Malaria is a disease that causes more than 1 million deaths per year world wide and more than 400 million clinical cases. Due to the acquired resistance of Plasmodium falciparum to the drugs used to control the infection, searching for new anti-malaria drugs is necessary in modern days. Recent studies have shown that the parasite synthesizes fatty acids using a fatty acid synthase type II (FAS-II) instead of a type-I fatty acid synthase (FAS-I) that is present in other eukaryotes. Plasmodium falciparum enoyl reductase (PfENR) is responsible for the last step of fatty acid biosynthesis in the parasite. This enzyme is located within the apicoplast, a plastid-like organelle that is responsible for several important metabolic pathways, including fatty acid biosynthesis. It is known that triclosan is an inhibitor of ENR in bacteria and we and others have shown that it is also effective against ENR in apicomplexan organisms such as P. falciparum. However triclosan cannot be used to treat malaria in humans because it has metabolic liability (glucoronidation) which limits its inhibitory potency. We have used X-ray crystallography and a Structural Activity Relationship (SAR) strategy to design and cocrystallize a tertiary complex of PfENR with NAD+ and triclosan derivatives to improve their properties as drugs to treat malaria. More than five hundred triclosan derivatives were synthesized, and their in vitro and in vivo inhibitory activity evaluated. Furthermore, structural studies were made of their affinity to interact with residues in PfENR active sites, as well as with the cofactor NAD+. A total of six PfENR-NAD+-triclosan analog/complexes structures were determined. Analogs which had replacements of chloride groups at position 5 of ring A and 4' of ring B were determined, allowing the structural analysis of the binding of these triclosan analogs to PfENR. In addition, the urea derivatives (modification at position 1) as well as phenylsulphonamides (modification at position 2') have shown to be more potent inhibitors than triclosan in the in vivo assay. The analysis of the inhibitory properties and the structure of these analogs bound to PfENR will provide novel compounds in the search for new anti-malarial drugs.

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Le greffage covalent de monocouches organiques à la surface du silicium permet de contrôler ses propriétés électroniques. Un des challenges des nanotechnologies est de construire des assemblages ordonnés de nano-objets pour positionner et orienter précisément les éléments actifs des futurs dispositifs. Parmi les techniques de lithographie à l'échelle nanométrique, l'utilisation de microscopes à sonde locale est une méthode très versatile pour l'élaboration de nanostructures superficielles. Ces travaux présentent l'utilisation du microscope à force atomique comme un outil de structuration de surface et plus précisément, l'oxydation anodique locale avec une pointe AFM conductrice de surfaces de silicium précédemment passivé par une monocouche organique dense et organisée. L'oxyde de silicium généré est ensuite dissout par trempage dans de l'acide fluorhydrique dilué. Les surfaces obtenues possèdent alors des sites de silicium hydrogéné potentiellement réactifs entourés d'une matrice organique isolante. Ensuite, nous présentons les résultats de dépôt sélectif de particules d'or dans ces structures réactives. De part la différence de potentiel d'oxydoréduction, le sel d'or se réduit spontanément à la surface du silicium. Il serait aussi possible d'utiliser la chimie du silicium pour fonctionnaliser directement les structures de silicium hydrogéné. La dernière partie de cette thèse rapporte l'étude d'immobilisation d'unités électroactives (ferrocènes) et de nano-objets (clusters métalliques et nanotubes de carbone) sur des surfaces de silicium homogènes et structurées.

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un gamma herpèsvirus humain infectant plus de 95 % de la population mondiale. Lorsque la primo-infection a lieu pendant l'adolescence ou à l'âge adulte, elle peut induire la mononucléose infectieuse (MNI), cette maladie est le plus souvent bénigne. EBV est aussi associé à un certain nombre de cancers de type lymphome (lymphomes de Burkitt et d'Hodgkin) et de type carcinome (carcinomes gastriques et indifférenciés du rhinopharynx). L'importance des protéines de latence du virus dans l'apparition des tumeurs a été très étudiée. Des études récentes montrent que les protéines lytiques d'EBV sont aussi très importantes pour l'apparition et le développement des tumeurs. Le complexe Hélicase-Primase (H-P) du virus herpès simplex 1 (HSV-1, alpha herpèsvirus) est la cible de nouveaux antiviraux. Les activités ATPase, hélicase et primase du complexe d'HSV-1 ont été largement étudiées, mais aucune information structurale du complexe H-P n'est disponible actuellement pour un membre des herpèsvirus humains. Nous avons entrepris l'étude du complexe H-P d'EBV (BBLF4 : hélicase, BSLF1 : primase et BBLF2/3 : sous-unité accessoire) afin de caractériser sa structure et les activités qu'il porte. Nous avons pu établir les conditions d'expression et de purification du complexe et débuter des études structurales et enzymatiques préliminaires. Nous avons pu observer une activité ATPase basale du complexe indépendante de la présence d'un substrat ADN simple brin. Nous observons deux formes solubles du complexe lors des purifications, une présentant probablement une stœchiométrie proche de 1/1/1 et une seconde forme ayant surement un excès de la protéine Hélicase (BBLF4). Ces premiers résultats apportent des informations nouvelles pour le complexe H-P d'EBV et doivent être poursuivis afin de les confirmer et de pouvoir les comparer avec ceux déjà connus pour le complexe H-P d'HSV-1. / Epstein-Barr Virus (EBV) is a human herpesvirus largely present worldwide. When primary infection occurs during adolescence or adulthood, it could cause infectious mononucleosis (IM). This disease is most of the time minor. EBV is also associated with several cancers like lymphomas (Burkitt's lymphoma and Hodgkin's lymphoma) or carcinomas (gastric carcinoma and nasopharyngeal carcinoma). Latent proteins of the virus are largely studied and are important for apparition of tumors. Recent studies show that lytic proteins are also important for tumor apparition and progression. The Helicase-Primase complex (H-P) of herpes simplex 1 (HSV-1), a well-known herpèsvirus, is a target for new antiviral drugs. ATPase, helicase and primase activities of HSV-1 complex are well studied, but no information is available for the structure of the H-P complex of human herpesvirus. We studied the H-P complex of EBV (BBLF4: helicase, BSLF1: primase and BBLF2/3: accessory subunit) to characterize its structure and enzymatic activities. We describe the expression and purification conditions and begin preliminary studies on structure and activities of the H-P complex. We show a basal ATPase activity that is DNA single strand independent. We were able to purify two forms of the H-P complex, the first has a stoichiometry close to 1/1/1 and the second one has an excess of helicase protein (BBLF4). These preliminary results on H-P complex of EBV have to be validated with other experiments before being compared to information already known for the HSV-1 complex. Key words : EBV, Helicase-Primase complex, BBLF4, BSLF1, BBLF2/3, ATPase, stoichiometry.

La voie endo-lysosomale dirige les récepteurs membranaires vers le processus de dégradation lysosomale. En bref, les récepteurs sont marqués par l'ubiquitine, envoyés vers les endosomes précoces puis, pris en charge pas le système ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) et intégrés dans des vésicules intraluminales. Ce système est composé des complexes ESCRT-0, I, II, II et VPS4. Certaines protéines ESCRT sont aussi recrutées lors de processus topologiquement similaires comme la cytokinèse ou le bourgeonnment viral de certains virus enveloppés. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) est une ubiquitine-hydrolase associée au système ESCRT qui hydrolyse les chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63. Elle interagit directement avec ESCRT-0 via la sous-unité STAM et avec les membres CHMP1A, 1B et 3 d'ESCRT-III. Bien qu'AMSH pourait recruter ces protéines ESCRT ou être elle-même recrutée par celles-ci, le mécanisme d'activation de son activité d'hydrolase est encore méconnu. Afin de mieux comprendre les bases structurales de l'activation d'AMSH, j'ai essayé danalyser des formes recombinantes de cette protéine par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ce qui m'a permis d'obtenir deux modèles à basse résolution. De plus, j'ai caractérisé par SPR (Surface Plasmon Resonance) les interactions entre AMSH et CHMP1A, 1B et 3 et déterminé les résidus clefs du dernier complexe. Cela a montré que les surfaces d'interaction employées par le domaine MIT d'AMSH ne sont pas les mêmes pour CHMP3 et CHMP1A/1B. J'ai aussi découvert que l'activité enzymatique d'AMSH seule est très faible ce qui impliquerait une auto-inhibition en solution. L'hydrolyse des chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63 pourrait alors être activée par une construction de STAM comprenant le domaine SH3 ainsi que les domaines liant l'ubiquitine VHS et/ou UIM. / The endosomal pathway targets plasma membrane receptors for lysosomal degradation. Briefly, receptors are tagged by an ubiquitin, delivered to the early endosome and sorted into intraluminal vesicles by the ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery, composed of ESCRT-0, -I, -II- -III and the VPS4 complex. Some ESCRts are also recruited during topologically similar processes such as cytokinesis and budding of some enveloped viruses. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) is an ESCRT associated ubiquitin-hydrolase which hydrolyses K63-linked ubiquitin chains. AMSH interacts directly with the ESCRT-0 subunit STAM and ESCRT-III members CHMP1A, CHMP1B and CHMP3. Although AMSH may either recruit these ESCRTs are maybe recruited by these ESCRTs, little is known about the activation mechanism of its hydrolase activity. In order to understand the structural basis for AMSH activation I attempted to analyze recombinant forms of AMSH by X-ray crystallography and SAXS, which produced low resolution models of AMSH. I further characterized AMSH interactions with CHMP1A, CHMP1B and CHMP3 by SPR and determined the key residues for interaction. This showed that the AMSH MIT domain employs two different surfaces for CHMP3 and CHMP1A/B interactions. I also found that recombinant AMSH has very poor enzymatic activity on its own, which indicates an auto-inhibited state in solution. K63-linked uibiquitin hydrolysis could be activated by STAM constructs containing the SH3 and ubiquitin binding domains (UIM and/or VHS), which were shown to interact directly with AMSH via SPR. Thus activation of the hydrolase activity by STAM corroborates indirectly the autoinhibited native state.

Un des rôles des SIG 3D est d'intégrer et de mettre en cohérence des données issues de producteurs de données variés tout en respectant les choix faits en fonction des besoins des utilisateurs, en termes de géométrie et de topologie. Les SIG 3D actuels utilisent généralement une modélisation géométrique et topologique unique qui facilite, entre autres, les requêtes comme celles calculées à partir des modéles topologiques tels que le parcours de proche en proche des primitives géométriques d'un objet ou de ses voisins. En contrepartie, cette homogénéisation entraîne une perte des spécificités des modèles, de lourds calculs de conversion et ne corrige pas, sans une aide extérieure, les problèmes inhérents à l'acquisition et à la modélisation. Cette thèse propose un modèle d'analyse pour les SIG 3D permettant d'opérer des requêtes sur un objet (analyse intra-objet), quel que soit le choix technique de l'utilisateur, ou sur un ensemble d'objets (analyse inter-objets), même s'ils ne sont pas parfaitement cohérents. A partir de principes issus de la cristallographie, ce modèle, nommé Cristage, analyse les symétries de chaque objet pour décrire sa structure, c'est-à-dire la manière dont les primitives sont agencées entre elles. Complémentaire des modèles topologiques, cette première abstraction donne une vision globale de l'objet, ce qui facilite certaines requêtes comme l'extraction du toit d'une cavité ou la simplification géométrique d'un bâtiment 3D. L'analyse des différents éléments de symétrie (plans, axes et centre) offre une seconde abstraction : la maille. Considérée en cristallographie comme l'enveloppe du plus petit parallélépipède conservant les propriétés géométriques, elle est utilisée comme une boîte englobante adaptée à la forme de l'objet. Elle permet, en particulier, la mise en relation logique des objets géographiques, quelle que soit leur dimension. A l'aide des mailles, deux graphes sont calculés. Le premier, qualifié de graphe d'incidence, décrit les relations entre objets et facilite le parcours entre eux. Le second, appelé graphe temporel, dessine, pour un objet, l'évolution de ses relations avec son environnement / This work proposes a model for analysis based on 3D GIS. The proposed approach allows queries to be made on one object (intra-object analysis) or a set of objects (inter-objects analysis) even if the geometrical coherence between objects is not perfect. From crystallographic principles, this model analyses the symmetric features of each object to describe its structure i.e. the way which geometric primitives are arranged together. This first abstraction, the structure, gives a global overview of the object. A second abstraction, the lattice unit, is obtained through the analysis of symmetric elements. It is used like a 3D Bounding Box adapted to the object shape. It allows relationships of geographical objects whatever their geometric dimension. With the help of lattice units, two graphs are computed to describe relationships between objects and to draw, for one object, the evolution of its relationship with its own environment

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Nous avons développé un modèle et un programme d'affinement joint des densités de charge et spin. Lors des premiers tests plusieurs difficultés sont apparues et ont été étudiées puis résolues notamment par la mise en place de contraintes. Après la mise en place d'un programme stable d'affinement joint nous avons testé celui-ci sur le complexe MnCu(pba)...(H2O)3...2H2O, ou pba représente le 1,3-propylenbis(oxamato) en réutilisant les données provenant d'une expérience de diffraction de neutrons polarisés et en effectuant une nouvelle expérience de diffraction des rayons X à 10K, température à laquelle l'expérience de diffraction des neutrons polarisés a été conduite. Cette étude a permis de tester trois schémas de pondération, ainsi que les contraintes. Ces tests ont montré que l'affinement joint permet de retrouver les résultats des différents affinements séparés mais aussi d'aller plus loin en autorisant un affinement de la densité de spin avec plus de paramètres pertinents. Suite à ces premiers tests nous nous sommes intéressés à un complexe azido cuivre (Cu2L2(N3)2 avec L=1,1,1-trifluoro-7-(dimethylamino)-4-méthyle-5-aza-3-heptène-2-onato). L'affinement joint a permis d'avoir accès, pour la première fois, à la densité de valence expérimentale résolue en spin et d'affiner également des paramètres de contraction/dilatation différents pour la valence avec un spin up ou un spin down. Dans le dernier chapitre nous avons étudié un complexe de cobalt qui présentait des propriétés magnétiques intéressantes. Cependant la particularité magnétique du composé venant d'une forte anisotropie magnétique a rendu l'étude par affinement joint délicate dans un premier temps, c'est pourquoi nous avons étudié ce composé uniquement d'un point de vue de la densité de charge. Cette étude a tout de même permis de mettre en évidence expérimentalement à 100K un angle de torsion de 39° entre les axes principaux des atomes de cobalt, prédit par la théorie

Les petites GTPases de la famille Arf, régulateurs majeurs du trafic membranaire, sont activé par plusieurs familles de facteurs d’échange nucléotidiques (ArfGEFs). Les ArfGEFs jouent un rôle essentiel dans l’intégration des signaux de régulation qui conduisent à l’activation d’Arf au niveau de compartiments cellulaires spécifiques, cependant les mécanismes par lesquels ils ciblent les Arfs activés aux membranes spécifiques et leur coordination avec l’échange de nucléotide reste peu comprise. Nous utilisons ici la cristallographie et la reconstitution des activités ArfGEF sur des membranes artificielles pour analyser ces mécanismes pour un ArfGEF humain atypique, impliqués dans l’endocytose de récepteurs et associé à l’invasion tumorale dans de nombreuses cellules cancéreuses. Les membres de cette famille ont été décrits comme des GEFs spécifique d’Arf6, et comporte un domaine de type PH après leur domaine Sec7. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous voulions savoir comment les isoformes Arf1 et Arf6 achevaient leurs fonctions dans la cellule. Arf1 et Arf6 sont très similaires: elles possèdent plus de 60% d’identité de séquence, et des études structurales ont montré que la surface qu’ils utilisent pour interagir avec leurs régulateurs et effecteurs est essentiellement identique en séquence et en structure. Cependant, elles ont des fonctions différentes dans la cellule et des propriétés différentes in vitro, pour lesquelles aucune donnée structurale n’a donné d’explications. Nous utilisons ici la cristallographie, le SAXS et la RMN pour comprendre la différence entre ces deux isoformes. / Small GTPases of the Arf family, which are pivotal regulators of membrane traffic in eukaryotes, are activated by several families of guanine nucleotide exchange factors (ArfGEFs). ArfGEfs play a key role in processing upstream regulatory signals that lead to Arf activation onto specific subcellular compartments, yet the mechanisms by which they target activated Arfs to specific membranes and their coordination with nucleotide exchange remain poorly understood. Here we used X-ray crystallography and reconstitution of ArfGEF activities on artificial membranes to analyze these mechanisms for an atypical human ArfGEF, involved in receptor endocytosis and associated with tumour invasion in various cancer cells. Members of this family have been described as Arf6-specific GEFs, and carry a PH-like domain downstream their Sec7 domain. In a second part of the work we wanted to know how the isoforms Arf1 and Arf6 achieve exquisitely specific functions in cells. Arf1 and Arf6 are highly similar: they have over 60% sequence identity, and structural studies have shown that the surfaces they use to interact with regulators and effectors are essentially identical in sequence and structure. Yet, they have non-overlapping functions in cells. Arf1 is a major regulator of most aspects of vesicular traffic, while Arf6 is restricted to the plasma membrane where it acts at the crossroads of trafficking and cytoskeleton functions (D'Souza-Schorey and Chavrier 2006). Consistent with their cellular specificities, Arf1 and Arf6 also have distinctive biochemical properties in vitro, for which no straightforward structural explanation has been put forward. Here we used X-ray crystallography, synchrotron SAXS experiments and NMR to assess the difference between these two isoforms.

Cette thèse vise à maitriser la synthèse MPCVD de films hétéroépitaxiés de diamant de haute qualité cristalline sur substrat d'iridium pour la réalisation de dosimètres en radiothérapie. Cet objectif nous a conduits à élaborer la couche d'iridium épitaxiée sur des substrats SrtiO3 (001). Un bâti sous vide équipé d'un canon à électrons a donc été développé et calibré. Les couches obtenues ont été caractérisées par DRX et présentent une qualité structurale équivalente à l'état de l'art. Le procédé de nucléation (BEN) - MPCVD induit sur la surface de l'iridium des " domaines " spécifiques à la nucléation du diamant sur iridium. Un travail important a été mené sur l'optimisation du (BEN) - MPCVD de façon à obtenir un procédé fiable et reproductible pour obtenir des " domaines " homogènes sur une surface de 5x5mm2 d'Ir/SrtiO3. Des études de caractérisation de surface (MEB, XPS, AES) des " domaines " nous ont permis de dresser leur carte d'identité chimique et morphologique. Nous démontrons ainsi qu'ils contiennent des nuclei de diamant. De plus, la propagation de ces " domaines " semble suivre des directions préférentielles [110] induites par l'épitaxie de l'iridium au cours du temps durant l'étape de (BEN)-MPCVD. A partir de ces résultats, des films de diamant hétéroépitaxiés autosupportés de 100&#956-m ont été élaborés. La corrélation entre la qualité cristalline du diamant hétéroépitaxié et sa réponse en détection a été menée avec l'équipe dosimétrie du LCD. Des inhomogénéités de la structure cristalline due à la présence de défauts structuraux ont été mises en évidence. Afin d'étudier localement ces échantillons, une campagne de mesure par microfaisceau X a été réalisée sur la ligne Diffabs du Synchrotron Soleil. L'assemblage des différentes connaissances acquises lors de cette thèse a permis de fabriquer et de caractériser un premier détecteur à base de diamant hétéroépitaxié au LCD