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Estudos estruturais de uma lectina presente em sementes de Lotus tetragonolobus /

Moreno, Frederico Bruno Mendes Batista. January 2008 (has links)
Resumo: Esta tese tem como foco o estudo estrutural de uma lectina presente em sementes da espécie vegetal Lotus tetragonolobus (LTA). Inicialmente a LTA, previamente purificada, foi cristalizada. Os cristais foram obtidos a uma temperatura constante de 20ºC, durante 30 dias, utilizando a técnica de cristalização por difusão de vapor. Dois conjuntos de dados foram coletados a 2.00 e 2.35 Å de resolução, através da fonte de Raios X do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas - Brasil). Os cristais são monoclínicos e apresentam simetria do tipo P21, com parâmetros de cela de a=68.89, b=65.83 e c=102.53 Å. A substituição molecular foi feita utilizando-se o monômero da lectina presente na espécie Arachis Hypogae (Peanut). O homotetrâmero, produto da substituição, foi utilizado como ponto de partida para o refinamento cristalográfico. Diversos ciclos de refinamento por satisfação das restrições parciais foram feitos até a conversão total para valores satisfatórios de Rfree e Rfactor. A análise da estrutura revelou que a LTA possui uma forma tetramérica não identificada dentre outras lectinas de leguminosas. Sua estrutura é composta por dois dímeros, um deles semelhante ao dímero GS4 presente na lectina de Griffonia simplicifolia e outro que é único, caracterizado por ser um dímero do tipo LTA-dímero. Diversos fatores são responsáveis pela forma de tetramerização diferenciada da LTA, dentre os quais podemos destacar a influência da glicosilação no resíduo ASN4. Para investigarmos a estrutura da LTA em meio aquoso foi utilizada a técnica de espalhamento de Raios X a baixo ângulo (SAXS), que mostrou que a LTA possui a mesma forma tetramérica em solução da que foi observada no retículo cristalino... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The lectin, LTA, an agglutinin found in Lotus tetragonolobus seeds have been crystalized. Crystals grew at a temperature of 20º C during a month and were obtained using the vapor diffusion method. Two data sets were collected at 2.00 and 2.35 Å resolution using a sincrotron radiation source at Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas - Brasil). The LTA crystals are monoclinic belonging to the P21 space group with a=68.89, b=65.83 and c=102.53 Å. The Molecular replacement was performed using the Arachis Hypogae lectin monomer (Peanut) that yielded an homotetramer which was used to initiate the crystallographic refinement. Several steps of restrained refinement were performed to obtain the best values for Rfree and Rfactor. Structural analysis of the LTA showed that its tetramer adopts a new structural oligomerization in contrast of that observed for others legume lectins. Its structure contains two GS4-like dimers disposed in an unusual dimer-interface, named as LTA-dimer. Several properties are involved in the new mode of tetramerization adopted for LTA, which includes the glycosilation at ASN4. The LTA tetramer investigation at aqueous solution was perfomed by Small Angle XRay Scattering (SAXS), showing that LTA behaves as a tetramer in solution which corroborates with the crystalline structure. Our investigations suggest that the L-fucose binding sites of LTA are disposed in a conformation that permits to perform two dimensional type-2 cross-linking interaction with divalent L-fucosyloligosaccharides. / Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Junior / Coorientador: Valmir Fadel / Banca: Fernanda Canduri / Banca: José Márcio Machado / Banca: Paulo Sérgio Lopes de Oliveira / Banca: José Ramon Beltran Abrego / Doutor
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Estrutura cristalográfica da Purina nucleosídeo foslorilase do Mycobacterium tuberculosis /

Silva, Diego Oliveira Nolasco da. January 2005 (has links)
Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: Luis Fernando Delboni / Banca: Fernanda Canduri / Resumo: A Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) catalisa a fosforólise de nucleosídeos de purina para suas respectivas bases e açucares (ribose ou desoxirribose) 1-fosfato. A PNP desempenha uma função central no metabolismo das purinas, normalmente operando na via de recuperação do DNA das células. Mais ainda, a PNP cliva ligações glicosídicas com inversão da configuração para produzir a-ribose 1-fosfato. Acredita-se que no organismo do Mycobacterium tuberculosis a PNP desempenha tarefas similares, o que levanta o interesse em desenvolver ciência que dê suporte para o desenvolvimento de drogas baseadas na estrutura desta proteína. A proteína é um homotrímero simétrico com um arranjo triangular das subunidades, similar às PNPs triméricas de mamíferos. Cada monômero consiste de um enovelamento a/ß formado por onze fitas ß circundadas por oito hélices a. O estudo desta PNP visa proporcionar comparações com outras estruturas, na intenção de identificar as bases estruturais de possíveis diferenças ou similaridades funcionais entre esta e outras PNPs, num esforço para desenvolver pesquisa que dê suporte para o desenho de novas drogas mais seletivas e poderosas contra a tuberculose. / Abstract: The Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyses the phosphorolysis of purine nucleosides to corresponding bases and ribose 1-phosphate. PNP plays a central role in purine metabolism, normally operating in the purine salvage pathway of cells. Moreover, PNP cleaves glycosidic bond with inversion of configuration to produce á-ribose 1-phosphate. It is believed that in the MtPNP is responsible for the same labor in the Mycobacterium tuberculosis organism, which arouses the interest in developing science for giving support to the development of structure based drugs. The protein is a symmetrical homotrimer with triangular arrangement of the subunits, similar to the trimeric mammalian PNPs. Each monomer consist of a á/â folding formed by eleven â sheet surrounded by eight á helices. The study of this PNP aims the possibility of caring out comparisons with other structures, in order to identify the structural basis of possible differences or functional similarities between this and other PNPs, in an effort to develop research which gives support to the design of more selective and powerful new drugs against tuberculosis. / Mestre
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Production, characterization and structural analysis of proteins from Corynebacterium pseudotuberculosis and snake venoms /

Masood, Rehana. January 2015 (has links)
Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: João Ruggiero Neto / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Resumo: Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) é o agente etiológico da linfadenite caseosa (CLA), uma doença que afeta diferentes grupos de animais em todo o mundo, especificamente áreas de produção de ovinos e caprinos, que causam perdas econômicas significativas. Estas bactérias podem infectar humanos, e 25 casos de infecções em humanos foram relatados na literatura. Atualmente, não há nenhum tratamento eficiente para esta doença e também não existem estruturas cristalográficas de proteínas de C. pseudotuberculosis que possam ajudar a compreender melhor o mecanismo de ação desse patógeno. No presente estudo, foram expressas e purificadas proteínas-chave que desempenham papéis importantes no metabolismo deste patógeno. Três proteínas de C. pseudotuberculosis foram expressas e purificadas. Triose fosfato isomerase (TIM) é uma enzima ativa da via glicolítica, sendo uma das principais enzimas envolvidas no fornecimento de energia para o organismo. Esta enzima foi expressa purificada e cristalizada. Tiorredoxina redutase (TrxR) e Tioredoxina (Trx) participam do sistema tioredoxina (redox), em que o Trx atua como um substrato para o TrxR. Estas enzimas têm diversas funções nos organismos. Estas enzimas foram expressas, purificadas e caracterizadas. A estrutura cristalográfica da TIM foi determinada a 2,5 Å. Proteínas de veneno de serpente, também foram investigados neste estudo, e cinco proteínas diferentes do gênero Bothrops foram purificados e cristalizadas. A estrutura cristalina da Atroxlysin-I foi determinada a 1,8 Å de resolução e foi comparada com diferentes metaloproteinases-I que foram depositados no PDB / Abstract: Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) is the etiological agent of Caseous Lymphadenitis (CLA), a disease that affects different groups of animals worldwide, specifically sheep and goat production areas, which result a significant economic losses. These bacteria even infect humans; to date 25 different cases of infections in humans are reported in the literature. Currently, no efficient treatment for this disease is available neither a crystallographic structure of any protein from C. pseudotuberculosis that could assist in better understanding of the mechanism of action of this pathogen. In the present study, we have expressed and purified key proteins that play a major role in the metabolism of this pathogen. Plasmids of three different proteins from C. pseudotuberculosis were designed. Triose phosphate isomerase (TIM) is an active enzyme of glycolytic pathway, which is one of the main energy supplier enzymes for the organisms. This enzyme was expressed, purified and crystallized, the crystal structure was determined at 2.5 Å. Thioredoxin reductase (TrxR), and Thioredoxin (Trx) are the part of thioredoxin (redox) system, in which the thioredoxin act as a substrate for the TrxR. These enzymes have a diverse function in organisms. These enzymes were expressed, purified and characterized. Snake venom proteins were also investigated in this study; five different proteins from genus Bothrops were purified and crystallized. The crystal structure of Atroxlysin-I was determined at 1.8 Å resolutions and compared with different metalloproteinases-I, deposited to PDB / Doutor
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Análise químico-farmacêutica de norflocacino comprimidos e estudos de complexação com β-Ciclodextrina e polimorfismo /

Chierentin, Lucas. January 2013 (has links)
Orientador: Hérida Regina Nunes Salgado / Banca: Marcela Longhi / Banca: Ruy Carlos Ruver Beck / Resumo: O norfloxacino é uma fluoroquinolona de segunda geração derivada do ácido nalidíxico. Como as demais fluoroquinolonas, o norfloxacino atua por inibição da DNA-girase bacteriana, complexo enzimático que participa do processo de replicação do DNA bacteriano e também inibe a topoisomerase tipo IV do DNA bacteriano. Esta fluoroquinolona é utilizada para o tratamento de infecções do trato urinário causadas por bactérias Gram-negativas, incluindo Enterobacteriaceae e espécies Pseudomonas-resistentes e também alguns micro-organismos Gram-positivos. A literatura apresenta alguns métodos de análise para norfloxacino em fluidos biológicos, águas subterrâneas, alimentos e formas farmacêuticas. Com base nestas considerações, este trabalho objetiva desenvolver ensaios para análise qualitativa de norfloxacino utilizando espectrofotometria na região do visível, análise térmica, cromatografia em camada delgada, cromatografia líquida de alta eficiência, eletroforese capilar e outros métodos gerais para caracterização da SQR e comprimidos de norfloxacino. Métodos analíticos foram desenvolvidos e validados para a quantificação deste fármaco como: (1) espectrofotometria na região do visível, comprimento de onda de detecção 520 nm, com faixa linear de 95,0 a 120,0 μg/mL utilizando ácido cloranílico 0,1% como reagente, com exatidão de 102,48%; (2) cromatografia líquida de alta eficiência, com comprimento de onda de detecção de 277 nm, fase móvel composta por solução aquosa de ácido acético 5% e metanol (80:20 v/v), obtendo-se tempo de retenção médio de 5,7 minutos e capacidade de separação de produtos de degradação. A faixa linear avaliada foi de 10,0 a 30,0 μg/mL, com exatidão de 103,96%; (3) Eletroforese Capilar, validado utilizando-se como eletrólito, tampão de tetraborato de sódio 30 mM a pH 9,0 e capilar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Norfloxacin is a second-generation fluoroquinolone derivate of nalidixic acid. Like other fluoroquinolones, norfloxacin acts by inhibiting DNA gyrase, the enzyme complex that participates in the process of bacterial DNA replication and also inhibit topoisomerase IV type of bacterial DNA. This fluoroquinolone is used in treatment of urinary tract infections caused by Gram-negative bacteria, including Enterobacteriaceae, and Pseudomonas-resistant species and also by Gram-negative microorganisms. The literature describes some methods to analyses norfloxacin in biologic fluids, groundwater, foods and pharmaceutical forms. Based on these considerations, this work aims to develop assays for qualitative analysis of norfloxacin using visible spectrophotometry, thermal analysis, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography, capillary electrophoresis and other general methods for the characterization of API and tablets of norfloxacin. Analytical methods were developed and validated for the quantification of this drug as: (1) visible spectrophotometry, detection wavelength 520 nm with a linear range from 95.0 to 120.0 μg/mL using chloranilic acid 0.1% as a reagent, with an accuracy of 102.48%; (2) high performance liquid chromatography with detection wavelength of 277 nm, mobile phase composed of aqueous 5% acetic acid and methanol (80:20 v/v) obtaining an average retention time of 5.7 minutes and separation capability degradation products. The linear range was measured from 10.0 to 30.0 μg/mL, with accuracy (103.96%); (3) Capillary electrophoresis was validated using a solution of 30 mM sodium tetraborate buffer pH 9.0 as the electrolyte and a fused silica capillary of 48.5 cm, with 40.0 cm effective, and 75 μm of diameter. The linear range was evaluated from... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Aplicação da difração de raios X por policristais e do método de Rietveld de refinamento de estruturas cristalinas no estudo de polimorfos cristalinos de fármacos /

Antonio, Selma Gutierrez. January 2010 (has links)
Orientador: Carlos de Oliveira Paiva Santos / Banca: Fernando Luis Fertonani / Banca: Pedro Paulo Corbi / Banca: Flávio Machado de Souza Carvalho / Banca: Nelson Ferreira Claro Junior / Resumo: A maioria dos fármacos é administrada na forma sólida (amorfo ou policristalino). As formas policristalinas são facilmente detectadas por difração de raios X. Estes fármacos podem cristalizar de diversas formas (polimorfo). Os polimorfos podem apresentar diferentes propriedades físico-químicas e assim apresentar alterações na biodisponibilidade. O polimorfismo decorre das condições empregadas na síntese e purificação da substância, dependendo do tipo de solvente utilizado e da temperatura da reação. Utilizando a difração de raios X e conhecendo a estrutura cristalina é possível a quantificação dos polimorfos nos fármacos através do Método de Rietveld. Neste trabalho, através da difração de raios X por pó, foram indexados os difratogramas de três compostos: a Atorvastatina Cálcica Forma I, o Mebendazol Forma A e um isômero da Tibolona (Isotibolona). Estas indexações permitiram a decomposição de seus respectivos padrões de difração e o posterior uso desses padrões decompostos na identificação dos compostos em matérias primas. Também foram estabelecidos os procedimentos adequados para obtenção dos dados de difração dos fármacos estudados nesse trabalho (ácido mefenâmico, atorvastatina, carbamazepina, mebendazol, tibolona), de forma a permitir a quantificação inequívoca dos seus polimorfos presentes em matérias primas. Um dos problemas mais importantes nessas análises está relacionado à resolução do equipamento que pode causar ambiguidade tanto nas intensidades quanto no alargamento dos picos. Difratogramas de raios X de fármacos apresentam (a) alta sobreposição de picos devido à grande cela unitária e baixa simetria, e (b) orientação preferencial devido aos cristalitos anisotrópicos. Assim, em alguns casos, como tibolona e carbamazepina, foi necessário usar a alta resolução para diminuir a sobreposição dos picos e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The majority of pharmaceuticals are prescribed in solid form (amorphous or polycrystalline). The polycrystalline forms are detected by rays X diffraction. These pharmaceuticals can crystallize in several forms (polymorphs), which present distinct physico-chemical properties and biodisponibility. The polymorphism occurs due to conditions used in the synthesis and purification of the substance, depending on the type of solvent used and the temperature reaction. Utilizing X-Ray powder diffraction and if the crystal structure are known, it is possible, using the Rietveld Method, to quantify the amount of each polymorph in the pharmaceutical. In this work, x-ray diffraction patterns of three compounds were indexed: Atorvastatin calcium form I, mebendazole form A and isotibolone (a tibolone isomer). These indexing allowed pattern decomposition which was used for its identification in raw materials of these drugs. The procedure for the suitable X-ray diffraction data collection was also established for the pharmaceuticals studied in this work (mefenamic acid, atorvastatin, carbamazepine, mebendazole, tibolone), in order to have an unequivocal quantification of their polymorphs in raw materials. One of the most important problem in pharmaceutical analysis is related to the equipment resolution, which can cause ambiguity in the peak intensities and broadening. X-ray diffraction patterns present (a) high peak overlap due to the large unit cell and low symmetry and (b) preferred orientation due to the anisotropic crystallites. Then, in some cases, like tibolone and carbamazepine, it was necessary to use high resolution equipments for decreasing the peak overlap and the suitable correction of the anisotropic peak broadening caused by the crystallite anisotropy. The high resolution also allows the unit cell refinement without ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Definição de limites para a identificação e quantificação de polimorfos do fármaco finasterida por difração de raios X por policristais

Bezzon, Vinicius Danilo Nonato [UNESP] 18 February 2013 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-18Bitstream added on 2014-06-13T21:00:51Z : No. of bitstreams: 1 bezzon_vdn_me_bauru.pdf: 5934071 bytes, checksum: bd5d8e0bb1eb9f7d625e556c89e14940 (MD5) / Polimorfismo é a propriedade de moléculas cristalizarem em mais de uma forma cristalina, o que pode afetar suas propriedades físico-químicas. Esse fenômeno está presente também em fármacos, e a avaliação de matérias-primas para manter o controle do polimorfo presente em comprimidos comercializados tem um papel importante na indústria farmacêutica. A identificação e o controle de formas polimórficas podem ser realizadas utilizando diversas técnicas, dentre as quais: Análise térmica, espectroscopia na região do infra-vermelho, espectroscopia Raman e a difração de raios X por policristais (DRXP). Esta última é uma técnica que permite a caracterização de fases cristalinas, quantificação de amorfo utilizando padrões internos, e por meio do método de Rietveld o refinamento de estrutura cristalina e a quantificação das fases presentes na amostra. No entanto, alguns fatores limitam a identificação e quantificação das fases em misturas em análises por DRXP, e estão relacionados a parâmetros estruturais da amostra como a baixa simetria e grande volume da cela unitária, á características físicas como forma e tamanho dos cristalinos, e resolução dos difratômetros que são definidas pela geometria, fendas, monocromatização do feixe e sistema de detecção / Polymorphism is the property of molecules to crystallize in more than one crystal form, which may affect physicochemical properties. This phenomenon is also present in pharmaceuticals, and evaluation of raw materials to maintain the control of the polymorph present in tables plays an important role in the pharmaceutical industry. The identification and control of polymorphic forms can be performed using various techniques, among which Thermal analysis, infrared spectroscopy, Raman spectroscopy and X-ray powder diffraction. The latter is a technique that allows among things characterization of crystalline phases, quantification of amorphous using internal standards and, by means of Rietveld method, refinement of the crystal structure and quantification of phases present in the sample. However, several factors limit the identification and quantification of the phases in mixtures, and are related to structure parameters of the sample, such as low symmetry and large unit cell volume, the physical characteristics such as crystallite size and shape, and the resolution of diffractometers which are defined by the geometry, slits, beam monochromatization and detection system
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Introdução aos métodos de determinação de estruturas cristalinas por difração de raios-X: complexos de Rutênio. / Introduction to crystal structure determination methods by X-ray diffraction: ruthenium complexes.

Marcos Roberto de Mattos Fontes 25 March 1992 (has links)
Esta dissertação consiste de duas partes: Parte I: Descrição teórica suscinta dos fundamentos da cristalografia de raios-X. Parte II: Resolução de quatro estruturas cristalinas, três complexos de rutênio (capítulos V, VI, VII) e um ligante comumente encontrado em complexos de rutênio, o C28H28O2P2. As estruturas resolvidas foram: 1) C28H28O2P2, Mr= 458.48, triclínico, PI a= 5.826(1), b= 8.862(1), c= 12.517(2)&#197, &#945= 100.29(1), &#946= 102.67(1), &#933= 104.22(1)&#176, V= 592.5(3)&#1973, Z=1, Dx=1.285g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 2.00cm-1, F(000)=242, T=296K, Rint=0.01, R=0.031, Rw=0.030 para 1390 reflexões independentes observadas [I&#62 3 &#959 (I)]. Os átomos P estão a 0.126(1)&#197 do plano formado pelo grupo (CH2)4-. Os anéis fenil são planares dentro da margem de erro experimental. Os átomos P têm uma configuração tetraédrica distorcida. 2) PyH[RuCl4(CO)Py], Mr=430.11, monoclínico, P21/n, a= 7.821(1), b= 10.337(3), c= 19.763(3)&#197, &#946=93.07(1)&#176, V= 1595.5(5)&#1973, Z=4, Dx=1.791g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 14.86cm-1, F(000)=843.9, T=296K, Rint=0.03, R=0.062, Rw=0.063 para 1478 reflexões independentes observadas [I&#62 3&#959 (I)]. A estrutura é composta essencialmente por dois planos perpendiculares entre si; um formado pelos quatro átomos de cloro (com ângulo de aproximadamente 90&#176 entre si), o outro pelos grupos Py e carbonila e o átomo de Ru na intersecção destes. O complexo tem carga líquida negativa, sendo necessário a presença do grupo PyH (com carga líquida positiva), para a estabilização do cristal. 3) PyH(RuCl4Py2), Mr= 481.20, monoclínico, P21/n, a= 8.080(7), b= 22.503(7), c= 10.125(6)&#197, &#946= 93.19(6)&#176, V= 1838(2)&#1973, Z=4, Dx= 1.739g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 13.06cm-1, F(000)=959.9, T=296K, Rint=0.03, R=0.038, Rw=0.039 para 1553 reflexões independentes observadas [I&#62 3&#959 (I)]. Esta estrutura é bastante similar com a 2) descrita acima, ou seja, é composta essencialmente por dois planos perpendiculares entre si; um formado pelos quatro átomos de cloro (com ângulo de aproximadamente 90&#176 entre si), o outro pelos dois grupos Py e o átomo de Ru na intersecção destes. Pelo mesmo argumento usado acima, há um grupo PyH (com carga líquida positiva) no cristal. 4) [RuCl2(MeIm)2(CH3OH)(CO)], Mr= 396.24, triclínico, PI, a= 8.609(3), b= 8.060(3), c= 10.581(4)&#197, &#945= 77.78(3), &#946= 88.43(3), &#933= 66.88(3)&#176, V= 740.4(5)&#1973, Z=2, Dx= 1.777g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 12.80cm-1, F(000)=386, T=296K, Rint=0.004, R=0.025, Rw=0.027 para 2489 reflexões independentes observadas [I&#62 3&#959 (I)]. As distâncias e ângulos médios das ligações dos quatro complexos aqui descritos são comparados entre si e com mais quatro complexos no capítulo VII. / This work consists of two parts: Part I: A brief theoretical description of the basic principles of X-ray crystallography. Part II: Resolution of the four crystal structures; three ruthenium compounds (chapter V, VI, VII) and a ligand commonly found in ruthenium complexes, C28H28O2P2. The structures resolved were: 1) C28H28O2P2, Mr= 458.48, triclinic, PI a= 5.826(1), b= 8.862(1), c= 12.517(2)&#197, &#945= 100.29(1), &#946= 102.67(1), &#933= 104.22(1)&#176, V= 592.5(3)&#1973, Z=1, Dx=1.285g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 2.00cm-1, F(000)=242, T=296K, final R=0.031 for 1390 independent observed reflections. The P atoms 0.126(1)&#197 away from plane formed by (CH2)4-. Both phenyl rings are planar to within experimental accuracy. The P atom has a distorced tetrahedral configuration. 2) PyH[RuCl4(CO)Py], Mr=430.11, monoclinic, P21/n, a= 7.821(1), b= 10.337(3), c= 19.763(3)&#197, &#946=93.07(1)&#176, V= 1595.5(5)&#1973, Z=4, Dx=1.791g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 14.86cm-1, F(000)=843.9, T=296K, Rint=0.03, final R=0.062, Rw=0.063 for 1478 independent observed reflections [I&#62 3&#959 (I)]. The structure is essentially composed of two perpendicular planes; one consisting of four chlorine atoms (in a square-planar arrangement), and a second plane composed of Py and carbonyl groups, with the ruthenium atom at intersection of them. The molecules have a net negative charge and the presence of the PyH group (with net positive charge), is necessary for crystal stabilization. 3) PyH(RuCl4Py2), Mr= 481.20, monoclinic, P21/n, a= 8.080(7), b= 22.503(7), c= 10.125(6)&#197, &#946= 93.19(6)&#176, V= 1838(2)&#1973, Z=4, Dx= 1.739g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 13.06cm-1, F(000)=959.9, T=296K, Rint=0.03, final R=0.038, Rw=0.039 for 1553 independent observed reflections [I&#62 3&#959 (I)]. This structures is very similar to that described in 2) above, being essentially composed of two perpendicular planes; one composed of four chlorine atoms (in a square-planar arrangement), and the other composed of two Py groups, with the ruthenium atom at the intersection of them. For the reason given above, there is one PyH group (with positive liquid charge) in the crystal. 4) [RuCl2(MeIm)2(CH3OH)(CO)], Mr= 396.24, triclinic, PI, a= 8.609(3), b= 8.060(3), c= 10.581(4)&#197, &#945= 77.78(3), &#946= 88.43(3), &#933= 66.88(3)&#176, V= 740.4(5)&#1973, Z=2, Dx= 1.777g.cm-3, &#955(M&#959K&#945)=0,71073&#197, &#956= 12.80cm-1, F(000)=386, T=296K, Rint=0.004, final R=0.025, Rw=0.027 for 2489 independent observed reflections [I&#62 3&#959 (I)]. In chapter VII, the average inter-atomic distances and angles for the four compounds are compare one with another and with four previously determinate structures.
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Exploring the selectivity of metal ions in the active site of the enzyme superoxide dismutase (SOD) using site-directed mutagenesis / Explorando a seletividade por íons metálicos no sitio ativo da enzima superóxido dismutase (SOD) usando mutagênese sitio dirigida

Emérita Mendoza Rengifo 28 September 2016 (has links)
Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å and 1.6 Å resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å e 1.6 Å respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.
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Estudos estruturais do domínio GTPase isolado da septina humana SEPT4 e estrutura cristalográfica da Glutationa -S- Transferase de Xylella fastidiosa / Structural Studies of the GTPase domain from human SEPT4 and Crystallography Structure of Glutathione S-transferase from Xylella fastidiosa

Nathalia de Campos Rodrigues 31 October 2008 (has links)
As septinas constituem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeos de guanina e formação de heterofilamentos. Em mamíferos, tais proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como citocinese, exocitose e tráfego de vesículas. A SEPT4 tem sido identificada em depósitos filamentosos e inclusões citoplasmáticas em Alzheimer e doença de Parkinson, respectivamente. A SEPT4 é a única proteína em associação com proteínas aberrantes em depósitos em ambos os tipos de doenças Assim, estudos adicionais de propriedades bioquímicas estruturais e funções fisiológicas para a SEPT4 podem promover importantes insights em relação ao mecanismo das doenças neurodegenerativas citadas acima. O desenovelamento térmico do domínio GTPase do SEPT4-G revelou um intermediário que agrega rapidamente na forma de fibras tipo amilóide em condições fisiológicas. Neste estudo a análise cinética da agregação do SEPT4-G foi monitorada utilizando fluorescência extrínseca e dicroísmo circular. Com os resultados e análises realizados durante este trabalho de mestrado foi possível compreender com mais detalhes a cinética de formação de agregados tipo amilóide do domínio SEPT4-G. Este trabalho também descreve a cristalização, coleta de dados, resolução e refinamento do modelo cristalográfico para a enzima Glutationa-S-Transferase de Xylella fastidiosa. Tal enzima está associada à patogenicidade da bactéria X. fastidiosa, responsável por várias doenças em plantas economicamente importantes, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou Amarelinho. Algumas análises também foram realizadas após a obtenção do modelo cristalográfico demonstrando as diferenças estruturais entre GSTs bacterianas. / The septins are a conserved family of guanine nucleotides-binding and hetero-filament forming. proteins. In mammals they are involved in a variety of cellular processes, such as cytokinesis, exocytosis, and vesicle trafficking. SEPT4 has been reported to accumulate in tau-based filamentous deposits and cytoplasmic inclusions in Alzheimers and Parkinsons diseases respectively. Sept4 is unique in its association with the aberrant protein depositions in both types of diseases. Further studies on the biochemical, structural properties and physiological functions of Sept4 may therefore provide important insights into the common mechanism underlying diverse neurodegenerative disorders. Thermal unfolding of the GTPase domain of SEPT4 (SEPT4-G) revealed an unfolding intermediary which rapidly aggregates into amyloid-like fibers under physiological conditions. In this study, the kinetic analysis of aggregation of SEPT4-G was monitored using extrinsic fluorescence and circular dichroism spectroscopy. The aggregates have the ability to bind specific dyes such as Thioflavin-T (ThT), suggesting that they are amyloid in nature. Fibrils formation was monitored by the increase in ThT emission and electron microscopy as a function of temperature, pH, metal ions and protein concentration. Glutathione S-transferases (GSTs) form a group of multifunctional isoenzymes that catalyze the glutathione-dependent conjugation and reduction reactions involved in the cellular detoxification of xenobiotic and endobiotic compounds. GST from Xylella fastidiosa (XfGST) was crystallized by the vapour-diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for XfGST and others GSTs.
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Aspectos de biologia molecular, estrutural e funcional de adenina fosforribosiltransferase de Homo Sapiens e seu envolvimento na sindrome urolitíase / Functional, structural and molecular biology aspects of the adenine phosphorybosiltransferase from Homo sapiens and its involvement in the urolitiasis syndrome

Márcio Silva 03 June 2005 (has links)
Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

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