties of a single pumping unit (i.e. lymphangion). These models will serve as valuable tools to further lymphatic research.

The fabrication of biomimetic heart muscle suitable for pharmaceutical compound evaluation and disease modeling is hindered by limitations in our understanding of how to guide and assess the maturity of engineered myocardium in vitro. We hypothesized that tissue architecture serves as an important cue for directing the maturation of engineered heart tissues and that reliable assessment of maturity could be performed using a multi-parametric rubric utilizing cardiomyocytes of known developmental state as a basis for comparison. Physical micro-environmental cues are recognized to play a fundamental role in normal heart development, therefore we used micro-patterned extracellular matrix to direct isolated cardiac myocytes to self-assemble into anisotropic sheets reminiscent of the architecture observed in the laminar musculature of the heart. Comparison of global sarcomere alignment, gene expression, and contractile stress in engineered anisotropic myocardium to isotropic monolayers, as well as, adult ventricular tissue revealed that anisotropic engineered myocardium more closely matched the characteristics of adult ventricular tissue, than isotropic cultures of randomly organized cardiomyocytes. These findings support the notion that tissue architecture is an important cue for building mature engineered myocardium. Next, we sought to develop a quality assessment strategy that utilizes a core set of 64 experimental measurements representative of 4 major categories (i.e. gene expression, myofibril structure, electrical activity, and contractility) to provide a numeric score of how closely stem cell-derived cardiac myocytes match the physiological characteristics of mature, post-natal cardiomyocytes. The efficacy of this rubric was assessed by comparing anisotropic engineered tissues fabricated from commercially-available murine ES- (mES) and iPS- (miPS) derived myocytes against neonatal mouse ventricular myocytes. The quality index scores calculated for these cells revealed that the miPS-derived myocytes more closely resembled the neonate ventricular myocytes than the mES-derived myocytes. Taken together, the results of these studies provide valuable insight into the fabrication and validation of engineered myocardium that faithfully recapitulate the characteristics of mature ventricular myocardium found in vivo. These engineered tissue design and quality validation strategies may prove useful in developing heart muscle analogs from human stem cell-derived myocytes that more accurately predict patient response than currently used animal models. / Engineering and Applied Sciences

Background: Loading conditions are recognized to influence ventricular function according to the Starling relationship for length/stretch and force.  Many modern echocardiographic parameters which have been announced as describing ventricular function and contractile status, may be confounded by uncontrolled and unmeasured load.  These studies aimed to measure the relation between four differ­ent types of assessments of ventricular dysfunction and degrees of load.  Study examined the ‘myo­cardial performance index’ (MPI).  Study II examined long axis segmental mechanical dyssynchrony.  Study III examined tissue velocities, and Study IV examined ventricular twist.  All studies aimed to describe the relation of these parameters both to load and to inotropic changes. Methods:  In anesthetized juvenile pigs, left ventricular (LV) pressure and volume were measured continuously and their relationship (LVPVR) was analysed.  Preload alterations were brought about by inflation of a balloon tipped catheter in the inferior vena cava (IVCBO).  Inotropic interventions were brought about by either an overdose of anesthetic (combine intravenous pentobarbital and inhaled isoflurane, Study I), or beta blocker and calcium channel blocker given in combination (Stud­ies III and IV).  In one study (II), global myocardial injury and dysfunction was induced by endotoxin infusion.  MPI measurements were derived from LVPVR heart cycle intervals for isovolumic contrac­tion and relaxation as well as ejection time.  Long axis segmental dyssynchrony was derived by ana­lyzing for internal flow and time with segmental dyssynchronous segment volume change during systole, hourly before and during 3 hours of endotoxin infusion.  Myocardial tissue velocities were measured during IVCBO at control, during positive and then later negative inotropic interventions.  The same for apical and base circumferential rotational velocities by speckle tracking.  Load markers (including end-diastolic volume) were identified for each beat, and the test parameters were analysed together with load for a relation.  The test parameters were also tested during single apneic beats for a relation to inotropic interventions. Results: MPI demonstrated a strong and linear relationship to both preload and after-load, and this was due to changes in ejection time, and not the isovolumic intervals.  Long axis segmental dyssyn­chrony increased during each hour of endotoxin infusion and global myocardial injury.  This dysyn­chrony parameter was independent of load when tested by IVCBO. Peak systolic velocities were strongly load-independent, though not in all the inotropic situations and by all measurement axes.  Peak systolic strain was load-dependent, and not strongly related to inotropic conditions.  Peak sys­tolic LV twist and untwist were strongly load-dependent. Conclusions: MPI is strongly load-dependent, and can vary widely in value for the same contractile status if the load is varied.  Mechanical dyssynchrony measures are load-independen in health and also in early global endotoxin myocardial injury and dysfunction.  Peak sytole velocities are a clinically robust parameter of LV regional and global performance under changing load, though peak systolic strain seems to be load-dependent.  Left ventricular twist and untwist are load-dependent in this pig model.

INTRODUÇÃO: O carcinoma espinocelular de origem bucal (CEC) apresenta uma alta taxa de mortalidade devido à invasividade das células tumorais. A migração celular, principal evento da invasão e metástase, pode ser regulada tanto por fatores intrínsecos, como adesão e contratilidade celular, quanto extrínsecos, como composição, densidade e remodelagem da matriz extracelular (MEC). OBJETIVO: Avaliar o papel de elementos intrínsecos e extrínsecos sobre o processo invasivo do carcinoma espinocelular de origem bucal. MÉTODOS: Foi realizada imuno-histoquímica para as proteínas: Miosina II (isoformas A, B e C), metaloproteinases de matriz (1, 2, 9 e 14); imunofluorescência as proteínas: e-caderina, n-caderina, FAK, paxilina, vinculina e fibronectina em amostras de CEC oral. Foi realizado ensaio de migração nas seguintes condições: 1 – matriz 2D com o substrato de fibronectina, ou laminina ou matrigel; 2 – matriz 3D com colágeno na presença ou não de fibronectina ou laminina; 3 – matriz 3D com diferentes concentrações de colágeno (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) + fibronectina na presença ou não de um inibidor de MMP. Foi realizado análise de adesão celular utilizando-se o microscópio TIRF e o microscópio confocal, tanto em matrizes 2D quanto 3D. Foram realizados esferoides celulares para avaliar a contratilidade celular, através do plaqueamento das células em gel de agarose e a utilização de drogas que inibem ou que induzem a contratilidade, bem como a partir de células transfectadas com versões fosfomiméticas para a cadeia leve de miosina. Foi realizado ainda western blotting para proteínas: e-caderina, FAK, vinculina, paxilina, N-caderina, integrinas e as isoformas de miosina II, bem como foi avaliado os níveis de ativação das proteínas da família RhoGTPase, as quais estão envolvidas no controle da migração celular. RESULTADOS: A expressão das MMPs analisadas e das isoformas de miosinas foi maior nas zonas de invasão tumoral, sendo que o CEC oral também apresenta uma maior expressão de proteínas associadas à adesão com a MEC. A migração celular foi afetada pela densidade e a composição da MEC, bem como pela atividade das MMPs. Adicionalmente, a modulação das proteínas de adesão célula-matriz altera a velocidade de migração, a direcionalidade dessa migração e também a forma de migração, mudando de uma migração coletiva para uma migração individual. O aumento na contratilidade células resulta numa dispersão celular enquanto que a diminuição da contratilidade resulta numa melhor adesão célula – célula. CONCLUSÕES: O comportamento das células tumorais pode ser modulado através de fatores extrínsecos como, por exemplo, a alteração no microambiente tumoral, seja ela por mudança no substrato ou na densidade da matriz, e também dos fatores intrínsecos como a alteração nos níveis de miosina. / INTRODUCTION: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) presents high mortality index due to the invasive phenotype of tumor cells. Cell migration is the main event in cell invasion and metastasis and it can be regulated by intrinsic factor, such as adhesion and cell contractility, and extrinsic factors, such as density and extracellular matrix (EMC) remodeling. OBJECTIVE: Analyze the role of intrinsic and extrinsic factor during the invasive process of oral squamous cell carcinoma. METHODS: We performed immunostaining in OSCC samples for the following proteins: myosin II (isoforms A, B and C), matrix metalloproteinase (1, 2, 9 and 14) e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and fibronectin. We also performed migration assays with OSCC cell line in the following conditions 1 – 2D matrix with fibronectin or laminin or matrigel; 2 – 3D matrix with collagen in the presence or not of fibronectin or laminin; 3 – 3D matrix with different collagen concentration (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) with fibronectin in the presence or not of the MMP inhibitor. In order to analyze cell adhesion, it was performed Total Internal Reflectance Fluorescence and Confocal microscopy, in 2D and 3D matrix. To analyze cell contractility, cells were plated in agarose gel in order to produce spheroids, which were treated with drugs that inhibit or induce cell contractility or cells were previously transfected with Myosin Light Chain phosphomimetics mutants. It was also performed western blotting to: e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and myosin II isoforms, as well as it was analyze the levels in RhoGTPase family, which are involved in cell migration control. RESULTS: The expression to MMPs and myosin II isoforms were higher at invasion zone of the tumor, and the OSCC presented higher expression of proteins associated to adhesion to ECM. Cell migration was affected by the EMC composition and density and by MMP activity. Also, the modulation of cell-matrix adhesion proteins altered migration speed, cell directionality as well as influenced the switch between collective and single cell migration. The increase in cell contractility resulted in cell dispersion while the decrease in cell contractility resulted in a better cell-cell adhesion. CONCLUSIONS: The behavior of cell tumor can be modulate by extrinsic factors, for example, the change in tumor microenvironment, by the change in the EMC substrate or density and by intrinsic factors such as the alteration in myosin levels.

Congenital heart defects are the number one cause of birth defect-related deaths. Cardiovascular diseases are the most common cause of death worldwide. Layered cellular sheet constructs offer one very valuable option for cardiac patch implantation during surgical treatment of both pediatric and adult patients with cardiac defects or damage. A very exciting, relatively unexplored, autologous, available cell source for making patches are placenta-derived mesenchymal stem cells (pMSCs). In this study, pMSCs were assessed as a potential cell source for cardiac repair and regeneration by evaluating their differentiation capacity into cardiomyocytes, their effects on cardiac cell migration and proliferation, and their ability to be grown into cell sheets. It was found that pMSC cardiac protein content was enhanced by differentiation media treatment, but no beating cells were produced. Undifferentiated pMSCs improved migration and proliferation of a cardiac cell population and formed intact, aligned cell sheets. However, like many new cell sources for cardiac repair, pMSCs should still be functionally characterized to understand how compatible they will be with resident heart tissue. Implanting non-autologous, potentially pluripotent, non-myocyte (non-beating) cells presents concerns regarding electromechanical mismatch and implant rejection. The characterization of non-traditional cell sources such as pMSCs motivated the design of a bio-MEMS device that assesses contractile force and conduction velocity in response to electrical and mechanical stimulation of a cell source as it is grown and once it forms a cellular sheet. This ideally creates the ability for patient specific cell sheets to be cultured, characterized, and conditioned to be compatible with the patient’s cardiac environment in vitro, prior to implantation. In this work, the device was designed to achieve the following: cellular alignment, electrical stimulation, mechanical stimulation, conduction velocity readout, contraction force readout, and upon characterization, cell sheet release. The platform is based on a set of comb electrical contacts which are three dimensional wall contacts made of polydimethylsiloxane and coated with electrically conductive metals. Device fabrication and initial validation experiments were completed as part of this study; ultimately the device will allow for the complete functional characterization and conditioning of variable cell source cell sheet implants for myocardial implantation. / 2019-07-02T00:00:00Z

INTRODUÇÃO: O carcinoma espinocelular de origem bucal (CEC) apresenta uma alta taxa de mortalidade devido à invasividade das células tumorais. A migração celular, principal evento da invasão e metástase, pode ser regulada tanto por fatores intrínsecos, como adesão e contratilidade celular, quanto extrínsecos, como composição, densidade e remodelagem da matriz extracelular (MEC). OBJETIVO: Avaliar o papel de elementos intrínsecos e extrínsecos sobre o processo invasivo do carcinoma espinocelular de origem bucal. MÉTODOS: Foi realizada imuno-histoquímica para as proteínas: Miosina II (isoformas A, B e C), metaloproteinases de matriz (1, 2, 9 e 14); imunofluorescência as proteínas: e-caderina, n-caderina, FAK, paxilina, vinculina e fibronectina em amostras de CEC oral. Foi realizado ensaio de migração nas seguintes condições: 1 – matriz 2D com o substrato de fibronectina, ou laminina ou matrigel; 2 – matriz 3D com colágeno na presença ou não de fibronectina ou laminina; 3 – matriz 3D com diferentes concentrações de colágeno (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) + fibronectina na presença ou não de um inibidor de MMP. Foi realizado análise de adesão celular utilizando-se o microscópio TIRF e o microscópio confocal, tanto em matrizes 2D quanto 3D. Foram realizados esferoides celulares para avaliar a contratilidade celular, através do plaqueamento das células em gel de agarose e a utilização de drogas que inibem ou que induzem a contratilidade, bem como a partir de células transfectadas com versões fosfomiméticas para a cadeia leve de miosina. Foi realizado ainda western blotting para proteínas: e-caderina, FAK, vinculina, paxilina, N-caderina, integrinas e as isoformas de miosina II, bem como foi avaliado os níveis de ativação das proteínas da família RhoGTPase, as quais estão envolvidas no controle da migração celular. RESULTADOS: A expressão das MMPs analisadas e das isoformas de miosinas foi maior nas zonas de invasão tumoral, sendo que o CEC oral também apresenta uma maior expressão de proteínas associadas à adesão com a MEC. A migração celular foi afetada pela densidade e a composição da MEC, bem como pela atividade das MMPs. Adicionalmente, a modulação das proteínas de adesão célula-matriz altera a velocidade de migração, a direcionalidade dessa migração e também a forma de migração, mudando de uma migração coletiva para uma migração individual. O aumento na contratilidade células resulta numa dispersão celular enquanto que a diminuição da contratilidade resulta numa melhor adesão célula – célula. CONCLUSÕES: O comportamento das células tumorais pode ser modulado através de fatores extrínsecos como, por exemplo, a alteração no microambiente tumoral, seja ela por mudança no substrato ou na densidade da matriz, e também dos fatores intrínsecos como a alteração nos níveis de miosina. / INTRODUCTION: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) presents high mortality index due to the invasive phenotype of tumor cells. Cell migration is the main event in cell invasion and metastasis and it can be regulated by intrinsic factor, such as adhesion and cell contractility, and extrinsic factors, such as density and extracellular matrix (EMC) remodeling. OBJECTIVE: Analyze the role of intrinsic and extrinsic factor during the invasive process of oral squamous cell carcinoma. METHODS: We performed immunostaining in OSCC samples for the following proteins: myosin II (isoforms A, B and C), matrix metalloproteinase (1, 2, 9 and 14) e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and fibronectin. We also performed migration assays with OSCC cell line in the following conditions 1 – 2D matrix with fibronectin or laminin or matrigel; 2 – 3D matrix with collagen in the presence or not of fibronectin or laminin; 3 – 3D matrix with different collagen concentration (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) with fibronectin in the presence or not of the MMP inhibitor. In order to analyze cell adhesion, it was performed Total Internal Reflectance Fluorescence and Confocal microscopy, in 2D and 3D matrix. To analyze cell contractility, cells were plated in agarose gel in order to produce spheroids, which were treated with drugs that inhibit or induce cell contractility or cells were previously transfected with Myosin Light Chain phosphomimetics mutants. It was also performed western blotting to: e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and myosin II isoforms, as well as it was analyze the levels in RhoGTPase family, which are involved in cell migration control. RESULTS: The expression to MMPs and myosin II isoforms were higher at invasion zone of the tumor, and the OSCC presented higher expression of proteins associated to adhesion to ECM. Cell migration was affected by the EMC composition and density and by MMP activity. Also, the modulation of cell-matrix adhesion proteins altered migration speed, cell directionality as well as influenced the switch between collective and single cell migration. The increase in cell contractility resulted in cell dispersion while the decrease in cell contractility resulted in a better cell-cell adhesion. CONCLUSIONS: The behavior of cell tumor can be modulate by extrinsic factors, for example, the change in tumor microenvironment, by the change in the EMC substrate or density and by intrinsic factors such as the alteration in myosin levels.

O infarto do miocárdio (IM) é uma patologia causada pela obstrução parcial ou total das artérias coronárias responsáveis pela irrigação do miocárdio. Sabe-se que logo após o IM, o treinamento físico (TF) promove melhora e adaptações benéficas ao sistema cardiovascular. O objetivo do presente estudo foi traçar o perfil de microRNAs na área remanescente ao IM de ratos submetidos ou não ao TF através da técnica de microarray, selecionar e confirmar a expressão de um microRNA específico, por programas de bioinformática que tenha alvos que possam estar envolvidos com a melhora da função cardíaca com o TF. Também foi objetivo deste estudo, verificar a expressão do microRNA-1, do microRNA-29 e do microRNA-214 e dos respectivos alvos destes microRNAs, como o colágeno, NCX e SERCA2a. Para isso, ratos Wistar foram divididos em quatro grupos: SEDENTÁRIO SHAM (SED-SHAM), SEDENTÁRIO INFARTADO (SED-IM), TREINADO SHAM (TR-SHAM) e TREINADO INFARTADO (TR-IM). A função ventricular foi acompanhada com ecocardiografia antes e após oito semanas do protocolo de TF de natação. Os animais foram sacrificados, o RNA foi extraído e posteriormente foi traçado o perfil de microRNAs. Para seleção dos microRNAs foram estipulados dois padrões de expressão entre os grupos. De acordo com os critérios aplicados foram observados, apenas 6 microRNAs para o primeiro padrão de expressão e 3 microRNAs para o segundo padrão de expressão que satisfizeram todos os critérios. O microRNA-339-5p foi escolhido por apresentar expressão diferencial pronunciada como efeito do TF por ter dois genes (alvos selecionados por programas de bioinformática TargetScan, Miranda e PicTar), o Myo1c e o PGC-1 ?, que estão envolvidos com a regulação da função cardíaca. Neste estudo, foi possível verificar que nos grupos TR-SHAM e TR-IM ocorreu aumento da expressão da Myo1c e redução da expressão do microRNA-339-5p. Nossos resultados também mostraram que o TF induziu aumento na expressão dos microRNAs-29a/c, o que está relacionado com significativa diminuição na expressão gênica do COLIAI, COLIIIAI, diminuição na concentração de hidroxiprolina e fração volumétrica de colágeno de ratos com IM. Outro resultado deste estudo é que o TF induziu diminuição na expressão dos microRNAs-1 e 214, o que está relacionado com aumento na expressão protéica dos alvos SERCA-2a e NCX de ratos com IM. Esses efeitos estão associados com a melhora da função ventricular avaliada pela FEAT% (função sistólica) e pela relação E/A (função diastólica), realizado por avaliação ecocardiográfica após o período de TF. / Myocardial infarction (MI) is a disease caused by partial or total blockage of the myocardial coronary arteries. It is known that after MI, physical training (PT) improves and promotes beneficial adaptations to the cardiovascular system. The aim of this study was to analyse the microRNAs profile in the remaining area to MI in rats submitted to PT by microarray and select a specific microRNA by bioinformatics software that has targets involved with the improvement of cardiac function by PT. Also, the aim of this study was to verify the expression of the microRNA-1, microRNA-29 and microRNA-214 and its targets, such as collagen, NCX and SERCA2a. For this, rats were divided into four groups: SEDENTARY SHAM (SHAM - SED), INFARCTED SEDENTARY (SED-MI), TRAINED SHAM (TR-SHAM) and INFARCTED TRAINED (TR-IM). Ventricular function was monitored with echocardiography before and after eight weeks of the PT. The animals were sacrificed, the RNA was extracted and traced the profile of microRNAs. For selection of microRNAs were stipulated two patterns of expression between the groups. The first standard, 6 microRNAs were selected and in the second standard, 3 microRNAs were selected to satisfy all criteria. The microRNA- 339-5p was chosen because of pronounced differential expression with PT and have two target genes selected by bioinformatics programs (TargetScan, Miranda and PicTar) Myo1c and the PGC-1 ? are involved in the regulation of cardiac function. In this study, we found that the SHAM group and the group with MI undergoing PT increased expression of Myo1c in contrast to a decreased expression of microRNA-339- 5p. Our results also showed that PT induced increased expression of microRNA-29a/c, which is associated with a significant decrease in gene expression of COLIAI, COLIIIAI, the hydroxyproline xvii concentration and collagen volume fraction of rats with MI. Another result of this study is that the PT induced decrease in the expression of microRNA-1 and microRNA-214, which is related to the increase in protein expression of the targets SERCA-2a and NCX of rats with MI. These effects are associated with improved ventricular function assessed by FEAT % (systolic function) and E/A ratio (diastolic function), performed by echocardiography after the period of PT