Le contrôle qualité réalisé sur les cornées en organoculture dans les banques de cornées est primordial pour l'évaluation de la qualité des greffons. Dans une première partie, nous avons montré, sur 505 cornées en routine, que les paramètres mesurés avec notre analyseur d'images Sambacornea (CV de taille et hexagonalité cellulaire endothéliale) étaient tout à fait cohérents avec ceux mesurés en microscopie spéculaire in vivo chez les patients. Notre dispositif fournit une méthode fiable, validée pour la mesure de la densité cellulaire endothéliale DCE et de la morphométrie cellulaire. Dans une deuxième partie, nous avons analysé les erreurs inhérentes à la méthode de comptage à cadre fixe (grille calibrée ou réticule) lors de la mesure de la DCE par les banques de cornées. Nous avons mesuré sur 3000 zones, la DCE de 20 mosaïques cornéennes gravées, en utilisant des grilles dont la maille variait de 50 à 300 µm. La méthode était répétable avec des grilles de 200 µm à condition de considérer la moyenne sur 10 comptages et présentait une variabilité résiduelle de 5 % vs la DCE réelle. Les grilles classiques de 100 µm utilisées en comptage manuel devraient être abandonnées et remplacées par des grilles de 200 µm. L'analyse d'images numériques demeure cependant la meilleure solution. Dans une troisième partie, le développement d'un dispositif de mesure de la transparence et des diamètres utiles en greffe de cornée (cornée claire et diamètre total) est décrit. La transparence est appréciée via la mesure de la fonction de modulation de transfert à travers la cornée sur une mire originale dessinée dans notre laboratoire. Les mesures étaient reproductibles. D'après l'analyse de 358 cornées en routine, la transparence n'était pas corrélée à l'âge du donneur, ni à la DCE, et baissait au fil de la conservation. Ce dispositif simple et objectif permet de standardiser la "transparence" ; il devra être redéployé sur notre bioréacteur, et pourrait mener à la définition d'un seuil de transparence

La transparence et les propriétés optiques du greffon cornéen sont des qualités essentielles pour le résultat post opératoire après la kératoplastie perforante et la kératoplastie lamellaire antérieure qui sont les 2 greffes les plus utilisées au monde. Pourtant, la transparence est difficile à mesurer avec précision avec les techniques d’eye banking actuelles et les propriétés optiques ne le sont pas du tout car lors de la conservation cornéenne à 4°C et plus encore en organoculture, la cornée séparée du globe est moins transparente que sur le sujet vivant et comporte des plis. Nous avons développé un outil de conservation, un bioréacteur, permettant de simuler les conditions physiologiques de la cornée pendant la conservation, permettant ainsi la caractérisation optique du greffon. L’objectif de cette thèse a été la conception et la réalisation des instruments de caractérisation des propriétés optiques et tissulaires des greffons conservés en BR. Ces propriétés sont la densité cellulaire endothéliale, la transparence, la puissance, l’épaisseur et la détection d’interfaces cicatricielles / The optical properties of a corneal graft, namely its transparency, are pivotal to the post-operative result of penetrating keratoplasty and deep anterior lamellar keratoplasty, which are today the world’s two most performed grafts. However, transparency is difficult to accurately measure with modern eye banking techniques, and other optical properties are not measurable at all, as with both hypothermic storage and organ culture the enucleated cornea is less transparent than in a living eye, and presents endothelial folds. We developed a corneal storage device, a bioreactor, to simulate the eye’s physiological conditions during storage, thus allowing the measurement of the graft’s optical properties. The goal of this thesis was to create a set of instruments to be used in eye banking for the optical characterization of corneal grafts. The parameters to be measured are endothelial cell density, transparency, dioptric power, thickness and the presence of scar tissue

Le contrôle qualité réalisé sur les cornées en organoculture dans les banques de cornées est primordial pour l'évaluation de la qualité des greffons. Dans une première partie, nous avons montré, sur 505 cornées en routine, que les paramètres mesurés avec notre analyseur d'images Sambacornea (CV de taille et hexagonalité cellulaire endothéliale) étaient tout à fait cohérents avec ceux mesurés en microscopie spéculaire in vivo chez les patients. Notre dispositif fournit une méthode fiable, validée pour la mesure de la densité cellulaire endothéliale DCE et de la morphométrie cellulaire. Dans une deuxième partie, nous avons analysé les erreurs inhérentes à la méthode de comptage à cadre fixe (grille calibrée ou réticule) lors de la mesure de la DCE par les banques de cornées. Nous avons mesuré sur 3000 zones, la DCE de 20 mosaïques cornéennes gravées, en utilisant des grilles dont la maille variait de 50 à 300 µm. La méthode était répétable avec des grilles de 200 µm à condition de considérer la moyenne sur 10 comptages et présentait une variabilité résiduelle de 5 % vs la DCE réelle. Les grilles classiques de 100 µm utilisées en comptage manuel devraient être abandonnées et remplacées par des grilles de 200 µm. L'analyse d'images numériques demeure cependant la meilleure solution. Dans une troisième partie, le développement d'un dispositif de mesure de la transparence et des diamètres utiles en greffe de cornée (cornée claire et diamètre total) est décrit. La transparence est appréciée via la mesure de la fonction de modulation de transfert à travers la cornée sur une mire originale dessinée dans notre laboratoire. Les mesures étaient reproductibles. D’après l’analyse de 358 cornées en routine, la transparence n'était pas corrélée à l’âge du donneur, ni à la DCE, et baissait au fil de la conservation. Ce dispositif simple et objectif permet de standardiser la «transparence» ; il devra être redéployé sur notre bioréacteur, et pourrait mener à la définition d'un seuil de transparence / The corneal quality control (QC) in eye banks is essential for the assessment of the quality of grafts. In the first part, we showed on 505 consecutive corneas, that the parameters measured by our image analyzer Sambacornea (size CV and hexagonality of endothelial cells) were entirely consistent with those measured by specular microscopy in vivo in patients. Our device provides a reliable validated method for the measurement of the Endothelial Cell Density ECD and cell morphometry. In a second part, we analyzed the inherent errors of the fixed-frame counting method (calibrated grid or graticule) for corneal ECD in eye banks. We measured in 3000 areas, the 20 corneal mosaic ECD using grids ranged from 50 to 300 µm. The method was repeatable with 200 µm long grids if the average of 10 counts were used: it showed a residual variability of 5 % vs the real ECD. Conventional 100 µm long grids used in manual counting should be abandoned and replaced by 200 µm grids. The digital image analysis, however, is the best solution. In the third part, the development of a device for measuring the transparency and effective diameters in corneal transplantation (clear cornea and total diameter) is described. Transparency is assessed by measuring the modulation transfer function through the cornea on an original pattern designed in our laboratory. The measurements were reproducible. Based on the analysis of 358 corneas routine, transparency was not correlated with donor age, or the ECD, and decreased with duration of stockage. This simple and objective device standardizes the QC "transparency" and it should be used with our bioreactor, and could lead to the definition of a level for transparency

Certaines brûlures oculaires graves ou d'autres pathologies oculaires rares peuvent être associées à une perte totale de cellules souches épithéliales de la cornée (DCSL), ce qui conduit à une opacification de la cornée par invasion de la conjonctive. Lorsque la DCSL est totale et bilatérale, le limbe controlatéral n'est pas disponible pour la greffe de limbe autologue ou la culture de cellules souches autologues limbiques et la transplantation allogénique de la cornée est impossible car toujours rejetée en raison de la néovascularisation. Une thérapie innovante testée avec succès au sein de notre laboratoire, en collaboration avec le service d'ophtalmologie des HCL, consiste en une greffe autologue de Feuillet Epithélial (FE) dérivé de Muqueuse Orale (MO). Cette approche permet de restaurer la transparence et autorise, si nécessaire, une greffe cornéenne complémentaire. Cette technique a montré son efficacité lors d'un essai clinique conduit dans notre hôpital mais le dispositif breveté permettant le détachement non enzymatique des feuillets cultivés n'est plus disponible en Europe. Nous avons donc mis au point un nouveau procédé de production de FE dérivant de la MO dont la preuve de concept a été obtenue à partir d'études in-vitro et ex-vivo. En effet, un détachement avec 0,5 mg / mL de collagénase n'endommage pas le FE de MO et les protéines de la membrane basale, et, dans un modèle de stroma porcin exvivo, ces feuillets adhérents au stroma, continuent à se renouveler sous la forme d'épithélium différencié. De plus, dans le cas d'une opacité stromale associée à une DCSL, une greffe secondaire de cornée est nécessaire pour améliorer l'Acuité Visuelle (AV), c'est pourquoi nous avons cherché à développer pour ces patients à haut risque de rejet, un stroma décellularisé. Ce stroma pourrait également répondre à la pénurie de cornées dans les pays en voie de développement grâce à sa conservation longue et facile. La lyophilisation a été combinée à la décellularisation des cornées au SDS à 0,1 %, validée sur les cornées humaines sur le maintien de leur transparence et de l'ultrastructure du stroma associé à l'absence des antigènes HLA-ABC et HLA-DR. Enfin, dans un modèle de Kératoplastie Lamellaire Antérieure Profonde (KLAP) ex-vivo, nous avons montré que les cellules épithéliales et stromales de la cornée humaine receveuse colonise le stroma décellularisé. Ainsi, nos travaux permettent de proposer un traitement des DSCL totales et bilatérales associées ou non à une atteinte du stroma / Some severe ocular burns or other rare ocular pathologies may be associated with a complete loss of corneal epithelial stem cells (LSCD), leading to an opacification of the cornea by invasion of the conjunctiva. When DCSL is total and bilateral, contralateral limbus is not available for autologous limb transplant or limbal autologous stem cell culture, and allogeneic transplantation of the cornea is not an option since neovascularization is constantly responsible for graft rejection. An innovative therapy tested with success in our laboratory, in collaboration with the ophthalmology department of the HCL, consists in an autologous Epithelial Cell Sheet (ECS) graft derived from Oral Mucosa (MO). This approach restores transparency and allows in a second step a complementary corneal graft when necessary. This technique has been shown to be effective in a clinical trial conducted in our hospital, but the patented device for the non-enzymatic detachment of cultivated ECS is no longer available in Europe. We have therefore developed a new method for the production of ECS from OM, the proof of concept of which has been obtained from in-vitro and ex-vivo studies. Indeed, detachment with 0.5 mg / mL of collagenase does not damage ECS from OM and basement membrane proteins, and in an ex-vivo porcine stroma model, these cell sheets adhered on corneal stroma, continued to self-renew and generated a differentiated epithelium. Since stromal opacity associated with DCSL requires a secondary corneal graft to improve Visual Acuity (VA), we also sought to develop for these patients with high rejection risk, a new approach for the generation of decellularized stroma. Such a procedure for the production of decellularized stroma was also aimed at allowing a money-saving and reliable long-term storage for stromal grafts and thus circumventing the shortage of corneas in developing countries. Our process, combining lyophilization with decellularization of the corneas at 0.1 % SDS, was validated on human corneas regarding the maintenance of stroma transparency, the stromal ultrastructure associated with the absence of HLA-ABC and HLA-DR antigens. Finally, in an ex-vivo model of Deep Anterior Lamellar Keratoplasty (DALK), we have shown that the epithelial and stromal cells of the recipient human cornea colonized efficiently the decellularised stroma. Overall, our work makes it possible to propose a treatment for total and bilateral LSCD associated or not with lesions of the stroma

Cette thèse se découpe en trois parties. Les deux premières portent sur le développement de méthodes pour la construction de modèles géométriques moyens et pour la comparaison de modèles. Plusieurs problématiques sont abordées, telles que la construction d'une cornée moyenne et la comparaison de cornées. Il existe à ce jour peu d'études ayant ces objectifs car la mise en correspondance de surfaces cornéennes est une problématique non triviale. En plus d'aider à développer la connaissance de l'anatomie cornéenne, la modélisation de la cornée normale permet de détecter tout écart significatif par rapport à la normale permettant un diagnostic précoce de pathologies. La seconde partie a pour objectif de développer une méthode pour reconnaître une surface parmi un groupe de surfaces à l’aide de leurs acquisitions pour une application de biométrie. L’idée est de quantifier la différence entre chaque surface et une surface donnée, et de déterminer un seuil permettant la reconnaissance. Deux méthodes sont proposées et une méthodologie en cascade utilisant ces deux méthodes afin de combiner les avantages de chacune est aussi proposée. La troisième et dernière partie porte sur une nouvelle méthode de décomposition en graphes de maillages 3D triangulés. Nous utilisons des cartes de courbures discrètes comme descripteur de forme afin de découper le maillage en différentes catégorie de carreaux. Ensuite un graphe d'adjacence est construit avec un nœud pour chaque carreau. Ces graphes sont utilisés pour extraire des caractéristiques géométriques décrites par des motifs (ou patterns), ce qui permet de détecter des régions spécifiques dans un modèle 3D, ou des motifs récurrents. / This thesis comprises three parts. The first two parts concern the development of methods for the construction of mean geometric models and for model comparison. Several issues are addressed, such as the construction of an average cornea and the comparison of corneas. Currently, there are few studies with these objectives because the matching of corneal surfaces is a non-trivial problem. In addition to help to develop a better understanding of the corneal anatomy, 3D models of normal corneas can be used to detect any significant deviation from the norm, thereby allowing for an early diagnosis of diseases or abnormalities using the shape of the cornea. The second part of this thesis aims to develop a method for recognizing a surface from a group of surfaces using their 3D acquisitions in a biometric application pertinent to the cornea. The concept behind this method is to quantify the difference between each surface and a given surface and to determine the threshold for recognition. Two complementary methods are proposed. A cascading methodology using both methods to combine the advantages of each method is also proposed. The third and final part of this thesis focuses on a new method for decomposing 3D triangulated meshes into graphs. We use discrete curvature maps as the shape descriptor to split the mesh in eight different categories. Next, an adjacency graph is built with a node for each patch. These graphs are used to extract geometric characteristics described by patterns that allow for the detection of specific regions in a 3D model or recurrent characteristics.

Réalisé en cotutelle avec Aix Marseille Université. / Cette thèse se découpe en trois parties. Les deux premières portent sur le développement de méthodes pour la construction de modèles géométriques moyens et pour la comparaison de modèles. Ces approches sont appliquées à la cornée humaine pour l’élaboration d’atlas et pour l’étude biométrique robuste. La troisième partie porte sur une méthode générique d'extraction d'informations dans un maillage en s'appuyant sur des propriétés différentielles discrètes afin de construire une structure par graphe permettant l'extraction de caractéristiques par une description sémantique. Les atlas anatomiques conventionnels (papier ou CD-ROM) sont limités par le fait qu'ils montrent généralement l'anatomie d'un seul individu qui ne représente pas nécessairement bien la population dont il est issu. Afin de remédier aux limitations des atlas conventionnels, nous proposons dans la première partie d’élaborer un atlas numérique 3D contenant les caractéristiques moyennes et les variabilités de la morphologie d'un organe, plus particulièrement de la cornée humaine. Plusieurs problématiques sont abordées, telles que la construction d'une cornée moyenne et la comparaison de cornées. Il existe à ce jour peu d'études ayant ces objectifs car la mise en correspondance de surfaces cornéennes est une problématique non triviale. En plus d'aider à développer une meilleure connaissance de l'anatomie cornéenne, la modélisation 3D de la cornée normale permet de détecter tout écart significatif par rapport à la "normale" permettant un diagnostic précoce de pathologies ou anomalies de la forme de la cornée. La seconde partie a pour objectif de développer une méthode pour reconnaître une surface parmi un groupe de surfaces à l’aide de leurs acquisitions 3D respectives, dans le cadre d’une application de biométrie sur la cornée. L’idée est de quantifier la différence entre chaque surface et une surface donnée, et de déterminer un seuil permettant la reconnaissance. Ce seuil est dépendant des variations normales au sein d’un même sujet, et du bruit inhérent à l’acquisition. Les surfaces sont rognées et trouées de façon imprévisible, de plus il n’y a pas de point de mise en correspondance commun aux surfaces. Deux méthodes complémentaires sont proposées. La première consiste à calculer le volume entre les surfaces après avoir effectué un recalage, et à utiliser ce volume comme un critère de similarité. La seconde approche s’appuie sur une décomposition en harmoniques sphériques en utilisant les coefficients comme des descripteurs de forme, qui permettront de comparer deux surfaces. Des résultats sont présentés pour chaque méthode en les comparant à la méthode la plus récemment décrite dans la littérature, les avantages et inconvénients de chacune sont détaillés. Une méthodologie en cascade utilisant ces deux méthodes afin de combiner les avantages de chacune est aussi proposée. La troisième et dernière partie porte sur une nouvelle méthode de décomposition en graphes de maillages 3D triangulés. Nous utilisons des cartes de courbures discrètes comme descripteur de forme afin de découper le maillage traité en huit différentes catégorie de carreaux (ou peak, ridge, saddle ridge, minimal, saddle valley, valley, pit et flat). Ensuite, un graphe d'adjacence est construit avec un nœud pour chaque carreau. Toutes les catégories de carreaux ne pouvant pas être adjacentes dans un contexte continu, des jonctions intermédiaires sont ajoutées afin d'assurer une cohérence continue entre les zones. Ces graphes sont utilisés pour extraire des caractéristiques géométriques décrites par des motifs (ou patterns), ce qui permet de détecter des régions spécifiques dans un modèle 3D, ou des motifs récurrents. Cette méthode de décomposition étant générique, elle peut être appliquée à de nombreux domaines où il est question d’analyser des modèles géométriques, en particulier dans le contexte de la cornée. / This thesis comprises three parts. The first two parts concern the development of methods for the construction of mean geometric models and for model comparison. These approaches are applied to the human cornea for the construction of atlases and a robust biometric study. The third part focuses on a generic method for the extraction of information in a mesh. This approach is based on discrete differential properties for building a graph structure to extract features using a semantic description. Conventional anatomical atlases (paper or CD-ROM) are limited by the fact they generally show the anatomy of a single individual who does not necessarily represent the population from which they originate. To address the limitations of conventional atlases, we propose in the first part of this thesis to construct a 3D digital atlas containing the average characteristics and variability of the morphology of an organ, especially that of the human cornea. Several issues are addressed, such as the construction of an average cornea and the comparison of corneas. Currently, there are few studies with these objectives because the matching of corneal surfaces is a non-trivial problem. In addition to help to develop a better understanding of the corneal anatomy, 3D models of normal corneas can be used to detect any significant deviation from the norm, thereby allowing for an early diagnosis of diseases or abnormalities using the shape of the cornea. The second part of this thesis aims to develop a method for recognizing a surface from a group of surfaces using their 3D acquisitions in a biometric application pertinent to the cornea. The concept behind this method is to quantify the difference between each surface and a given surface and to determine the threshold for recognition. This threshold depends on normal variations within the same subject and noise due to the acquisition system. The surfaces are randomly trimmed and pierced ; moreover, there is no common landmark on the surfaces. Two complementary methods are proposed. The first method consists of the computation of the volume between the surfaces after performing geometrical matching and the use of this volume as a criterion of similarity. The second approach is based on a decomposition of the surfaces into spherical harmonics using the coefficients as shape descriptors to compare the two surfaces. Each result of the proposed methods is compared to the most recent method described in the literature, with the benefits and disadvantages of each one described in detail. A cascading methodology using both methods to combine the advantages of each method is also proposed. The third and final part of this thesis focuses on a new method for decomposing 3D triangulated meshes into graphs. We use discrete curvature maps as the shape descriptor to split the mesh in eight different categories (peak, ridge, saddle ridge, minimal, saddle valley, valley, pit and flat). Next, an adjacency graph is built with a node for each patch. Because all categories of patches cannot be adjacent in a continuous context, intermediate junctions are added to ensure the continuous consistency between patches. These graphs are used to extract geometric characteristics described by patterns that allow for the detection of specific regions in a 3D model or recurrent characteristics. This decomposition method, being generic, can be used in many applications to analyze geometric models, especially in the context of the cornea.