As galectinas, proteínas que compartilham características como afinidade por ?-galactosídeos e a presença de um domínio de reconhecimento ao carboidrato (CRD), tem como importante papel a decodificação de mensagens moleculares. As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos (CRD1 e CRD2) conectados por um peptídeo de ligação, ao qual pertencem as galectinas-4 e -12 humanas, alvos de nosso estudo. Durante o desenvolvimento do presente projeto foram utilizadas abordagens multidisciplinares através de técnicas biofísicas, cristalográficas, computacionais e imunoquímicas. Foi iniciado o estudo de caracterização estrutural da galectina-4 humana (hGal4) e seus domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2, de forma independente, através da produção heteróloga das proteínas e ensaios de estabilidade térmica e cristalização. As estruturas cristalográficas dos domínios foram determinadas a 1,48 e 2,46 Å de resolução, respectivamente e utilizadas para a construção de um modelo para a hGal4. Com base nos estudos de dinâmica molecular e estabilidade térmica foi possível propor um modelo de interação entre os CRDs através do peptídeo de ligação. Ensaios de dinâmica da hGal4 com LacNAc sugeriram uma diferença de plasticidade dos CRDs no reconhecimento do ligante. Foram também realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as isoformas e domínios da galectina-12 humana (hGal12). Como resultado, observamos uma alta tendência à formação de corpos de inclusão e agregados resistentes a desnaturação, além da susceptibilidade ao ataque proteolítico. Os modelos estruturais dos domínios da hGal12 não permitiram identificar nenhuma característica que justificasse o comportamento das proteínas. Foram realizados estudos de localização celular em células HL-60 e foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. A alta insolubilidade observada para as isoformas e domínios da hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e incluindo o fato de um dos CRDs não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar ?-galactosídeos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD2 poderia ter evoluído para favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento de futuros estudos funcionais. / Galectins are proteins that share characteristics such as affinity for ?-galactosides and the presence of a carbohydrate recognition domain (CRD). They belong to a family of proteins that display the important role of decoding molecular messages. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (CRD1 and CRD2) connected by a peptide linker, in which belong galectins-4 and -12, targets of our study. During the development of the present project a multidisciplinary approach was used including the use of biophysical, crystallographic, computational and immunochemical techniques. The structural characterization of human galectin-4 (hGal4) and its hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 independent domains was initiated by their heterologous protein production, thermal stability and crystallization assays. The crystallographic structure of domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively, and used for constructing a model for hGal4. Based on molecular dynamics and thermal stability studies we propose a model of interaction between CRDs mediated by linker peptide. Dynamics simulation of hGal4 with LacNAc suggested a difference in plasticity between CRDs and ligand recognition. In addition, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of isoforms and independent domains from human galectin-12 (hGal12). As result, we observed a high tendency to body inclusion formation and denaturing resistant aggregates, besides high susceptibility to proteolytic attack. Structural models for the hGal12 domains did not allow the identification of any feature to justify proteins behavior. Cell location studies in HL-60 cells were performed and hGal12 was found to be located on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. The high insolubility displayed by isoforms and domains from hGal12, together with its location on lipid droplets, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for ?-galactosides binding, suggest that hGal12 is, in fact, expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD2 could have evolved in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.

Tuberculose (TB) é um grave problema de saúde pública, sendo a segunda maior causa de morte entre doenças infecto contagiosas. Em 2014, 9,6 milhões de casos e, aproximadamente, 1,5 milhão de mortes foram reportados. O Programa Nacional de Controle da Tuberculose preconiza para o tratamento a administração simultânea de quatro medicamentos. Contudo, casos de tratamento inadequado favorecem o surgimento de cepas multirresistentes e extensivamente resistentes aos medicamentos disponíveis. Diante disso, torna-se urgente a necessidade de investigar novos alvos moleculares e desenvolver novos fármacos que sejam úteis e eficazes para o tratamento da infecção. As proteínas tirosina fosfatases (PTPs) constituem uma grande família de enzimas responsáveis pela hidrólise do fosfato ligado aos resíduos de tirosina em proteínas. A importância destas fosfatases reside no fato de estarem envolvidas na regulação de uma série de funções celulares, tais como crescimento, interação intercelular, metabolismo, transcrição, motilidade e resposta imune. A partir da análise do genoma do Mycabacteirum tuberculosis, foram identificadas duas proteínas tirosinas fosfatases (PtpA e PtpB), responsáveis pela sua sobrevivência nos macrófagos do hospedeiro. Ambas as enzimas têm sido exploradas como alvo molecular para o desenvolvimento de novos fármacos para a tuberculose. Nessa dissertação, as sequências gênicas que codificam para as enzimas PtpA e PtpB de M. tuberculosis foram clonadas com sucesso nos vetores de expressão. A expressão solúvel das proteínas permitiu o estabelecimento de um protocolo padronizado de purificação. Ensaios de cristalização foram conduzidos e cristais de proteínas obtidos tiveram os dados cristalográficos coletados. Para a enzima PtpB foi possível determinar a estrutura cristalográfica em alta resolução em complexo com um grupo fosfato no sítio catalítico. Essa estrutura foi então utilizada na etapa posterior de descoberta de novos candidatos a inibidores. Os trabalhos computacionais conduzidos incluíram uma combinação de estratégias para a identificação de pontos de interação relevantes para o processo de reconhecimento molecular e ligação bem como para a construção de modelos farmacofóricos 3D específicos para cada enzima. Esses dados foram utilizados para a seleção de um conjunto de 8 candidatos a inibidores da PtpA e 5 candidatos a inibidores da PtpB. Portanto, estudos de biologia molecular estrutural e química medicinal foram empregados com sucesso para o estabelecimento de uma plataforma produtiva dos alvos selecionados bem como para a seleção de novos candidatos a inibidores. / Tuberculosis (TB) is a serious public health problem and the second leading cause of death among infectious diseases. In 2014, 9.6 million cases, and approximately 1.5 million deaths were reported. The National Program for Tuberculosis Control recommends the simultaneous administration of four drugs as treatment for the disease. However, inadequate treatment determines the emergence of multidrug- and extensively-resistant strains to available drugs. Therefore, new molecular targets and drugs are urgently needed for the treatment of the infection. The protein tyrosine phosphatases (PTPs) are a large family of enzymes responsible for the hydrolysis of phosphate group bound to tyrosine residues in proteins. The importance of these molecules is related to the regulation of a number of cellular functions, including growth, intercellular interaction, metabolism, transcription, motility and immune response. Based on Mycabacteirum tuberculosis genome analysis, two protein tyrosine phosphatases (PTPA and PtpB) were related to mycobacterium survival in host macrophages. Both enzymes have been explored as a molecular target for the development of new drugs for TB. In this dissertation, the gene sequences encoding the enzymes PtpA and PtpB from M. tuberculosis were successfully cloned in expression vectors. The soluble expression of the proteins allowed the establishment of a standardized purification protocol. Crystallization assays were conducted, protein crystals were obtained, and crystallographic data were collected. We determine the crystallographic structure of PtpB in complex with a phosphate group in the catalytic site at high resolution. This structure was then used in the subsequent step for the discovery of new inhibitor candidates. Computational studies included a combination of strategies for identifying interaction points relevant to the process of molecular recognition and binding as well as the construction of 3D pharmacophore models specific for each enzyme. These data were used to select a set of 8 and 5 compounds as PtpA and PtpB inhibitor candidates, respectively. Therefore, structural molecular biology and medicinal chemistry studies have been successfully conducted for the establishment of a platform aimed to the production of the selected targets as well as for the selection of new inhibitor candidates.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 456553.pdf: 3406463 bytes, checksum: 401e17a9aecc3c36095588e483dd1282 (MD5) Previous issue date: 2014-03-12 / The causative agent of tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis, infects one-third of the world population. The World Health Organization estimates that 8.6 million new TB cases occurred in 2012, resulting in 1.3 million deaths worldwide. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents and to identify pathogenic determinants associated with M. tuberculosis virulence aiming the development of attenuated mutant strains as new vaccine candidates against TB. Enzymes involved in purine and pyrimidine biosynthesis have important roles in cellular metabolism, as they provide nucleotides that are essential components of a number of essential biomolecules. Cytidine deaminase (CDA) catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine to uridine, and belongs to the pyrimidine salvage pathway. The CDA from M. tuberculosis (MtCDA) is a target for the development of attenuated strains of M. tuberculosis because it may be involved in mechanisms of pathogenicity such as latency. This work presents the crystal structures of MtCDA in complex with uridine (2.4 ? resolution) and deoxyuridine (1.9 ? resolution). Molecular dynamics (MD) simulation was performed to analyze the physically relevant motions involved in the protein ligand recognition process, showing that structural flexibility of some residues are important to product binding. In addition, MD simulations allowed the analysis of the stability of tetrameric MtCDA structure. The role of the conserved glutamate-47 (E47) residue was evaluated by construction of five mutant proteins (E47A, E47D, E47L, E47H, and E47Q). Mutants E47A and E47H were expressed in insoluble fraction, whereas E47D, E47L and E47Q were soluble and purified by HPLC. The E47D, E47L and E47Q mutants contained 1 mol of Zn2+ per mol of protein subunit. These mutations had no effect on oligomerization state of MtCDA. Steady-state kinetic results showed that KM values for the E47D and E47Q mutants were not significantly altered, whereas there was a decrease in kcat values of 37-fold for E47D and 19-fold for E47Q mutant. No activity could be detected for E47L mutant. The crystal structure of the E47D mutant was solved by X-rays diffraction, using synchrotron light. An essential role was proposed for the ?-carboxyl group of E47, and its involvement in the catalityc process. On the other hand, an important part of drug and vaccine development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this way the knockout of the cdd gene was performed in order to evaluate the importance of the cdd gene for mycobacteria growth in vitro and in vivo. Our results suggest that cdd gene is not an essential gene for in vitro growth under the employed experimental conditions. Infection in mice with the knockout strain of cdd gene has shown a significant reduction in the CFU s in lungs and spleen of the infected animals. Futher experiments are under way to confirm such findings. Finally, results from enzymatic characterization, site directed mutagenesis and gene replacement may be the starting point for a better understanding about the role of cytidine deaminase in M. tuberculosis metabolism and open up the possibility for a rational design of attenuated strain, that may be useful for future development of a new vaccine candidate against human TB. / O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um ter?o da popula??o mundial. A Organiza??o Mundial da Sa?de estima que 8,6 milh?es de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milh?es de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade cont?nua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virul?ncia associados com a patog?nese de M. tuberculosis, visando a obten??o de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na bios?ntese de purina e pirimidina t?m pap?is importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucle?tidos, os quais s?o componentes essenciais de um grande n?mero de biomol?culas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desamina??o hidrol?tica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas. A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua n?o essencialidade pode ser um alvo interesante para a obten??o de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotr?ficas contra a tuberculose, j? que pode estar envolvido nos mecanismos de invas?o e lat?ncia. No presente trabalho s?o apresentadas as estruturas cristalogr?ficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 ? de resolu??o) e deoxiuridina (1,9 ? de resolu??o). Simula??o da Din?mica Molecular (MD) foi realizada com o prop?sito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento prote?na-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regi?es da prote?na s?o importantes para a liga??o do produto. Al?m disso, simula??es MD permitiram a an?lise da estabilidade da estrutura tetram?rica da MtCDA. O papel do res?duo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a constru??o de cinco prote?nas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fra??o insol?vel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fra??o sol?vel e purificadas por cromatografia l?quida de alta performance (HPLC). Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de prote?na. Estas muta??es n?o tiveram efeito sobre o estado de oligomeriza??o da MtCDA. Resultados cin?ticos em estado estacion?rio mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q n?o foram alterados significativamente, enquanto houve uma redu??o nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. N?o foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalogr?fica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catal?tico para o grupo ?-carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um pr?ton na cat?lise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos f?rmacos e vacinas, ? a identifica??o de produtos de genes que s?o fundamentais para o crescimento e a sobreviv?ncia bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a import?ncia deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condi??es de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd n?o ? um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condi??es experimentais utilizadas. Experimentos de infec??o em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redu??o nas UFC s determinadas no pulm?o e ba?o dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infec??o em camundongos est?o sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracteriza??o enzim?tica e substitui??o g?nica s?o o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleot?deos em M. tuberculosis, al?m de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, ?til para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana

Rosuvastatina cálcio é uma estatina sintética utilizada para tratar a hipercolesterolemia, inibindo a 3-hidroxil-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase. No Brasil, este fármaco é amplamente comercializado como comprimidos e cápsulas manipuladas. Contudo, não há nenhum método descrito em compêndios oficiais para as formas de dosagem mencionadas. O presente trabalho propôs o desenvolvimento e validação de métodos de análise quantitativa de rosuvastatina cálcica (cromatografia líquida de alta eficiência e espectrofotometria) e ensaios de dissolução (também realizados em meio biorrelevante) para as formas farmacêuticas cápsulas e comprimidos. Foi avaliado também a estabilidade de rosuvastatina cálcica e o impacto do polimorfismo na liberação deste fármaco em formulações de cápsulas. Os métodos de análise quantitativos não apresentaram diferença estatística para o nível de significância de 5%. No estudo de degradação forçada de rosuvastatina cálcica, foi observada sua instabilidade frente às degradações ácida e fotolítica, com caracterização dos produtos formados, seguido de aplicação do método em amostras reais. Diferentes formulações de liberação imediata produzidas com matéria-prima comercial (sólido amorfo) foram analisadas para o desenvolvimento do ensaio de dissolução, empregando a forma cristalina M de rosuvastatina cálcica. Esta forma foi recristalizada em nosso laboratório e mostrou uma menor solubilidade aquosa quando comparada com a forma amorfa. A formulação com esta forma cristalina mostrou uma taxa de dissolução lenta que demonstra o impacto do polimorfismo nesta molécula quando utilizada a forma farmacêutica cápsula. Além de identificar diferentes formas sólidas, o ensaio discriminativo desenvolvido permitiu distinguir formulações com diferentes composições de excipientes. Um ensaio de dissolução foi desenvolvido e validado para a forma farmacêutica comprimido. Este ensaio foi utilizado para comparar produtos similares em relação ao produto referência. Os resultados mostraram que há características de liberação semelhantes para dois dos três produtos similares, em comparação com o produto referência Crestor®. Um estudo empregou como meio biorrelevante leite em pH = 6,4 nas mesmas condições de aparato e rotação definidos para cápsulas e comprimidos no ensaio discriminativo. Os resultados mostraram que ambas as formas farmacêuticas avaliadas apresentaram a mesma especificação sugerida para o meio utilizando tampão fosfato pH = 6,8. Assim, os métodos desenvolvidos neste trabalho contribuem para avaliação da qualidade, segurança e eficácia terapêutica de rosuvastatina cálcica, além de ampliar os conhecimentos científicos relacionados a esta estatina. / Rosuvastatin calcium is a synthetic statin used to treat hypercholesterolemia, inhibiting 3-hydroxyl-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase. In Brazil, this drug is widely marketed as tablets and compounded capsules. However, there is no method described in official compendia for the mentioned dosage forms. This work proposed the development and validation of methods for quantitative analysis of rosuvastatin calcium (high performance liquid chromatography and spectrophotometry) and dissolution tests (also performed in biorelevant medium) for capsules and tablets forms. The stability of rosuvastatin calcium and the impact of polymorphism on the release of this drug in capsule formulations were also evaluated. The methods of quantitative analysis didn't present statistical difference for the significance level of 5% In the study of forced degradation of rouvastatin calcium, it was observed its instability against acid and photolytic degradations. The products of degradation generated by the stress conditions were characterized. After, the method was used in order to evaluate real samples. Different formulations for immediate release were produced with commercial raw material (amorphous solid). The obtained formulations were analyzed for the development of dissolution tests using the crystalline form M of rosuvastatin calcium. This form were recrystallized in our laboratory and showed a lower aqueous solubility when compared to the amorphous form. The formulation with this crystalline form also showed a slow dissolution rate that demonstrates the impact of the polymorphism on this molecule when prepared as capsule form. In addition to identifying different solid forms, the discriminant test developed was able to discriminate formulations with different compositions of excipients. A dissolution test was developed and validated for the tablets form. This method was used to comparasion of similar products related to the reference. The results proved that there is similar release characteristics for two of three similar products, in comparison with the reference product Crestor®. A study using milk at pH = 6.4, as biorelevant medium, was conducted by using the same apparatus and rotation conditions of the discriminatory assay. The results showed that both evaluated pharmaceutical forms presented the same specification suggested for the medium using phosphate buffer pH = 6.8. Thus, the developed methods contribute to quality, therapeutic safety and efficacy evaluation of rosuvastatin calcium, and to expand the scientific knowledge related to this statin.

O objetivo do presente trabalho é a elucidação da estrutura cristalográfica da proteína N-acetilglicosamina 6-fosfato desacetilase (desacetilase) da bactéria Escherichia coli. A desacetilase é um tetrãmero de subunidades idênticas de 382 aminoácidos e massa molecular de 41 kDa. Esta é uma enzima da via de catabolismo de açúcares aminados e cataliza a conversão do N-acetilglicosamina 6-fosfato em glicosamina 6-fosfato. Nesta via a bactéria dedica cinco genes organizados em um regulon, o nagE-nagBACD, com propósitos de obtenção de energia e de reciclagem de componentes de parede celular. A reciclagem de componentes de parede celular é a via de maior atividade metabólica de E. coli, na qual aproximadamente 40% dos peptidoglicanos de parede celular são quebrados a cada geração, sendo o N-acetilglicosamina (GlcNAc) reutilizado para a síntese de novo de peptidoglicanos e lipopolissacarídeos de membrana externa. O GlcNAc exerce funções multi-regulatórias na via de catabolismo de aminoaçúcares e a desacetilase é o maior fator controlador da sua concentração intracelular. Foi demonstrado que a desacetilase é a enzima mais importante da via e que sem ela a E. coli não é capaz de reciclar o GlcNAc. A desacetilase é encontrada em outros organismos desempenhando funções igualmente importantes, estando relacionada à captura e o armazenamento de carboidratos em hepatócitos e células sinusiais de fígado de camundongo, à morfogênese e à diminuição da patogenicidade e da adesão da Candida albicans a tecidos endoteliais, chegando também a ser estudada para desenvolvimento de inibidores contra o parasita da malária o Plasmodzum falciparum. Neste trabalho foram descritos os procedimentos desde a subclonagem do gene codificador da desacetilase de E. coli até a interpretação da sua estrutura quaternária, incluindo a expressão, a purificação, a cristalização, a produção de cristas derivados de átomos pesados, a estimativa de fases e a construção e refinamento do modelo cristalográfico. A estrutura foi resolvida por espalhamento anômalo de iodo de baixa resolução (2,9 angstron), em comprimento de onda único, sendo refinada a resolução de 2,0 angstron. Na unidade assimétrica encontram-se dois monômeros relacionados por um eixo de ordem 2 não cristalográfico aproximadamente a 15° da direção do eixo cristalográfico c. A simetria do cristal aplicada à unidade assimétrica leva a formação de um tetrâmero cuja área da superfície de tetramerização é de 5.343 angstron2, correspondente a 18,4% da área do dímero. A área de superfície de acessibilidade da interface dimerização é de 1.053 angstron2, correspondente a 6,8 % da área do monômero. O monômero da desacetilase é constituído por dois domínios: o beta, um pequeno sanduíche beta; e o alfa, um pseudo barril (beta/alfa)8 comum aos membros da super família da Amidohidrolases. O domínio-beta é constituído por duas folhas beta mistas e uma hélice alfa. O domínio- alfa é constituído por 11 hélices alfa e por três folhas beta, uma paralela e as outras duas anti paralelas. No domínio- beta, oito das onze hélices alfa formam ligações cruzadas com as oito fitas da folha beta paralela para formar o \"barril\" onde encontra-se o sítio ativo. No sitio ativo foi observada a presença de um íon fosfato. Os resíduos do sítio ativo que participam da ligação ao fosfato são Gln59, Glu131, His195, His216 e Asp273, dos quais pelo menos uma histidina e um ácido aspártico têm se conservado em membros da super família das Amidohidrolases / The goal of the present work is to elucidate the crystallographic structure of the protein N-acetylglucosamine Bphosphate deacetylase (deacetylase) from Escherichia coli. The deacetylase is a tetramer of identical subunits with 382 aminoacids and molecular weight of 41 kDa. It is an euzyme of the amino sugar catabolism pathway and it catalyzes the conversion of the N-acetylglucosamine Gphosphate in to glucosamine 6-phosphate. In this pathway the bacteria dedicates five genes organized in the nagE-nagBACD regulon for purposes of cell wall component recycling and energy production. The cell wall component recycling is the major E. coli metabolic pathway in which aproximately 40% of the cellular wall peptidoglicans is broken in each generation. Its degradation product, the amino sugar N-acetylglucosamine (GlcNAC) is reused for the peptidoglican and for the lipopolysacharide de novo synthesis. The GlcNAC plays several regulatory roles in the amino sugar catabolism pathway and deacetylase is its major intra cellular concentration controlling factos. It was demonstrated that without the deacetylase, E. coli is uncapable of recycling the GlcNAc. The deacetylase plays important roles in the other organisms in which it has been found. It is related to the carbohydrate up-take and storage in hepatocytes and sinusoidal cells from rat liver and to the Candida albicans morphogenesis, pathogenicity and adherence to the endothelial tissues. Deacetylase has also been studied in the development of inhibitors against the malaria parasite Plasmodzum falciparum. This work describes all the approaches from the nagA subcloning to the crystallographic structure analysis, including deacetylase expression, purification, crystallization, heavy atoms derivatives production, phasing, model building and model refinement. The E. coli deacetylase structure was solved by Single Anomalous Dispersion using low resolution (2,0 angstron) iodine anomalous scattering. The structure was refined to 2,0 angstron resolution. The contends of the asymmetric unit is a dimer related by a non-crystallographic 2-fold symmetry axis about 15° from the crystallographic axis c. The crystallographic symmetry applied to the asymmetric unit produces a tetramer, whose the surface accessibility of the buried area is 5.343 angstron, corresponding to 18.4 % of the dimer total area. The dimer surface accessibility of the buried area is 1.053 angstron2, corresponding to 6.8 % of the monomer total area. The deacetylase monomer folds into two domains, a pseudo (beta/alfa)8 barrel enclosing the catalytic site of the enzyme and a small beta sandwich made up from secondary structure elements contributed by the N and C termini. The beta domain is composed of two mixt beta sheets and one alfa helice. The alfa domain is composed of 11 alfa helices and 3 beta sheets, one of them parallel and the other two anti parallel. In the alfa domain, 8 alfa helices are cross linked to 8 beta strands to form the pseudo barrel which encloses the active site. A phosphate ion was found into the catalytic site. The catalytic residues that bind the phosphate ion are Gln59, Glu131, Hisl95, His216 and Asp273, from which at least one histidine and one aspartic acid are conserved amongst the Amidrohydrolases super family members

Os receptores nucleares são de suma importância para os processos de sinalização intercelular nos eucariotos, uma vez que possuem a capacidade de convergir diferentes sinais internos e externos na regulação de programas genéticos. Estas proteínas funcionam, na sua maioria, como fatores de transcrição ativados por ligantes, sendo a via de comunicação direta entre as moléculas de sinalização e a resposta transcricional eliciada pelas mesmas. A programação genética, estabilizada ou modificada pelos receptores, afeta virtualmente todos os aspectos da vida dos organismos multicelulares, tais como a embriogênese, a homeostase, a reprodução, o crescimento e a morte celular. A regulação transcricional e a seletividade promovida por estas proteínas têm fomentado intensas pesquisas, as quais estão decifrando a complexa rede de eventos moleculares que relatam sua forma de ação. Será um desafio para o futuro o conhecimento completo das regras moleculares que definem sua maneira de promover o controle espacial e temporal da expressão gênica. Estas informações prometem trazer detalhes cruciais para o desenvolvimento de drogas mais eficientes e de grande valor terapêutico. Neste contexto, o principal objetivo dos estudos aqui apresentados foi o de aumentar o conhecimento sobre o comportamento e estrutura do receptor nuclear humano dos hormônios tireoidianos, isoforma β1 (hTRβ1), e do receptor nuclear humano do ácido retinóico 9-cis, isoforma ? (hRXRα). Para tal, aplicou-se a técnica de espalhamento de raios X a baixos ângulos para determinar-se, em solução, o envelope destes receptores contendo os domínios de ligação ao DNA e ao ligante. Paralelamente, investiu-se em diversas tentativas de cristalização dos mesmos. Os resultados obtidos permitiram a determinação da localização espacial dos diferentes domínios e as organizações quaternárias dos homodímeros e homotetrâmeros. Conseqüentemente, foram propostos os primeiros modelos estruturais de receptores nucleares contendo os domínios de ligação ao DNA e ao ligante. O comportamento oligomérico, em solução, do hTRβ1 também foi analisado qualitativamente. Verificou-se que a formação do homodímero e do homotetrâmero é influenciada pela presença do hormônio T3, pela concentração protéica, pelos domínios presentes e por mutações específicas. Estes estudos geraram a hipótese de que o receptor nuclear hTRβ1 é capaz de se autoreprimir. Até então, dentro da superfamília dos receptores nucleares, esta capacidade de autorepressão somente havia sido descrita para o receptor hRXRα. Por fim, cristalizou-se o domínio LBD do receptor hTRβ1 com os ligantes T3, Triac e GC-1. O objetivo foi o de determinar estruturas cristalográficas importantes para o futuro desenvolvimento de tiromiméticos de ação isoforma-seletiva. / In eukaryotes, nuclear receptors are of major importance for intercellular signaling because they join different intra and extracellular signals during regulation of genetic programs. The great majority of these proteins function as ligand activated transcription factors providing a direct link between signaling molecules and the transcriptional responses elicited by them. The genetic programs that these receptors establish or modify affect virtually all aspects of the multicellular organisms? life, such as embryogenesis, homeostasis, reproduction, cell growth, and death. Their gene-regulatory power and selectivity has prompted intense research which is now starting to decipher the complex network of molecular events involved in transcription regulation. The future challenge will be to uncover the molecular rules that define spatial and temporal control of gene expression. Such knowledge would be essential to the development of more efficient drugs with better therapeutic values. Therefore, the main purpose in this study was to extend the understanding on the behavior and the structure of human thyroid receptor, isoform ?1 (hTRβ1), and human retinoic acid X receptor, isoform ? (hRXRα). It was applied the small angle X-ray scattering technique to determine, in solution, the envelop of both receptors containing DNA and ligand binding domains. Beside this, several crystallization conditions were tried for both receptors. The results made possible to define the spatial localization of the domains and the quaternary structure of the homodimers and homotetramers. Consequently, we were able to propose the first structural models for nuclear receptors containing the DNA and ligand binding domains. The oligomeric behavior of the hTRβ1, in solution, was also analyzed qualitatively. We verified that it was influenced by the presence of T3 hormone, the protein concentration, the presence of both DNA and ligand binding domains, and by specific mutations. Based on these results, we were able to hypothesize that the hTRβ1 has the capacity of autorepression. Up to now, only the hRXRα, in the whole nuclear receptor superfamily, had been described to behave similarly. Finally, we crystallized the ligand binding domain of the hTRβ1 in the presence of the ligands T3, Triac, and GC-1. The objective was to solve crystallographic structures essential for the future development of tiromimetics with isoform-selective action.

Resumo: Devido a contradições presentes na literatura quanto à natureza dos complexos dos metais do quarto período da tabela periódica com o ligante tris(2-hidroxietil)amina (trietanolamina) (TEAH3), uma reinvestigação foi feita consistindo na exploração das possibilidades do ligante em formar dímeros ou até polímeros com a propriedade de polimorfismo com sais dos metais de transição Co2+ e Cu2+. Com o metal representativo Zn2+, os compostos não apresentaram a propriedade de se cristalizarem em mais de uma estrutura cristalográfica distinta. Os complexos [MCl(TEAH2)] foram preparados a partir de misturas de soluções de MCl2 e TEAH3 em várias proporções, e os produtos foram caracterizados pela espectroscopia no infravermelho e difratometria de raios-X (em pó e em monocristal). Durante as tentativas de obtenção de monocristais dos complexos [MCl(TEAH2)] (M=Co, Cu, Zn) em álcool isoamílico, observou-se a oxidação inusitada do ligante TEAH2 coordenado, obtendo-se derivados de fórmula geral [M(bic)2] (M=Co, Cu, Zn). A determinação da estrutura molecular e cristalina do monocristal de [Cu(bic)2] obtido foi realizado pelo Prof. Dr. Carlos B. Pinheiro, da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) / Abstract: Due to contradictions in the literature as to the nature of the complexes of metals of the fourth period of the periodic table with the ligand tris(2- hydroxyethyl) amine (triethanolamine) (TEAH3), a reinvestigation was made consisting in exploring the possibilities of the ligand to form dimers or even polymers with the property of polymorphism with salts of transition metals Co2+ and Cu2+. With the metal representative Zn2+, the compounds did not show the property to crystallize in more than one different crystal structure. The complexs [MCl(TEAH2)] were prepared from mixtures of solution of MCl2 and TEAH3 in various proportions, and the products were characterized by infrared spectroscopy and X-ray diffraction (powder and single crystal). During attempts to obtain crystals of the complexes [MCl(TEAH2)] (M = Co, Cu, Zn) in isoamyl alcohol, was observed unusual oxidation of TEAH2 coordinated that yield derivatives of formula [M(bic)2] (M = Co, Cu, Zn). The determination of crystal and molecular structure of the single crystal of [Cu(bic)2] obtained was carried out by Professor. Dr. Carlos B. Pinheiro, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) / Orientador: Adelino Vieira de Godoy Netto / Coorientador: Stanlei Ivair Klein / Banca: Alexandre de Oliveira Legendre / Banca: Vinicius Caliman / Mestre

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-19. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:55:27Z : No. of bitstreams: 1 000864535_20161230.pdf: 356823 bytes, checksum: b1429fb38bc530053d5caf023608ebf0 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:58Z: 000864535_20161230.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:11Z : No. of bitstreams: 1 000864535.pdf: 3933353 bytes, checksum: 8bf44adf010cf6c18e755c884adcb9da (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) é o agente etiológico da linfadenite caseosa (CLA), uma doença que afeta diferentes grupos de animais em todo o mundo, especificamente áreas de produção de ovinos e caprinos, que causam perdas econômicas significativas. Estas bactérias podem infectar humanos, e 25 casos de infecções em humanos foram relatados na literatura. Atualmente, não há nenhum tratamento eficiente para esta doença e também não existem estruturas cristalográficas de proteínas de C. pseudotuberculosis que possam ajudar a compreender melhor o mecanismo de ação desse patógeno. No presente estudo, foram expressas e purificadas proteínas-chave que desempenham papéis importantes no metabolismo deste patógeno. Três proteínas de C. pseudotuberculosis foram expressas e purificadas. Triose fosfato isomerase (TIM) é uma enzima ativa da via glicolítica, sendo uma das principais enzimas envolvidas no fornecimento de energia para o organismo. Esta enzima foi expressa purificada e cristalizada. Tiorredoxina redutase (TrxR) e Tioredoxina (Trx) participam do sistema tioredoxina (redox), em que o Trx atua como um substrato para o TrxR. Estas enzimas têm diversas funções nos organismos. Estas enzimas foram expressas, purificadas e caracterizadas. A estrutura cristalográfica da TIM foi determinada a 2,5 Å. Proteínas de veneno de serpente, também foram investigados neste estudo, e cinco proteínas diferentes do gênero Bothrops foram purificados e cristalizadas. A estrutura cristalina da Atroxlysin-I foi determinada a 1,8 Å de resolução e foi comparada com diferentes metaloproteinases-I que foram depositados no PDB / Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) is the etiological agent of Caseous Lymphadenitis (CLA), a disease that affects different groups of animals worldwide, specifically sheep and goat production areas, which result a significant economic losses. These bacteria even infect humans; to date 25 different cases of infections in humans are reported in the literature. Currently, no efficient treatment for this disease is available neither a crystallographic structure of any protein from C. pseudotuberculosis that could assist in better understanding of the mechanism of action of this pathogen. In the present study, we have expressed and purified key proteins that play a major role in the metabolism of this pathogen. Plasmids of three different proteins from C. pseudotuberculosis were designed. Triose phosphate isomerase (TIM) is an active enzyme of glycolytic pathway, which is one of the main energy supplier enzymes for the organisms. This enzyme was expressed, purified and crystallized, the crystal structure was determined at 2.5 Å. Thioredoxin reductase (TrxR), and Thioredoxin (Trx) are the part of thioredoxin (redox) system, in which the thioredoxin act as a substrate for the TrxR. These enzymes have a diverse function in organisms. These enzymes were expressed, purified and characterized. Snake venom proteins were also investigated in this study; five different proteins from genus Bothrops were purified and crystallized. The crystal structure of Atroxlysin-I was determined at 1.8 Å resolutions and compared with different metalloproteinases-I, deposited to PDB

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard Charles Garrat / Banca: Antonio José da Costa Filho / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são de grande interesse científico, médico e social para o Brasil, visto que este gênero é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Dois dos principais componentes do veneno desses animais são as fosfolipases A2 e as serino proteases. As fosfolipases A2 são enzimas responsáveis pela destruição da membrana celular através da hidrólise de fosfolipídios Ca2+ dependente. Uma classe destas fosfolipases, as fosfolipases homólogas (Lys49-PLA2s), que se caracteriza pela uma substituição natural na posição 49 de um resíduo de Asp para um resíduo de Lys, não apresenta atividade catalítica, mas é capaz de induzir mionecrose por um mecanismo Ca2+ independente devido, provavelmente, à resíduos da região C-terminal. Neste trabalho, através de estudos por cristalografia de raios-X de Lys49-PLA2s botrópicas nativas e quimicamente modificadas pelo brometo de p-bromofenacila (BPB), revisamos a posição da Lys122 - anteriormente apontado como um dos responsáveis ela ausência da atividade catalítica das Lys49-PLA2s por conta da hiperpolarização que causaria na ligação peptídica Cys29/Gly30 - e concluímos que, por conta de esta hiperpolarização ocorrer apenas em alguns monômeros de Lys49-PLA2s complexadas, a Lys122 não deve estar envolvida no "bloqueio" da atividade catalítica. Além disso, a comparação estrutural do loop de ligação de Ca2+ entre as Lys49 e Asp49-PLA2s nos mostra a importância da conservação da Tyr28 dentre as Asp49-PLA2s para a integridade do loop de ligação do Ca2+. Este resíduo estabiliza essa região através de uma ponte de hidrogênio com a Gly35. Nas Lys49-PLA2s, que possuem um resíduo de Asn na posição 28, não ocorre a formação dessa ponte, o que contribuiria para a desestabilização dessa região nessas proteínas ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The snakes from Botrops genus are objects with great scientific, medical and social interesting since that these snakes are responsible of 90% of snakebites in our country. Two of the main components of the venom from these animals are the phospholipases A2 and the serine proteases. The phospholipases A2 are enzymes responsible of cellular membrane disruption through phospholipids hydrolysis Ca2+-dependent. A class of these phospholipases, the homolog phospholipases (Lys49-PLA2s) that underwent a natural substitution Lys to Asp substitution in 49 position, does not show catalytic activity. However, these proteins can perform myonecrosis by a Ca2+-independent mechanism probably, due to action of C-termini region residues. In this work, by x-ray crystallography studies with bothropic Lys49-PLA2s in native and chemically modified by p-bromophenacyl bromide (BPB) forms, we revised the position of Lys122, previously pointed as one of the responsibles of Lys49-PLA2s due to hiperpolarization of its side chain on Cys29/Cys30 peptide bond. Here, we conclude that this hiperpolarization are present only in a few monomers and thus, Lys122 may not be involved in the "blocking" of catalytic activity. Furthermore, structural comparisons of Ca2+ binding loop between Lys49 and Asp49-PLA2s revels the importance of the Tyr28 residue conservation to the integrity of this region. This residue stabilizes the Ca2+ binding loop by a hydrogen bond to Gly35. In Lys49-PLA2s that have an Asn residue in 28 position, does not occur the formation of this bond, contributing to unstabilization of this region and difficulting the binding of Ca2+ cofactor. Phylogenetic studies showed that Asp49- PLA2s with reduced catalytic inactivity and capable to induce myonecrosis are phylogenetic more related to Lys49-PLA2s than to others Asp49-PLA2s, forming a ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Cirano Rocha Leite / Banca: José Barbosa de Madureira Filho / Banca: Max Brandt Neto / Banca: Nilso Barelli / Banca: Regina Helena de Almeida Santos / Resumo: As zeólitas constituem um grupo de materiais naturais ou sintéticos que se prestam aos mais diversos usos tecnológicos . Suas propriedades únicas fizeram destes materiais uns dos mais estudados nas últimas décadas. Há muito se reconhece a importância deste grupo de minerais para a compreensão dos processos associados à gênese de alguns tipos de rochas, inicialmente das rochas vulcânicas (FRANCO, 1952) e pouco depois de algumas rochas sedimentares (COOMBS et al., 1959)...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor