Extracts from Tithonia diversifolia (TD) have been widely employed in Central and South America, Asia and Africa to help in the treatment of malaria, a disease to which millions of people are subjected in tropical countries. In spite of this, we were not able to find any scientific report dealing with their effects on the heart muscle functioning or describing their toxic effects. Such gaps are barriers for the TD derivatives to become a phytotherapic agent. Therefore, we have planned this study aiming to clarify the inotropic and toxicological effects of TD derivatives. Their effects on the muscle inotropism were investigated in isolated guinea pig atrium mounted in an organ chamber containing Tyrode solution oxygenated by carbogen mixture (5% CO2, 95% O2). The atria were stretched (1 gf) and stimulated at 2 Hz with suprathreshold electrical pulses. Their contractile forces were captured isommetrically and stored in computer to be analysed off line. The effect of AqF was determined after this fraction be added to the organ bath. The evaluation concerned to its effect on the L-type calcium current (ICa,L) was carried out in ventricular cardiomyocytes isolated according to the steps described by Shioya (2007). The intracellular calcium transients were also studied in these cells previously loaded with FLUO4-AM and monitored by confocal microscopy. The acute (ATx) and subacute (STx) toxicities of the crude extract of TD (CE) were evaluated in rats according to the steps proposed by OECD (2001a,b). Briefly: animals were separated by gender to create one control group and two treated groups. For the ATx study, the animals pertaining to the control group received orally only distilled water, whereas rats pertaining to the treated groups received, respectively, 2.5 g/kg and 5.0 g/kg of CE administered in a unique dose. The animals involved in the study were monitored for abnormal signals during 14 days. In the STx evaluation, the animals of the two treated groups received, respectively, 0.125 g/kg/day CE and 0.250 g/kg/day CE during 30 days. Animals were carefully observed for signals representing physiological and/or behavioral abnormalities. At the end of each toxicological protocol, the animals were anaesthetized for collecting blood and after that they were euthanized for the removal of organs. Our results showed that AqF depresses the atrial contractility in a dose-dependent fashion. However, concentrations greater than 2 g/l cause mechanical alternans , indicating that AqF can disturb the dynamics of the calcium release channels, which are present in the sarcoplasmic reticulum membrane. The effect of AqF on the L-type calcium current (ICa,L) was studied by recording how this fraction changes the inotropic effect produced by increasing concentrations of CaCl2. Our data showed that 2 g/l AqF increased the CaCl2 EC50 from 1.207 ± 0.139 to 2.846 ± 0.035 mM (n = 4, p < 0.05), suggesting that AqF is able to reduce ICa,L. Such conclusion was reinforced by testing the Bowditch phenomenon in atria incubated with 1.3 g/l AqF. In these experiments, AqF completely abolished the force overshoot , which is normally seen in the positive staircase Bowditch phenomenon. The depressant effect of AqF on the ICa,L was also supported by the decrease of intracellular fluorescence related to the subcellular calcium from 6.9 ± 0.4 (n = 53) to 5.3 ± 0.3 u.a. (n = 51; p < 0.05). In fact, direct measurements of ICa,L performed in patch clamped cardiomyocytes, confirmed the depressant effect of AqF on ICa,L. In these experiments, 80 g/ml of AqF reduced the density of ICa,L from 10.00 ± 1.22 to 7.80 ± 1.19 A/F (n = 4, p < 0.05). An expected consequence for the ICa,L reduction is the increase of the time required for the myocardial electrical wave to cross the atrioventricular node. Electrocardiograms from isolated guinea pig hearts confirmed the reduction of ICa,L because in the presence of AqF the heart presented a complete atrioventricular block (AVB). There was no involvement of potassium channels, neither the muscarinic nor the opioids receptors in the AqF myocardial depressant effect. We can conclude that the depressant effects of AqF in the myocardium contractility are due to a reduction of ICa,L. Studies concerned to the ATx and STx showed that the CE does not promote any signal of pain, abnormal behavior or mortality in the rats (DL50>5.0 g/kg). In STx, CE does not change water or food intakes, but in the animals treated with 0.250 g/kg/day a gain of weight occurred, suggesting water retention in the animal s body. Neutropenia, eosinopenia, lymphocytosis, and monocytosis were observed in treated animals during the ATx study. In animals pertaining to the STx study it was seen leucopenia, neutropenia, and monocytopenia. In ATx evaluation, the biochemical profile of the blood showed a reduction in the plasmatic urea but the aspartate and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, total and direct bilirubin, total protein, globulin, sodium, and uric acid increased. Similar results were found in the STx study, except for the urea that remained unchanged and for the glucose, creatinin, albumin, and potassium that presented an increase in their serum levels. These findings advise for precaution when TD derivatives were proposed as a therapeutic agent. We conclude that AqF reduces ICa,L leading to a negative inotropism and an AVB. The CE interferes with the hematopoietic system and promotes injuries for the liver and kidneys leading to a non-inflammatory tissue reaction. / Extratos das folhas da Tithonia diversifolia (TD) têm sido empregados nas Américas do Sul e Central, Ásia e África como agentes antimaláricos entre outros usos. Seus possíveis efeitos sobre o coração e sua toxicidade, contudo, não estão relatados. Estas lacunas comprometem a expectativa de os derivados da planta virem a interessar à indústria de fitoterápicos e por esta razão, o presente trabalho visou complementar tais lacunas, trazendo para o conhecimento as propriedades inotrópicas e toxicológicas de derivados das folhas desta planta. Os estudos inotrópicos foram realizados com a fração aquosa (FAq) e em átrio esquerdo isolado de cobaia montado em cuba para órgão. Os átrios foram estirados a 1 gf e estimulados com pulsos de corrente supralimiares. A força atrial foi captada isometricamente e armazenada em computador. A ação da FAq foi avaliada adicionando-a ao banho. Para estudos com célula isolada, foram obtidos cardiomiócitos pela técnica de dissociação proposta por Shioya (2007). O efeito da FAq sobre a corrente de cálcio tipo L (ICa,L) foi estudado em cardiomiócitos ventriculares de rato e os de camundongo foram usados para estudar os transientes de cálcio subcelular, empregando-se, para isso, a sonda fluorescente Fluo4-AM. Os registros foram feitos com microscopia confocal de varredura a laser. A toxicidade aguda (TxA) e subaguda (TxS) do extrato bruto da TD (EB) foi avaliada em ratos de acordo com as regras da OECD. Resumidamente: os animais foram separados por gênero em grupos controle e tratados. Nos estudos de TxA, os animais do grupo controle receberam água destilada, enquanto que os dos grupos tratados receberam, p.o., 2,5 g/kg e 5,0 g/kg de EB. Os efeitos foram monitorados por 14 dias. Na avaliação referente à TxS, os grupos tratados receberam, p.o., durante 30 dias, 0,125 g/kg/dia ou 0,250 g/kg/dia de EB. Os animais foram observados para sinais de alterações fisiológicas e/ou comportamentais. Em seguida, foram anestesiados, o sangue coletado e depois eutanasiados para a histopatologia dos órgãos. Os resultados mostraram que a FAq deprime a contratilidade atrial e que concentrações acima de 2 g/l induzem o alternância mecânica, sugerindo que ela leva à disfunção dos canais liberadores de cálcio existentes no retículo sarcoplasmático. Para avaliar a ação da FAq sobre a ICa,L, foi estudada a sua ação sobre a curva concentração-efeito para o CaCl2. Neste estudo, a FAq produziu aumento da CE50 de 1,207 ± 0,139 mM para 2,846 ± 0,035 mM (n = 4, p < 0,05). A incubação do átrio com 1,3 g/l de FAq aboliu completamente o overshoot de força do fenômeno de Bowditch (n = 4, p < 0,05), indicando que ela reduz ICa,L. Esta hipótese foi igualmente suportada no fato de que a fração diminuiu a fluorescência para o cálcio subcelular de 6,9 ± 0,4 u.a. (n = 53) para 5,3 ± 0,3 u.a. (n = 51; p < 0,01) e também porque, quando empregada a 80 g/ml, ela reduziu a densidade da ICa,L de 10,00 ± 1,22 A/F para 7,80 ± 1,19 A/F (n = 4, p < 0,05). A FAq produziu bloqueio de condução no nódulo atrioventricular. O mecanismo de ação da FAq não envolveu receptores muscarínicos, opióides, nem canais para potássio, mas está baseado na diminuição da ICa,L. A avaliação da TxA e TxS mostrou que o EB é de baixa toxicidade pois sua DL50 foi maior do que 5,0 g/kg. O EB não alterou o consumo de água ou de comida, mas nos animais tratados com 0,250 g/kg/dia houve ganho de peso, sugerindo retenção hídrica, pois o peso dos órgãos não se modificou. Neutropenia, eosinofilopenia, linfocitose e monocitose foram observadas na TxA, mas na TxS ocorreu leucopenia, neutropenia e monocitopenia. A análise bioquímica na TxA mostrou redução da ureia plasmática, porém aumento da aspartato e da alanina aminotransferases, fosfatase alcalina, bilirrubinas total e direta, proteína total, globulina, sódio e ácido úrico. Resultados semelhantes foram encontrados nos estudos sobre a TxS, exceto para ureia, que se manteve constante e para glicose, creatinina, albumina e potássio, cujos níveis sanguíneos aumentaram. A histopatologia mostrou sinais de injúria hepática e renal. Concluimos que a FAq reduz a ICa,L como consequência ela é inotrópica negativa e induz BAV. Ela interfere com o sistema hematopoiético e promove lesão hepática e renal sem causar mortalidade e induz reação inflamatória tissular.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / We evaluated the effect of sildenafil citrate (ViagraÂ) a vasodilator largely used for the treatment of male erectile dysfunction, on the gastrointestinal motility in rats. Experiments were performed on 175 male, Wistar rats, weighing 200-350g. Four groups of study were done: the sildenafil effects on the: i) Gastric emptying (GE) and gastrointestinal (GI) transit and ii) Intestinal transit (IT) of liquid in awake rats; iii) Gastric compliance in anesthetized rats and iv) Contractility of rat duodenal isolated strips. i) In 64 rats fasted for 24h with previous vascular access (right jugular vein and left carotid artery), we studied the effect of an i.v. injection (0.2mL) of sildenafil (4mg/Kg) or vehicle (0.01N HCl) on GE and GI transit of a liquid meal, as well as on arterial pressure (AP) in a separated group of rats. Animals were gavage-fed with 1.5mL of a test meal (0.5mg/mL of phenol red in 5% glucose). After 10, 20 or 30min, animals were sacrificed and submitted to a laparotomy to obstruct the pylorus, cardia and terminal ileus. The gut was removed and then divided into: stomach and consecutive three small intestine segments (40% proximal; 30% medial and 30% terminal). After processing these segments, the dye retention was determined at 560nm. The percentage of dye retention in each segment permitted to evaluate GE and GI transit. Arterial pressure was continuously monitored by a digital acquisition system during 20min before and 30min after sildenafil injection. We observed a significant increase of gastric retention in sildenafil treated rats at 10, 20, or 30min after the test meal (44,2Â2,0 vs 53,2Â2,1; 25,4Â1,3 vs 37,3Â1,6; 20,9Â2,5 vs 32,5Â2,9%, respectively), as well as a significant GI transit delay. Despite of sildenafil inducing hypotension, AP returned to basal levels 10min afterwards. Acid gastic secretion blocking pre-treatment with omeprazol did not modify the sildenafil effect on gastric retention, GI transit or AP. ii) In another group we evaluated the sildenafil (4mg/Kg) or diluente (0.01N HCl, 0.2mL) effects on the IT in awake rats, fasted for 24h. Animals were studied 3d after the insertion of a silastic cannula (0.6cm ID) into the duodenal bulb. We evaluated the progression of a radioactive liquid test meal fed (10MBq of 99mTc â 1mL of saline 0,9%) administered through the inserted cannula into the small intestine. After 20, 30 or 40min, animals were sacrificed by anesthetic overdose. After laparotomy, we removed and divided the gut in: stomach, five congruent and consecutive segments of the small intestine and the large intestine. Radioactivity counting was obtained in a gamma-chamber collimator. Sildenafil promoted an IT delay (p<0.05), indicated by shifting the center of mass to the proximal portions of the TGI (2.8Â0.2 vs 3.3Â0.1; 3.0Â0.2 vs 3.7Â0.1 and 3.4Â0.1 vs 4.2Â0.2) in relation to control group. iii) Gastric compliance study was performed on 39 anesthetized rats after 24h of fasting. Gastric volume (GV) variations were measured by plethysmography while AP was continuously monitored. We have also observed that GV increased (p<0.05) after sildenafil treatment (3mg/Kg - e.v) (3.08Â0.18; 3.10Â0.17 and 3.09Â0.17mL vs 2.91Â0.19mL) at 10, 20 and 30min after drug administation, respectively. Basal AP (105.8Â2.28mmHg) dropped by the sildenafil injection (59.8Â3.2; 64.8Â3.7 and 59.3Â4.6mmHg-p<0.05) while vehicule (0.01N HCl) did not change either GV or AP. After splanchnotomy or pre-treatments (e.v.) with methylene blue (3mg/Kg-guanilate cyclase blocker), L-NNA (3mg/Kg - NO synthase blocker) or propranolol (2mg/Kg - Ã-blocker) prevented GV increase due to sildenafil; while post-treatment with sodium nitroprusside (1mg/Kg - NO donor) raised it. iv) The in vitro contractility studies were performed on isolated duodenal strips obtained from rats (n=28) killed by cervical dislocation. Duodenal strips were suspended longitudinally in a glass chamber (10mL), filled with Tyrode solution (37oC and pH 7.4). After 1h of stabilization under 1g of initial tension, the spontaneous or induced contractility were continuously recorded by a digital acquisition system. Increasing and cummulative doses of sildenafil (0.1 to 300Âmol/L) relaxed (9.6Âmol/L of EC50) the duodenal strips. This effect was more intense than those displayed by zaprinast or papaverine (PDEs blockers) (91.6 and 78.5Âmol/L of EC50, in this order). Sildenafil showed significant antispasmodic and myorelaxant effects on the duodenal contractions induced by acetylcholine or carbamylcholine (IC50 26.7 and 16.2Âmol/L, respectively). Pre-treatment with methylene blue, ODQ (guanilato cyclase blocker) or L-NAME (NO synthase blocker) also prevented these sildenafil effects, but D-NAME (an inactive substrate for NO synthase) did not. Myorelaxant sildenafil effect was reverted by L-arginine (substrate for NO synthase) and contrarily it was largely increased by sodium nitroprusside. Forskolin adenylate cyclase activation pre-treatment also increased the myorelaxant effect of sildenafil. In summary, we have observed that sildenafil slowed down the gastrointestinal motility, delaying GE, GI and intestinal transits of a liquid meal in awake rats; Gastric compliance was also increased in anesthetized rats treated with sildenafil. Sildenafil also exhibited both antispasmodic and myorelaxant effects on isolated strips of duodenum of ex vivo rats. Besides central or peripheral sympathetic nervous system activation, sildenafil possibly acts at the gastrointestinal myocite level by activating the NO/GMPc system. / Estudamos o efeito do citrato de sildenafil (ViagraÂ), vasodilatador largamente utilizado na terapÃutica da disfunÃÃo erÃtil, sobre o comportamento motor do trato gastrintestinal (TGI) de ratos Wistar. Para tanto, utilizamos 175 animais machos, pesando entre 200 a 350g, distribuÃdos nos quatro seguintes grupos de estudo: efeitos do citrato de sildenafil sobre o i) esvaziamento gÃstrico (EG) e os trÃnsitos gastrintestinal (GI) e ii) intestinal de lÃquido em ratos acordados; iii) a complacÃncia gÃstrica de ratos anestesiados e iv) a contratilidade de tiras isoladas do duodeno de ratos ex vivo. i) Avaliamos, em 64 ratos acordados sob jejum e livre acesso à Ãgua por 24h, o efeito da injeÃÃo (0,2mL; e.v.) de sildenafil (4mg/Kg) ou veÃculo (HCl 0,01N) sobre o EG e o trÃnsito GI de lÃquido, bem como sobre a pressÃo arterial (PA). Mediante gavagem, 1,5mL da refeiÃÃo-teste (vermelho de fenol - 0,5mg/mL em glicose a 5%) foi injetada no estÃmago. Depois de 10, 20 ou 30min, sacrificamos os animais e, apÃs laparotomia, obstruÃmos o piloro, o cÃrdia e o Ãleo terminal. Removemos e dividimos o TGI em: estÃmago e segmentos consecutivos do intestino delgado (40% iniciais; 30% mediais e 30% terminais). ApÃs o processamento destas porÃÃes viscerais, determinamos as absorbÃncias das amostras a 560nm. A retenÃÃo fracional de vermelho fenol em cada segmento permitiu o cÃlculo do EG e trÃnsito GI. Em um grupo separado de animais, a PA foi monitorada continuamente por meio de um sistema digital de aquisiÃÃo de dados durante 20min antes e 30min apÃs o tratamento com sildenafil ou diluente. Comparado ao grupo controle, houve aumento significativo da retenÃÃo gÃstrica (44,2Â2,0 vs 53,2Â2,1; 25,4Â1,3 vs 37,3Â1,6; 20,9Â2,5 vs 32,5Â2,9%) nos animais tratados com sildenafil e sacrificados aos 10, 20, ou 30min, respectivamente, bem como retarde significativo no trÃnsito GI. Embora o sildenafil tenha provocado hipotensÃo, a PA retoma nÃveis basais logo apÃs 10min. O prÃ-tratamento com omeprazol (bloqueador da secreÃÃo Ãcida estomacal) nÃo modificou o efeito do sildenafil sobre os valores de retenÃÃo gÃstrica e intestinal nem nos nÃveis de PA. ii) Noutros animais (n=44), sob jejum de 24h e dotados previamente (3d) de uma cÃnula crÃnica no bulbo duodenal, estudamos o efeito do sildenafil sobre a progressÃo ao longo do intestino delgado de uma refeiÃÃo teste (10MBq de TecnÃcio ligado a fitato e diluÃdo em 1mL de salina 0,9%). Decorridos 20, 30 ou 40min da injeÃÃo (0,2mL e.v.) de sildenafil (4mg/Kg) ou diluente (HCL 0,01N), sacrificamos os animais e, apÃs laparotomia e remoÃÃo do TGI, dividimo-o em: estÃmago, cinco segmentos congruentes e consecutivos de intestino delgado e o intestino grosso. A contagem da radiatividade foi determinada num colimador de gama-cÃmara. O sildenafil promoveu retarde (p<0,05) do TI, indicado pelos retardes dos centros geomÃtricos da refeiÃÃo de 2,8 0,2 vs 3,3 0,1; 3,0 0,2 vs 3,7 0,1 e 3,4 0,1 vs 4,2 0,2 em relaÃÃo ao grupo controle, aos 20, 30 ou 40min. iii) Os estudos de complacÃncia gÃstrica foram conduzidos em 39 ratos anestesiados, sob jejum de 24h. As variaÃÃes do volume gÃstrico (VG), foram medidas por pletismografia, enquanto a PA foi monitorada continuamente por um sistema digital de aquisiÃÃo de dados. Em relaÃÃo aos valores basais (2,91Â0,19mL) o sildenafil (3mg/Kg â e.v.) aumentou (p<0,05) o VG apÃs 10, 20 e 30min (3,08Â0,18; 3,10Â0,17 e 3,09Â0,17mL). A PA basal (105,8Â2,28mmHg) caiu significativamente com o sildenafil (59,8Â3,2; 64,8Â3,7 e 59,3Â4,6mmHg) enquanto o diluente (HCl 0,01N) nÃo modificou seja o VG ou a PA. O prÃ-tratamento mediante esplancnotomia ou injeÃÃo e.v. com azul de metileno (3mg/Kg-bloqueador da guanilato ciclase), L-NNA (3mg/Kg-bloqueador da NO sintetase) ou propranolol (2mg/Kg-Ã-bloqueador) preveniram o aumento do VG pelo sildenafil; jà o pÃs-tratamento com nitroprussiato de sÃdio (1mg/Kg - e.v.) o ampliou significativamente. iv) Avaliamos ainda o efeito do sildenafil sobre a contratilidade de tiras isoladas do duodeno de ratos ex vivo (n=28), sacrificados por deslocamento cervical. Tiras dissecadas do duodeno foram suspensas longitudinalmente em cuba de vidro (10mL), plena de soluÃÃo de Tyrode (37oC e pH 7,4), e submetidas a uma tensÃo inicial de 1g. ApÃs 1h de estabilizaÃÃo, a contratilidade espontÃnea ou induzida das tiras foi registrada continuamente por um sistema digital de aquisiÃÃo de dados. O sildenafil em doses crescentes e cumulativas (0,1 a 300Âmol/L) relaxou (EC50 de 9,6Âmol/L) o duodeno, mais atà que o zaprinaste ou a papaverina (bloqueadores de FDEs) (EC50 91,6 e 78,5Âmol/L, nesta ordem). Observamos ademais que o sildenafil inibiu as contraÃÃes induzidas por acetilcolina ou carbacol (IC50 26,7 e 16,2Âmol/L, respectivamente). Jà o prÃ-tratamento com azul de metileno, ODQ (bloqueador da guanilato ciclase) ou L-NAME (bloquedor da NO sintetase), mas nÃo o D-NAME (isÃmero inativo da NO sintetase) preveniram o efeito do sildenafil. O efeito mio-relaxante do sildenafil foi ampliado pela L-arginina (substrato do NO sintetase) ou nitroprussiato de sÃdio (doador de NO). O prÃ-tratamento com forskolina (estimulador da adenilato ciclase) tambÃm aumentou o efeito mio-relaxante do sildenafil. Em resumo, observamos que o sildenafil diminui a motilidade gastrintestinal, retardando o EG, os trÃnsitos GI e intestinal de lÃquido em ratos acordados; aumenta a complacÃncia gÃstrica em ratos anestesiados alÃm de apresentar efeitos antiespasmÃdico e mio-relaxante sobre tiras isoladas de duodeno de ratos ex vivo; por estimulaÃÃo do sistema nervoso simpÃtico e tendo como provÃvel mecanismo de aÃÃo ao nÃvel do miÃcito gastrintestinal a via do NO/GMP cÃclico.