Septinas constituem uma família conservada de proteínas de citoesqueleto pertencentes à superclasse das P-loop GTPases. Tais proteínas estão envolvidas em vários processos celulares. Em humanos, algumas septinas também estão relacionadas a casos de patologia. Suas seqüências são divididas em três domínios: domínio N-terminal, domínio GTPase e domínio C-terminal, que geralmente possui predição de coiled coil. A principal característica da família está na capacidade de seus membros formarem filamentos compostos por septinas diferentes. Em 2007, Sirajuddin et al apresentaram a primeira e única estrutura cristalográfica de um complexo de septinas, formado pelas septinas 2, 6 e 7. Embora os domínios C-terminal estivessem presentes, eles não apresentaram densidade eletrônica. Assim, a estrutura não trouxe informação estrutural sobre tais domínios. Atualmente, existem quatro estruturas de septinas depositadas no PDB: complexo 2/6/7 e três estruturas SEPT2 sem o C-terminal. Dada a inexistência de informações estruturais a nível atômico para os domínios C-terminal e baixa qualidade das poucas estruturas existentes, propusemos a obtenção de informações bioquímicas e estruturais dos domínios C-terminal de septinas humanas e a obtenção da estrutura cristalográfica de SEPT3-GC (GTPase mais C-terminal). Vale ressaltar que SEPT3 pertence ao único grupo de septinas que possui predição de não apresentar um coiled coil no C-terminal e para o qual não há nenhuma estrutura disponível. Expressamos e purificamos os domínios C-terminal de SEPT2, SEPT6 e SEPT7 (SEPT2-C, SEPT6-C e SEPT7-C). Mostramos que eles formam homo dímeros e que SEPT6-C e SEPT7-C formam um hetero dímero (KD 15,8 nM), nomeado por SEPT67-C. Tanto SEPT6-C quanto SEPT7-C tendem a precipitar, ao passo que SEPT67-C e SEPT2-C (KD 4 μM) são estáveis à altas concentrações. Tentamos, sem sucesso, cristalizar SEPT2-C e SEPT67-C. Via ressonância magnética nuclear, vimos que SEPT2-C possui duas regiões dinamicamente diferentes, uma central, em α-hélice, e duas extremidades desestruturadas. Neste ponto, planejamos construções para as regiões centrais dos domínios C-terminal, nomeadas SEPT2-CC, SEPT4-CC, SEPT6-CC e SEPT7-CC, referente às septinas 2, 4, 6 e 7. Obtivemos cristais para SEPT2-CC, SEPT4-CC e SEPT6-CC. Contudo, resolvemos apenas a estrutura de SEPT4-CC, mostrando que a construção forma um coiled coil anti-paralelo. Então, propusemos, pela primeira vez, um possível mecanismo de formação de ligações cruzadas entre filamentos de septinas. Por outro lado, obtivemos cristais para uma construção contendo os domínios GTPase e C-terminal de SEPT3 (SEPT3-GC) e resolvemos sua estrutura (2,9 Å). Vimos que SEPT3-GC forma filamentos no cristal, utilizando as mesmas duas interfaces já descritas anteriormente para as outras estruturas. Comparamos a estrutura obtida com estruturas da literatura e observamos diferenças significativas em algumas regiões, além de diferença em relação à orientação das duas subunidades adjacentes. Deve ser notado que a estrutura de SEPT4-CC é a primeira estrutura de um coiled coil de septina e que a estrutura de SEPT3-GC é a primeira estrutura de uma septina do grupo I. Em conclusão, o presente trabalho apresentou um conjunto de resultados os quais auxiliará no entendimento desta intrigante família de proteínas, inclusive em relação à formação de filamentos e as interações entre estes. / Septins are a conserved family of cytoskeletal proteins belonging to the superclass of the Ploop-GTPases, involved in various cellular processes. In humans, some septins are also linked to cases of pathology. Their sequences are divided into three domains: an N-terminal domain, a GTPase domain and a C-terminal domain, which usually is predicted to form a coiled coil. The main feature of the family is the ability of its members to form filaments composed of different septins. In 2007, Sirajuddin et al presented the first and only crystal structure of acomplex of septins, formed by septins 2, 6 and 7. Although the C-terminal domains were present, they showed no electron density, indicating disorder. Thus, this structure provides little structural information concerning their nature. Currently, there are four septin structures deposited in the PDB: the 2/6/7 complex and three structures of SEPT2 lacking the Cterminal domain . Based on the absence of structural information at atomic resolution about the C-terminal domains and the low quality of the few existing structures we set out to characterize both biochemically and structurally the C-terminal domains of selected human septins as well as to obtain the crystal structure of SEPT3-GC (a construct containing the GTPase and C-terminal domains). It is noteworthy that SEPT3 belongs to the only group of septins that are predicted to lack the C-terminal coiled coil and for which no crystal structure is available. We have expressed and purified the C-terminal domains of SEPT2, SEPT6 and SEPT7 (SEPT2-C, SEPT6-C and SEPT7-C). We show that they form homo-dimers and that SEPT6-C and SEPT7-C form a hetero-dimer (KD 15.8 nM), SEPT67-C. Both SEPT6-C and SEPT7-C were unstable, but SEPT67-C and SEPT2-C (KD 4 μM) were both stable at high concentrations. NMR measurements showed that SEPT2-C has two dynamically different regions, a central one which is -helical, and two extremities which are unstructured. Constructs were designed for the central regions of the C-terminal domains of septins 2, 4, 6 and 7 (SEPT2-CC, SEPT4-CC, SEPT6-CC and SEPT7-CC). We have obtained crystals of SEPT2-CC, SEPT4-CC and SEPT6-CC and have solved the structure of SEPT4-CC which unexpectedly is observed to form an anti-parallel coiled coil. We use this observation to propose, for the first time, a possible mechanism for the formation of cross-links between septin filaments. Crystals were obtained for SEPT3-GC its structure solved at 2.9 Å. We observe that SEPT3-GC forms filaments in the crystal, employing the same two interfaces previously described for other structures. We compare the structure obtained with those from the literature and observe significant differences in some regions of the molecule as well as differences in the relative orientation of the subunits. It should be noted that the structure of SEPT4-CC is the first structure of a septin coiled coil and that the structure of SEPT3-GC is the first structure of a septin from group I. In conclusion, this study presentsm results which will assist in the understanding of this intriguing protein family, including observations pertinent to filament formation and cross-linking.

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

A fosforribosilpirofosfato sintase de cana-de-açúcar [sPRS] (EC: 2.7.6.1) é uma enzima de central importância em muitas vias metabólicas envolvida na produção do 5-fosforribosil-1-pirofostato [PRPP] a partir da ribose-5-fosfato [R5F]. O gene da sPRS, seqüenciado como parte do projeto SUCEST, codifica para uma proteína com 328 aminoácidos e massa molecular 36,6 KDa. Essa proteína, após expressa heterologamente em Escherichia coli e purificada, foi cristalizada e submetida a experimentos de difração de raios X. A partir dos métodos cristalográficos e da modelagem por homologia pôde-se construir um modelo tridimensional. Cada subunidade da unidade biológica homohexamérica da sPRS correlaciona-se simetricamente com as demais através de um eixo de ordem 2 perpendicular a outro de ordem 3, formando uma simetria pontual 32. Experimentos de atividade enzimática para a sPRS indicam independência da sua atividade catalítica ao íon fosfato. Através do estudo comparativo entre a sPRS e sua homóloga fosforribosilpirofosfato sintetase de Bacillus subtillis [bPRS] (fosfato dependente) pudemos identificar similaridades estruturais na região do sítio catalítico e significativas diferenças no sítio alostérico. Os resultados revelam que essas diferenças estruturais na região do sítio alostérico são consistentes com a diferença funcional observada, sendo um importante passo rumo a compreensão da correlação estrutura-atividade para a sPRS fosfato independente. / The sugarcane phosphoribosylpyrophosphate synthase [sPRS] (EC:2.7.6.1) is an enzyme of central importance in severa1 pathways in all cells and produce the 5-phosporybosyl-1-pyrophosphate [PRPP] from the ribose-5-phosphate [R5F]. The gene of the sPRS was sequenced as part of the SUCEST project, encodes to 328 aminoacid protein with a molecular weight of 36,6 KDa. After being expressed in Escherichia coli and purified, the sPRS enzyme was crystallized and diffraction experiments were undertaken. From crystallographic methods and molecular modeling the tri-dimensional model was built. Each subunit of the sPRS homo-hexameric biological unit is symmetrically connected to the others through a 2-fold axis perpendicular to another 3-fold axis forming a 32 point symmetry. The sPRS enzyme activity assay indicates its independence of the presence of the phosphate ion. Through the comparative studies between the sPRS and the homologue from Bacillus subtillis phosphoribosyl pyrophosphate synthetase [bPRS] (phosphate dependent) we were able to identify structural similarities on the catalytic site and insightful differences on the allosteric site. These results show that structural differences in the allosteric site are consistent with functional difference observed and are an important step toward structure-activity comprehension for sPRS phosphate independent.

O atual crescimento do número de estruturas tridimensionais de proteínas está produzindo um banco de dados de estruturas que é muito útil como ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas relevantes do ponto de vista médico tais como drogas e vacinas. Neste trabalho, parte do projeto de desenvolvimento de novas drogas contra a doença do sono foi feita baseada nos estudos cristalográficos de ligação de compostos e de modelagem molecular de duas enzimas glicolíticas presentes no glicossomo de T. brucei. Como o alvo para novas drogas e o ciclo de glicólise, o qual também é presente nos seres humanos, o novo ligante deve ser seletivo. Frutose-1,6-bisfosfato aldolase (ALDO) é uma das proteínas alvo para o desenho racional de drogas. A análise estrutural e estudos cristalográficos da ALDO de T. brucei foram feitos, através do uso de proteína produzida em grandes quantidades por via recombinante. Vários possíveis sítios de seletividade foram encontrados em ALDO de T. brucei quando comparada as três seqüências das isoenzimas humana, tendo como base a estrutura tridimensional da isoenzima ALDO A. O braço flexível da região C-terminal é um forte alvo para compostos seletivos devido a não-conservação das seqüências. Cristais foram crescidos e padrões de difração de raios-X foram obtidos até 3.0&#197, mas ainda os cristais são pequenos e mostram-se sensíveis a radiação. Triosefosato isomerase (TIM) é outra ptoteína alvo analisada neste trabalho. A estrutura da TIM de T. brucei é conhecida a alta resolução. Cristais de proteína expressa em bactérias foram obtidos após extensivos experimentos. Foi identificado que usar proteína recentemente preparada é essencial para obter cristais que apresentem boa qualidade de difração. Depois de obtidos cristais de proteína expressa em grades quantidades, foram feitos experimentos de difusão de novos inibidores, coleta de dados de difração e análises das estruturas dos possíveis complexos. A conhecida estrutura em volta flexível da TIM fecha quando se liga o substrato ou um inibidor análogo ao substrato no sítio ativo. Desenho racional de drogas tem sido seguido usando como padrão a conformação fechada da estrutura em volta. No entanto, com a obtenção de um novo complexo, no qual a estrutura em volta adota a conformação aberta foi feita uma busca de novos compostos em bancos de dados, que não fossem derivados de fosfatos e fosfoantos, através do programa DOCK. Com este procedimento são propostos novos compostos guia os quais serão utilizados no ciclo do desenho racional de drogas. A estrutura da triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus que apresenta estabilidade térmica em complexo com o inibidor competitivo 2PG foi determinada por cristalografia de raios-X à resolução de 2.8&#197. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o programa XPLOR. Promediação da densidade eletrônica de ordem dois e nivelamento do solvente foram aplicados para melhorar a qualidade do mapa. Ambos os sítios ativos estavam ocupados pelo inibidor e a estrutura emvolta flexível adota a conformação fechada em ambas as subunidades. O fator cristalográfico R é de 17,6% com boa geometria. Bacillus stearothermophillus é considerado um organismo de estabilidade térmica moderada. Encontram-se disponíveis cinco estruturas de triosefosfato isomerase de organismos mesofílicos. A estrutura obtida neste trabalho é a primeira TIM reportada que apresenta estabilidade térmica. Vários artigos têm listados fatores de estabilidade térmica, os quais foram analisados em todas as estruturas de TIM disponíveis. Neste trabalho foi conduzida uma comparação entre a estrutura termofílica e as mesofílicas disponíveis, da qual se concluiu que a interação hidrofóbica na formação do dímero, e o alto número de prolinas são os mais importantes fatores que contribuem para a estabilidade térmica da TIM de B.stearothermophilus. Também concluiu-se que a razão Arg/(arg+Lys) é elevada em TIM de B. stearothermophilus mais devido ao baixo número de lisinas do que a um alto número de argininas. Analisou-se as argininas na TIM de B. stearothermophilus como também as interações das argininas e lisinas em todas as outras estruturas de TIM e não foi possível relacionar o valor aumentado da razão Arg/(arg+Lys) com a estabilidade térmica, fator este indicado anteriormente como importante para a estabilidade térmica / The current growth in the number of known 3-dimensional proteins structures is producing a database of structures that is very useful as starting point for the development of new medically relevant molecules such as drugs and vaccines. In this work part of the project of developing new drugs against the sleeping sickness has been done based on crystallographic, ligand-binding and molecular modeling studies of two glycolytic glycosomal enzymes from T. brucei. As the target for new drugs is the glycolysis pathway, which is present also in the human being, the new ligand must be selective. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase (ALDO) is one of the target protein for the rational drug design. The structural analysis and crystallographic studies of ALDO from T. brucei have been done, from overexpressed protein. Several possible sites for selective inhibitor were found in T. brucei ALDO when compared with the three human isoenzyme sequences, based on the human ALDO A structure. The flexible C-terminal arm is a promising target for selective compounds, due to the non-conserved sequence. Crystals were grown, and X-ray diffraction was obtained up to 3.0&#197, but still the crystals are small and show radiation damage. Triosephosphate isomerase (TIM) is the other target protein analyzed in this work. The structure of TIM from T. brucei is already known at high resolution. Crystals from overexpressed protein were obtained after extensive experiments. It was identified that the use of fresh protein is essential to grow good diffracting crystals. After obtaining crystals from overexpressed protein, it has been done soaking of new inhibitors, diffraction data collection and analysis of the structures of the possible complexes. The well known flexible loop in TIM closes upon the binding of either the substrate or an inhibitor analogue to the substrate in the active site. Rational drug design has been followed based on the \"closed\" conformation of the flexible loop. Nevertheless, with a new complex structure, in which the flexible loop adopts the \"open\" conformation, it has been done a search for new compounds in the database, non-derived from phosphate and phosphonate, through the program DOCK. Based on this procedure it was proposed new lead compounds which will be used on the rational drug design cycle. The structure of the thermostable triosephosphate isomerase from Bacillus stearothermophilus in complex with the competitive inhibitor 2PG was determined by X-ray crystallography to a resolution of 2.8&#197. The structure was solved by molecular replacement using XPLOR. Two fold averaging and solvent flattening were applied to improve the quality of the map. Both of the active sites were occupied by the inhibitor and the flexible loop adopts the \"close\" conformation in both subunits. The crystallographic R-factor is 17.6% with good geometry. Bacillus stearothermophilus is considered a moderate thermophile organism. There are already five triosephosphate isomerase structures available from mesophilic organisms. The structure reported here is the first thermostable TIM reported. It has been conducted in this work a comparison between the thermophilic and the mesophilic protein structures available. Several reports had listed thermostable factors, which have been analyzed in all TIM structures available, from which it has been concluded that the hydrophobic interaction upon the dimmer formation and the higher number of proline residues are the most important factors that contribute to the thermostability of B. stearothermophilus TIM. Also it has been concluded that the ratio Arg/(Arg+Lys) is increased in B. stearothermophilus TIM more due to lower number of lysine instead of a higher number of arginine residues. Arginines have been analyze in B. s,tearothermophillis TIM as well as the interactions of arginines and lysines in all other TIM structures and it has not been possible to relate the increased ratio Arg/(Arg+Lys) with thermo stability, which was previously reported as important in thermostability

Um dos maiores problemas encontrados em terapias anti-retrovirais contra AIDS é a emergência de variantes virais que exibem resistência aos fármacos disponíveis e subtiposvirais naturalmente mais suscetíveis ao desenvolvimento de falha terapêutica. Neste trabalho nós resolvemos as estruturas cristalográficas de quatro proteases de HIV-1 complexadas com o inibidor universal C2 simétrico TL-3. As proteases utilizadas foram extraídas de pacientes com AIDS, uma do subtipo B selvagem (Bwt), uma do subtipo F selvagem (Fwt), e um mutante de cada um dos subtipos (Bmut e Fmut), esses dois últimos de pacientes apresentando falha terapêutica. As proteínas foram produzidas por expressão heteróloga em bactérias Escherichia coli, purificadas à partir das proteínas dos corpos de inclusão, e reenoveladas. Os dados coletados foram processados à uma resolução de 2.1 A para o complexo Bwt:TL-3, 1.75 A para Bmut:TL-3, 2.1 A para Fwt:TL-3 e 2.8 A para Fmut:TL-3. Esses dados foram inicialmente processados em P6122 e, posteriormente, reprocessados em P6i. As estruturas foram resolvidas por substituição molecular utilizando a estrutura de uma protease de HIV-1 publicada como modelo. A análise dessas quatro estruturas mostrou que o inibidor TL-3 liga-se de maneira muito próxima em todas elas. Nas proteases Bmut e Fmut a mutação V82A causa um reempacotamento do bolsão SI\', que se reflete num rearranjo da cadeia lateral do inibidor em Pl\'. Nossas análises indicaram, ainda, que algumas substituições polimórficas entre os subtipos B e F podem levar à maior estabilização de regiões naturalmente flexíveis nas proteases do subtipo F, originando uma enzima intrinsicamente menos ativa e resistente à alguns inibidores. Nas proteases Fwt e Fmut, a substituição polimorfica M36I causa um deslocamento do loop entre os resíduos 35-41, que levaria à perda de flexibilidade dos fiaps e do loop 76-83 no sítio ativo. Nossas comparações indicaram também que a substituição L89M nos subtipos não B pode ser equivalente à mutação de resistência L90M em subtipos B. Por fim, esses dados estruturais nos permitiram sugerir modificações na estrutura do inibidor TL-3 que poderiam levar à um aumento da sua potência. Nesta tese também apresentamos os dados de resolução e análise estruturais da L-asparaginase de Escherichia coli, resolvida à uma resolução de 1.95 A no grupo espacial C2. Baseados em dados estruturais e cinéticos propusemos um mecanísmo de reação geral para as amidohidrolases, que incluem as L-asparaginases, através da formação de duas tríades catalíticas Thr-Tyr-Glu e Thr-Lys-Asp, envolvendo as duas treoninas no sítio ativo. Nossas análises do volume da cavidade catalítica de três amidohidrolases também indicam que o aumento da atividade L-glutaminase em algumas enzimas é diretamente proporcional ao aumento do volume dessa cavidade. / One of the major problems faced in antiviral therapy against AIDS is the emergence of viral variants that exhibit drug resistance, as well as viral subtypes naturally more liable to development of therapeutic failure. In this work we solved the crystal structure of four HIV-1 proteases complexed with the universal C2 symmetry-based inhibitor TL-3. These proteases where obtained from patients with AIDS: one of the subtype B wild type (Bwt), one of the subtype F wild type (Fwt), and a mutant of each subtype (Bmut and Fmut), these last two out of patients showing therapeutic failure. The proteins were produced by Escherichia coli bacteria heterologous expression, purified out of the inclusion bodies, and refolded. The collected diffraction data were processed to 2.1 A resolution for the Bwt:TL-3 complex, 1.75 A for Bmut:TL-3, 2.1 A for Fwt:TL-3 and 2.8 A for Fmut:TL-3. These data were initially processed in the P6122 space group and latter reprocessed in P6i. The four structures were solved by molecular replacement using a published HIV-1 protease structure as a model. The structural analysis shown that the TL-3 inhibitor binds in a similar fashion in the active site of all four structures. On the proteases Bmut and Fmut the mutation V82A causes a repacking of the SI\' pocket which rerranges the inhibitor\'s side chain at P1\' subsite. Our analysis further indicate that some polymorphic substitutions between subtypes B and F could lead to a stabilization of naturally flexible regions on subtype F proteases, creating a intrinsically less active resistant enzyme. On the proteases Fwt and Fmut the polymorphic substitution M36I leads to the displacement of the loop between residues 35-41, which would cause a flexibility loss of the flaps and of the loop 76-83 in the active site. Our comparisons further indicate that the polymorphic substitution L89M on non-B subtypes could be equivalent to the L90M resistance mutation on subtype B proteases. Lastly, based on these structural data we were able to suggest a few structural modifications on the TL-3 inhibitor that could furnish a more potent inhibitor. On this thesis we also present the data of structural solution and analysis of the Escherichia coli L-asparaginase solved at 1.95 A resolution in C2 space group. Based on structural and kinetical data we proposed a general reaction mechanism for amidohidrolases, which include L-asparaginases, involving the formation of two catalytic triads Thr-Tyr-Glu and Thr-Lys-Asp, which acounts for the two threonines in the active site. Our cavity volume analysis of three amidohidrolases also indicate that the increasing in the L-glutaminase activity in some enzimes is directly proportional to the increase in the cavity volume.

A doença do sono é causada pelo parasita Tripanosoma brucei. Considerada uma doença negligenciada, mata milhares de pessoas todos os anos na África subsaariana. O T.brucei não apresenta resposta imune pronunciada, o que dificulta o desenvolvimento de vacinas, e os medicamentos disponíveis são escassos. Os tripanossomatídeos são comprovadamente sensíveis ao stress oxidativo causado pelo radical superóxido. Assim, as enzimas superóxido dismutases (SODs) são a primeira linha de defesa contra esse radical. As SODs são metalo enzimas (EC 1.5.1.1) capazes de catalisar a dismutação do superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. São classificadas de acordo com o metal incorporado na estrutura: cobre e zinco (CuZnSOD), ferro ou manganês (Fe/MnSOD) e níquel (NiSODs). Neste trabalho de mestrado, a enzima TbFeSODB2 de T.brucei foi, expressa, purificada, cristalizada e teve sua estrutura resolvida. A estrutura cristalográfica da enzima do parasita foi comparada com a enzima humana análoga contendo manganês (HuMnSOD), onde foram evidenciadas as principais diferenças entre as duas estruturas que podem ser exploradas para o desenho do novos inibidores seletivos. Foi realizada uma análise de acoplamento estatístico, onde com base em um alinhamento múltiplo dessas enzimas determinou-se resíduos que são capazes de interferir na seletividade do metal incorporado e estado oligomérico das SODs. / Sleeping sickness, caused by the parasite Tripanosoma brucei, is considered a neglected disease, killing thousands of people every year in subsaharian Africa. T. brucei does not generate a pronounced immune response, difficulting the development of vaccines. Furthermore, available medicines are scarce. Tripanosomatides are known to be sensitive to oxidative stress caused by the superoxide radical. Therefore, the superoxide dismutase enzymes (SODs) are a primary line of defence for the parasites against this radical. SODs are metalloenzymes (EC 1.5.1.1) capable of catalyzing superoxide dismutation into molecular oxygen and hydrogen peroxide. SODs are classified according to the incorporated metal: copper/zinc (CuZnSOD), iron/manganese (Fe or MnSOD) and nickel (NiSODs). In the work presented here, TbFeSODB2 from T. brucei was expressed, purified, crystallized and its 3D structure solved. The crystal structure of the parasite enzyme was compared to the homologous human enzyme containing manganese (HuMnSOD), revealing evidence for differences between both structures which could be exploited in the design of new selective inhibitors. In addition, a statistical coupling analysis was performed on the entire Fe/MnSOD superfamily, based on a multiple sequence alignment. It was shown that this technique was able to identify novel residue determinants of metal selectivity and oligomeric state.

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.

Na presente tese, são apresentados estudos de microscopia óptica e RMN em mesofases liotrópicas colestéricas, obtidas a partir da inclusão de novos indutores (L - SORBOSE, diacetona - L - sorbose, DAS, e diacetona - 2 - ceto - L - gulonato de potássio, DGK) em sistemas nemáticos do tipo II ou N-D , baseados em diversos anfifílicos. Utilizando técnicas de microscopia óptica sob luz polarizada, constatou-se a distorção do arranjo helicoidal devido à competição entre a orientação por parede e o poder de torção dos indutores. Para determinar o sentido de torção (helicidade) da mesofase foram adaptados métodos aplicados a termotrópicos. Verificou-se que a configuração absoluta do indutor deve ter um papel importante apenas quando este se aloja predominantemente na porção aquosa. Indutores hidrofóbicos apresentam sempre a mesma helicidade (sentido de torção) em diferentes sistemas, uma vez que o ambiente parafínico intra-micelar é essencialmente o mesmo. Por outro lado, indutores hidrofílicos ou hidrofóbicos capazes de fortes interações com a d.c.e. originam mesofases cuja helicidade pode ser alterada por mudanças na distribuição de cargas na superfície micelar. Através da inclusão de laurato de potássio e cloreto de decilamônio perdeuterados em suas respectivas mesofases, obteve-se, por meio da RMN de deutério a 15,3 MHz, os perfís de ordem para os sistemas colestéricos baseados nos tres indutores citados. Os resultados permitem apontar que a sorbose se aloja predominantemente na porção aquosa e o DGK na porção hidrocarbônica. O DAS se aloja dentro da micela em mesofases de laurato de potássio e fora em mesofases de cloreto de decilamônio. Ainda com o emprego da RMN, foi possível seguir o comportamento dos indutores DAS e DGK em diferentes mesofases através da substituição da acetona ligada às posições 4,6 por acetona perdeuterada. No caso do DGK, observaram-se dubletes distintos para os dois metilas em todas as mesofases. O DAS teve comportamento análogo, exceto em mesofases baseadas em decilsulfato de sódio, onde os metilas apresentaram equivalência. Neste caso, verificou-se a alteração da colestericidade do sistema quando o íon sódio é substituido por césio. O ordenamento desta espécie pôde ser acompanhado pelo desdobramento quadrupolar através da RMN de césio - 133 a 13,1 MHz. Analisando as relações entre os desdobramentos quadrupolares dos dois grupos metilas deuterados, no DAS e no DGK, pode-se constatar que o ancoramento destas espécies é diferente nos diversos sistemas investigados. Estas relações correspondem, também, a uma avaliação do poder de torção destes indutores. / In the present thesis, studies on optical microscopy and NMR in cholesteric lyotropic mesophases are reported. These phases were obtained through the addition of new cholesteric inducers (L - SORBOSE, diacetone - L - sorbose, DAS, and potassium diacetone - 2 - keto - L - gulonate, DGK) to nematic type II or N-D systems. By using polarizing microscopy it was observed a distortion of the helical array due to a competition involving orientational wall effects and the inducers twisting power. Methods used for thermotropic cholesteric twisting sense (helicity) determination were adapted for lyotropic systems. The inducer absolute configuration plays an important role only when it remains predominantly in the aqueous portion. Hydrophobic inducers added to different systems, lead to the same helicity, since the paraffinic intra-micellar environment is essentialy the same. By the other hand, hydrophylic or hydrophobic inducers subjected to strong interactions with the e.d.l., will originate cholesteric mesophases whose helicity can be rnodified by changes on the charge distribution of the micellar surface. By including perdeuterated potassium laurate and decylammoniurn chloride in their respective mesophases, it was posible to obtain, by deuterium NMR technics, at 15.3 MHz, order profiles of cholesteric systems including these new inducers. The results point out that SORBOSE remains predominantly at the aqueous portion and DGK on the hydrocarbonic cornpartment. The DAS molecule remains inside the micelle, in potassium laurate mesophases, and outside the micelle, in decylammonium chloride systems. Using deuterium NMR, it was possible to follow the behaviour of DAS and DGK inducers, by substitution of the acetone bonded to 4,6 position for perdeuterated acetone. In the case of DGK, distinct doublets were assigned for each methyl group in all mesophases. For DAS case, the same behaviour was observed, except for sodium decylsulphate mesophases, where both methyl groups were equivalent. For this inducer a change of cholesteric properties were observed when the sodium ion was exchanged for cesium ion. The order in these systems was additionally followed by 133-cesium NMR at 13.1 MHz. By analising the relationship between the quadrupolar splittings of the deuterated methyl groups, in DAS and DGK, it was verified that there are changes in the inducer anchoring for different mesophases. These relationships correspond, also, to an evaluation of the inducer twisting power.