Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-26T13:43:50Z No. of bitstreams: 1 TeseMASF.pdf: 3107622 bytes, checksum: 83c49afc4408792e19af58be1f445e58 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:35:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMASF.pdf: 3107622 bytes, checksum: 83c49afc4408792e19af58be1f445e58 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:35:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMASF.pdf: 3107622 bytes, checksum: 83c49afc4408792e19af58be1f445e58 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T19:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMASF.pdf: 3107622 bytes, checksum: 83c49afc4408792e19af58be1f445e58 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / In this work were used chemometric tools like PLS, iPLS to perform multivariate calibration of ternary and binary mixtures of polymorphs of carbamazepine, ezetimibe and Clopidogrel. Initially were synthesized two polymorphs of carbamazepine and two polymorphs of clopidogrel from its respective commercial polymorphs, totaling three polymorphs for each of these drugs. For carbamazepine were synthesized the dihydrate polymorphs (CBZ DH) and polymorph I (CBZ I) from the Polymorph III (CBZ III), which were characterized by DSC and XRD, and Raman spectroscopy. Inittialy an iPLS model was built with the polymorphs. The samples were prepared according to a ternary mixture, totaling 10 samples for a set of calibration and a further 5 to a set of validation. At each sample was collected 10 Raman spectra at different points, subsequently an arithmetic average of the 10 spectra was calculated, resulting in an average spectrum with which is built the model calibration and validation presenting prediction error: (CBZ I) 6 2 mg; (CBZ III) 6.8 mg; (CBZ DH) 11.6 mg. In a second step the same procedure was conducted, but samples (300 mg) were in the presence of its excipients (microcrystalline cellulose, sodium croscarmellose, magnesium stearate and colloidal silicon dioxide). The samples were prepared by adding (250 mg), carbamazepine (50 mg), prediction errors were: (CBZ I) 4.8 mg; (CBZ III) 3.0 mg; (CBZ DH) 0.7 mg. For bisulfate Clopidogrel were synthesized polymorphs II (CBS II) and amorphous (amorphous CBS) from polymorph I (CBS I, commercial), the iPLS calibration model was constructed as done for carbamazepine, however were used mid-infrared and Raman spectroscopy and the samples were not prepared in the presence of its excipients. Prediction errors for the model with Raman spectroscopy was: (CBS I) 3.2 mg; (CBS II) 5.0 mg; (Amorphous CBS) 6.1 mg and mid-infrared spectroscopy was: (CBS I) 4.8 mg; (CBS II) 7.4 mg; (Amorphous CBS) 6.9 mg. For ezetimibe was synthesized the hydrate (EZT-H) from the commercial polymorph (EZT-An) and held a binary mixture of the two polymorphs, with the concentration of each polymorphs ranging 10% by weight in each sample, since in the presence of its excipients. Each sample weight 100 mg, with 10 mg of ezetimibe and 90 mg of excipients (croscarmellose sodium, lactose monohydrate, povidone and sodium lauryl sulphate), the same method was applied for the preparation of the samples validation set. The calibration model was built by iPLS with the following prediction errors: (EZT-An) 0.7 mg; (EZT-H) 0.6 mg. A new sample was prepared only with EZT-An and the excipients which was vacuum packed in a polyethylene container, carried out a monitoring for 24 hours where it was seen that in this period the hydration of Ezetmiba was already 72% due to the moisture of the excipients. / Neste trabalho foram utilizados ferramentas quimiométricas do tipo PLS, iPLS eMCR-ALS para realizar a calibração multivariada de misturas ternárias e binárias dos polimorfos de Carbamazepina, Ezetimiba e Clopidogrel. Inicialmente sintetizaram-se dois polimorfos de Carbamazepina e dois polimorfos de Clopidogrel à partir de seus respectivos polimorfos comerciais, totalizando três polimorfos para cada um desses fármacos. Para carbamazepina sintetizaram-se os polimorfos dihidratado (CBZ DH) e polimorfo I (CBZ I) à partir do polimorfo III (CBZ III), que foram caracterizados por DRX e DSC e espectroscopia Raman. Construiu-se um modelo de calibração do tipo iPLS com os polimorfos. As amostras foram preparadas de acordo com uma mistura ternária. Em cada amostra foram retirados 10 espectros Raman em pontos distintos, posteriormente foi realizada uma média aritmética desses 10 espectros resultando em um espectro médio, com os quais se construíram os modelos de calibração e validação que apresentaram erros de predição de: (CBZ I) 6,2 mg; (CBZ III) 6,8 mg; (CBZ DH) 11,6 mg. Em uma segunda etapa realizou-se o mesmo procedimento, porém as amostras (300 mg) foram preparadas adicionando-se os excipientes (celulose microcristalina, croscamelose sódica, estearato de magnésio e dióxido de silício coloidal) (250 mg) à carbamazepina (50 mg), os erros de predição foram de: (CBZ I) 4,8 mg; (CBZ III) 3,0 mg; (CBZ DH) 0,7 mg. Para o bisulfato de clopidogrel sintetizaram-se os polimorfos II (CBS II) e amorfo (CBS amorfo) à partir do polimorfo I (CBS I, comercial), o modelo de calibração por iPLS foi construído tal como realizado para a carbamazepina, contudo utilizaram-se espectroscopia Raman e infravermelho médio e não se preparam amostras na presença de excipientes. Os erros de predição para o modelo com espectroscopia Raman foi de : (CBS I) 3,2 mg; (CBS II) 5,0 mg; (CBS amorfo) 6,1 mg e para espectroscopia no infravermelho médio foi de: (CBS I) 4,8 mg; (CBS II) 7,4 mg; (CBS amorfo) 6,9 mg. Para a ezetimiba sintetizou-se o hidrato (EZT-H) do polimorfo comercial (EZT-An) e realizou-se uma mistura binária dos dois polimorfos, com a concentração de cada polimorfos variando 10 % em massa em cada amostra, já na presença de seus excipientes. Cada amostra pessa 100 mg, sendo 10 mg de ezetimiba e 90 mg de excipientes(croscamelose sódica, lactose monoidratada, povidona e laurilsulfato de sódio) o mesmo método foi aplicado para a preparação de amostras do conjunto de validação. Construiu-se o modelo de calibração por iPLS com os seguintes erros de predição: (EZT-An) 0,7 mg; (EZT-H) 0,6 mg. Preparou-se uma nova amostra apenas com EZT-An e seus excipientes que foi embalada à vácuo em um recipiente de polietileno, realizou-se um monitoramento durante 24 horas onde viu-se que nesse período a hidratação da Ezetimiba já era de 72%, por conta da umidade de seus excipientes.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-27. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:05Z : No. of bitstreams: 1 000869160_20200801.pdf: 948171 bytes, checksum: b1b99c6dc56613330126eb9e2d642cff (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Danos no DNA, podem ocorrer tanto por agentes genotóxicos endógenos quanto agentes exógenos, que podem promover a instabilidade do genoma e levar diretamente a doenças, como por exemplo, o câncer, alterações neurológicas, imunodeficiências e envelhecimento prematuro. Auxiliando na manutenção da estabilidade, as células apresentam uma série de vias de reparo de DNA, as quais realizam o processo em múltiplas etapas para resolver lesões específicas no DNA e manter a integridade do genoma. A importação nuclear é um pré-requisito para as funções das proteínas de reparo do DNA e dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. A Importina-β (Impβ) atua como o transportador enquanto a Importina-α (Impα) atua como adaptador, reconhecendo as sequências de localização nuclear (NLS) presentes nas proteínas que possuem função no núcleo. Esse trabalho trata especificamente dos estudos estruturais de complexos da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando técnicas de cristalografia e ensaios de afinidade pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A expressão e purificação da Impα de Mus musculus truncada em sua porção N-terminal foi realizada, bem como a co-cristalização da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA, correspondentes as sequências MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2. Peptídeos mutados em regiões importantes de reconhecimento nuclear para os peptídeos MLH1 e PMS2 também foram selecionados para o desenvolvimento deste projeto. Dados de difração de raios-X foram coletados dos cristais obtidos e processados no intervalo de 2,0-2,8 Å de resolução. Com esses resultados, as estruturas contendo cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2 foram elucidadas. As proteínas do complexo MutLα, a MLH1 e... / DNA damage can occur by endogenous and exogenous genotoxic agents, which may promote instability of the genome and directly lead to diseases such as cancer, neurological disorders, immunodeficiencies and even premature aging. Helping in the maintenance of the stability, the cells display a number of DNA repair pathways, which carry out the process in multiple steps to resolve specific DNA damage, and maintain the integrity of the genome. The nuclear import is a pre-requisite for the functions of DNA repair proteins and, among the mechanisms responsible for regulation of nuclear import, the classical pathway constituted by the heterodimer importin-α / β is a major shift mechanisms. Importin-β (Impβ) acts as the carrier while the importin α-(Impα) acts as an adapter recognizing the nuclear localization sequence (NLS) present in proteins that have function into the nucleus.This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques and binding assays by isotermal titration calorimetry technique (ITC). The expression and purification of Mus musculus Impα truncated at its N-terminal portion was performed, as well as co-crystallization with Impα NLSs peptides of proteins related to DNA repair, the corresponding sequences MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2. Peptides mutated in key regions of nuclear recognition for MLH1 and PMS2 peptides were also selected for this project. X-ray diffraction data collected from crystals were obtained and processed in the range of 2.0-2.8 Å resolution. With these results, the structures containing cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2 were elucidated. The MutLα complex proteins, MLH1 and PMS2, related to the mismatch repair (MMR), bound to the Impα similarly to the T antigen NLS of SV40 in the major binding site. ITC experiments corroborate the crystallographic results, which suggest that both NLSs are classic... / FAPESP: 2011/09905-0

Orientador: Gilbert Bannach / Banca: Massao Ionashiro / Banca: Alexandre de Oliveira Legendre / Resumo: Neste trabalho foi realizado o estudo do comportamento térmico e a caracterização de formas cristalinas dos anti-hipertensivos atenolol, besilato de anlodipino e meleato de enalapril. A caracterização dos compostos foi realizada através do emprego das técnicas de termogravimetria e calorimetria exploratória diferencial simultânea (TG-DSC), termogravimetria acoplada à espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (TG-FTIR), espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIE) e difratometria de raios X pelo método do pó. A técnica TG-DSC forneceu informações sobre a estabilidade térmica, etapas de decomposição e interações entre o fármaco e o solvente utilizado na obtenção de cristais. As curvas TG-DSC demonstraram que o atenolol possui maior estabilidade e o maleato de enalapril menor estabilidade térmica. No caso das recritalizações, as curvas demonstraram que o atenolol e o maleato de enalapril, ambos em suas formas padrão, apresentaram maior estabilidade térmica quando comparados com seus produtos de recristalização e o besilato de anlodipino quando recistalizado em metanol com tetrahidrofurano (50% v/v), obteve um ganho na estabilidade térmica se comparado com o mesmo na forma padrão. Através da análise das bandas de absorção nos espectros de FTIR e da análise da posição dos picos dos difratogramas de raios X, foi possível verificar que não houve indícios de polimorfismo, exceto pela formação de um solvatomorfo do besilato de anlodipino quando recristalizado em metanol. Os resultados obtidos pelo acoplamento das técnicas de termogravimetria e espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier permitiram analisar os compostos voláteis liberados durante a degradação térmica dos fármacos padrões / Abstract: In this work, it was done a study or the thermal behaviour and the characterization of the crystaline forms of the anthypertensives: atenolol, amlodipine besylate and enalapril maleate. The characterization of the compounds was done by using the simultaneous thermogravimetry and differential scanning calorimetry (TG-DSC), thermogravimetry coupled with the infrared spectroscopy, infrared spectroscopy and X-ray powder diffractrometry. The techique Tg-DSC gave information about the thermal stabilization, decomposition process and interaction between the drug and the solvent, used to obtain crystals. The TG-DSC curves showed that the atenolol has a higher thermal stability and the enalapril maleate, less thermal stability. In the re-cristallization case, the curves showed that the atenolol and the enalapril maleate, both in their standard forms, presented bigger thermal stability, compared to their recrystallization products and the amlopidine besylate, when recrystallized in methanol with tetrahydrofuran (50% v/v) obtained a gain in its thermal stability when compared to itself in the standard form. Through the absorption bands discplacement in the FTIR spectra and of the analysis of the intensity and position of the X-ray powder diffraction peaks, it was possible to verify that there weren't any evidences of polymorphism. The obtained results by the couplind of the techniques of thermogravimetry and infrared spectroscopy permitted to defect of the possible valatile compounds released during the thermal degradation of the drugs standards / Mestre

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: Antonio Sérgio Kimus Braz / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Carlos de Oliveira Paiva Santos / Co-orientador: Selma Gutierrez Antonio / Banca: Jean Leandro dos Santos / Banca: Flávio Machado de Souza Carvalho / Resumo: A presença de estruturas polimórficas não esperadas na composição de medicamentos sólidos podem acarretar diferenças nas propriedades químicas e físicas, tais como: reatividade química, solubilidade aparente, taxa de dissolução, dentre outras, podendo afetar, a sua biodisponibilidade. Essas mudanças indesejadas podem comprometer a eficácia, a segurança e a qualidade de um medicamento e, portanto, afetar um tratamento médico. No presente trabalho, com o objetivo de identificar e quantificar as fases presentes em suas composições, foram analisados, por difração de raios X e o emprego do método de Rietveld, os seguintes medicamentos: hidroclorotiazida, furosemida, espironolactona, carbamazepina, fenitoína e fenobarbital. Observou-se, em todos os medicamentos analisados, com exceção da espironolactona similar de 25 mg (ES25S), que a forma cristalina do princípio ativo identificada era a mesma apresentada na literatura como sendo a ideal para a manufatura dos medicamentos. Já no caso da ES25S, identificou-se como princípio ativo a forma hidratada da espironolactona, que segundo a literatura, apresenta dissolução menor em comparação à forma II, que é a utilizada na manufatura do medicamentos por apresentar maior atividade diurética. Além disso, realizou-se para a amostra de furosemida similar (FUS) a quantificação de princípio ativo cristalino presente na composição de um comprimido, através do método do padrão interno. Assim, observou-se que um comprimido de FUS contém em média 35,92 mg de furosemida cristalina. Foram realizados estudos de dissolução intrínseca para os comprimidos de carbamazepina onde observou-se que o medicamento similar (CB200S1) nos quinze primeiros minutos do experimento apresenta uma dissolução maior (~ 90 %) que o limite máximo proposto pela Farmacopeia Brasileira, que é de 75 %. / Abstract:The presence of polymorphic structures not expected in the composition of solid drugs can generate differences in physical and chemical properties such as chemical reactivity, apparent solubility, dissolution rate, among others, thus affecting its bioavailability. These unwanted changes can compromise the efficacy, safety and quality of the product and therefore compromising medical treatment. In this work, the objective was to identify and quantify the phases presents in their compositions through the Rietveld method in data of X-ray powder diffraction the medicines: hydrochlorothiazide, furosemide, spironolactone, carbamazepine, phenytoin and phenobarbital. It was observed in all analyzed samples, with the exception of similar spironolactone 25 mg (ES25S), the crystalline form of the active ingredient were equal to those presented in the literature as being the ideal for the manufacture of tablets. In the case of ES25S, was identified as the active principle hydrated form of spironolactone, which according to the literature, presents a lower dissolution compared to form II, which is used in the manufacture of medicines due to its greater diuretic activity. In addition, the sample of furosemide (FUS) was quantifying the crystalline active principle present in the composition of a tablet through the inclusion of an internal standard method. It was found that a tablet FUS contains an average of 35.92 mg crystalline furosemide. Intrinsic dissolution studies were performed for carbamazepine tablets where it was observed that similar medicine (CB200S1) in the first fifteen minutes of the experiment has a higher dissolution (~ 90 %) than the maximum limit proposed by the Brazilian Pharmacopoeia is 75 %. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-11Bitstream added on 2014-06-13T19:00:10Z : No. of bitstreams: 1 silva_acm_me_bauru.pdf: 1514993 bytes, checksum: a5f97695cbac95b3030bdff825dcf4b5 (MD5) / Neste trabalho foi realizado o estudo do comportamento térmico e a caracterização de formas cristalinas dos anti-hipertensivos atenolol, besilato de anlodipino e meleato de enalapril. A caracterização dos compostos foi realizada através do emprego das técnicas de termogravimetria e calorimetria exploratória diferencial simultânea (TG-DSC), termogravimetria acoplada à espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (TG-FTIR), espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIE) e difratometria de raios X pelo método do pó. A técnica TG-DSC forneceu informações sobre a estabilidade térmica, etapas de decomposição e interações entre o fármaco e o solvente utilizado na obtenção de cristais. As curvas TG-DSC demonstraram que o atenolol possui maior estabilidade e o maleato de enalapril menor estabilidade térmica. No caso das recritalizações, as curvas demonstraram que o atenolol e o maleato de enalapril, ambos em suas formas padrão, apresentaram maior estabilidade térmica quando comparados com seus produtos de recristalização e o besilato de anlodipino quando recistalizado em metanol com tetrahidrofurano (50% v/v), obteve um ganho na estabilidade térmica se comparado com o mesmo na forma padrão. Através da análise das bandas de absorção nos espectros de FTIR e da análise da posição dos picos dos difratogramas de raios X, foi possível verificar que não houve indícios de polimorfismo, exceto pela formação de um solvatomorfo do besilato de anlodipino quando recristalizado em metanol. Os resultados obtidos pelo acoplamento das técnicas de termogravimetria e espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier permitiram analisar os compostos voláteis liberados durante a degradação térmica dos fármacos padrões / In this work, it was done a study or the thermal behaviour and the characterization of the crystaline forms of the anthypertensives: atenolol, amlodipine besylate and enalapril maleate. The characterization of the compounds was done by using the simultaneous thermogravimetry and differential scanning calorimetry (TG-DSC), thermogravimetry coupled with the infrared spectroscopy, infrared spectroscopy and X-ray powder diffractrometry. The techique Tg-DSC gave information about the thermal stabilization, decomposition process and interaction between the drug and the solvent, used to obtain crystals. The TG-DSC curves showed that the atenolol has a higher thermal stability and the enalapril maleate, less thermal stability. In the re-cristallization case, the curves showed that the atenolol and the enalapril maleate, both in their standard forms, presented bigger thermal stability, compared to their recrystallization products and the amlopidine besylate, when recrystallized in methanol with tetrahydrofuran (50% v/v) obtained a gain in its thermal stability when compared to itself in the standard form. Through the absorption bands discplacement in the FTIR spectra and of the analysis of the intensity and position of the X-ray powder diffraction peaks, it was possible to verify that there weren't any evidences of polymorphism. The obtained results by the couplind of the techniques of thermogravimetry and infrared spectroscopy permitted to defect of the possible valatile compounds released during the thermal degradation of the drugs standards

Neste trabalho estudamos o efeito de empacotamento, em diferentes formas condensadas, sobre as propriedades estruturais e eletrônicas de um polímero orgânico conjugado, a polianilina, através de simulações teóricas. A metodologia teórica empregada depende do número de átomos nos sistemas escolhidos, e das propriedades investigadas. Assim, para os filmes com milhares de átomos, utilizamos métodos clássicos para a obtenção das propriedades estruturais. Já para o estudo das propriedades eletrônicas, utilizamos métodos quânticos aplicados a sistemas cristalinos. Para estudar as propriedades estruturais em filmes de polianilina, foi necessário parametrizar um campo de força, e escolhemos o UNIVERSAL1.02 (UFF). Os testes iniciais com o novo campo, UFFn, em sistemas cristalinos de polianilina foram promissores, e pudemos obter simulações de filmes realísticos homogêneos, tanto para sistemas reduzidos como oxidados. A densidade obtida para os sistemas poliméricos representam muito bem o valor experimental, e resultados de raios-X e função de distribuição radial são muito semelhantes aos encontrados na literatura. Através do método ab initio SIESTA, estudamos as propriedades estruturais e eletrônicas de sistemas moleculares e cristalinos lD e 3D de polianilina, no estado reduzido e oxidado. Verificamos o efeito de oxidação já para os trímeros de anilina. As interações intra e intercadeias dos sistemas cristalinos são refletidas nas suas propriedades eletrônicas e são analisadas através da estrutura de bandas e densidade de carga. Arranjos diferentes no empacotamento dos cristais revelam um efeito significativo nas propriedades de transporte do material. / In this work we study the effect of packing, in different condensed forms, on the structural and electronic properties of a conjugated organic polymer, polyaniline, through theoretical simulations. The theoretical methodology that we used depends on the number of atoms of the chosen systems and also on the investigated properties. In this way, for films with thousands of atoms we used classical methods, in order to investigate structural properties. For the study of the electronic properties, we used quantum methods applied to crystalline systems. For the study of the structural properties of polyaniline films, it was necessary to parameterize a force field, and we chose the UNIVERSAL1.02 (UFF) field. The initial tests with the new field, UFFn, in crystalline films of polyaniline were successful, and we were able to obtain simulations of realistic homogeneous films for both reduced and oxidized systems. The density obtained for polymeric systems represents well the experimental value, and results of X-rays as a function of the radial distribution are very similar to those found in literature. By means of the ab initio SIESTA method, we studied the structural and electronic properties of molecular and lD and 3D crystalline systems of polyaniline, in the reduced and oxidized states. We verified the oxidation effect already for trimers of aniline. The inter-chain and intra-chain interactions of the crystalline systems are reflected in their electronic properties and were analyzed through the band structure and charge density. Different arrangements in the packing of the crystals reveal a significative effect in the transport properties of the material

Os receptores nucleares são uma família de fatores de transcrição que regulam a transcrição gênica em resposta a ligantes e estão envolvidos em vários processos fisiológicos e metabólicos do organismo. O receptor ativado por proliferadores peroxissomais γ (PPARγ) está envolvido em vários processos fisiológicos incluindo adipogênese, homeostase da glicose, metabolismo de lipídios e inflamação e foi identificado como alvo molecular para o tratamento do diabetes tipo II. A importância desse receptor ficou ainda mais evidente pela descoberta de mutações que prejudicam sua função, causando a Síndrome de Resistência ao Ligante, na qual os pacientes apresentam um fenótipo de lipodistrofia parcial, profundas desordens metabólicas como severa resistência à insulina e início precoce de diabetes mellitus tipo II. O PPARγ possui um amplo bolsão de ligação que permite que uma variedade de ligantes possa se ligar ao receptor. Essa variedade de ligantes pode induzir interações diferenciadas com correguladores, o que induzirá uma resposta biológica específica. Os agonistas totais, como as tiazolinedionas (TZDs) são eficientes sensibilizadores da insulina utilizados no tratamento do diabetes tipo II, porém seu uso tem sido limitado devido a efeitos adversos e novas abordagens terapêuticas são necessárias. Neste trabalho, o PPARγ foi caracterizado na presença de ligantes naturais (luteolina, ácidos graxos) e sintéticos (aintiinflamatórios não esteroidais AINEs) e também os mutantes envolvidos na Síndrome de Resistência aos Ligantes do PPARγ através de ensaios funcionais e cristalografia de proteínas. A luteolina apresentou um comportamento de agonista parcial, com atividades antiinflamatórias e com modo de ligação ao receptor diferente da rosiglitazona, resultando em uma diferenciação na expressão gênica em adipócitos. Os AINEs por sua vez, apresentaram diferentes perfis de ativação e modos de ligação ao receptor, além da capacidade de induzirem a diferenciação de adipócitos. Por fim, foi resolvida a estrutura cristalográfica do mutante V290M envolvido na Síndrome de Resistência ao Ligante, que mostrou que a mutação causa significativas alterações na estrutura do receptor, prejudicando sua função, o que representa um importante passo no entendimento das bases moleculares dessa síndrome. / Nuclear receptors are a family of ligand activated trancription factors that regulate gene transcription in response to ligands and are involved in several aspects of human physiology and metabolism. Peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) is involved in a range of distinct physiological processes including the regulation of adipogenesis, glucose homeostasis, lipid metabolism and inflammatory responses and it has been identified as a molecular target in the treatment of several diseases as diabetes type II. The importance of this receptor became even more evident by the discovery of mutations that impair its function causing Ligand Resistance Syndrome, in which patients have a phenotype of partial lipodystrophy, profound metabolic disorders such as severe insulin resistance and early onset of diabetes mellitus type II. PPARγ has a large binding pocket that permits that a wide range of ligands can bind to this receptor. This variety of ligands can induce differential interactions with coregulatory factors that will be translated into a specific biological response. PPAR full agonists, like thiazolidinediones (TZDs), are effective insulin sensitizers and antiinflammatories but their use is limited by adverse side effects and new therapeutic approaches are needed. In this study, the PPARγ, as well as their respective mutants involved in Ligand Resistance Syndrome, were characterized in the presence of natural (luteolin) and synthetic ligands (nonsteroidal anti-inflamatory drugs - NSAIDs) by functional assays and protein crystallography. Luteolin showed a partial agonist behaviour, with anti-inflammatory activity and a different binding mode in comparion with rosiglitazone, resulting in a different pattern of gene expression in adipocytes. NSAIDs showed different profiles of activation and binding modes, and they can promote adipocyte differentiation. Finally, we solved the crystal structure of the mutant V290M involved in the Ligand Resistance Syndrome, which showed that the mutation causes significant changes in the structure of the receptor, impairing its function. This structure represents an important step in understanding the molecular basis of this syndrome.

Eritrocruorinas são hemoglobinas gigantes compostas por uma bicamada hexagonal de massa molecular total entre 3,0 e 4,0 MDa. A sua estrutura é baseada em unidades básicas chamadas protômeros. Doze destes compõem a partícula inteira, seis em cada camada hexagonal, resultando numa estrutura contendo 180 subunidades. Nas eritrocruorinas do tipo I, o protômero é constituído por quatro tipos de cadeias de globina: a, b, c, e d, e por três tipos de cadeias de linkers, L1, L2 e L3. A compreensão atual do seu mecanismo da ação esta atualmente prejudicada pela resolução limitada das estruturas cristalográficas disponíveis. Para abordar esta questão procuramos cristalizar uma serie de eritrocruorinas de espécies diversas visando a determinação das suas estruturas a mais alta resolução. Na primeira parte deste trabalho a eritrocruorina de Glossoscolex paulistus (HbGp) teve suas subunidades sequenciadas e a estrutura da partícula inteira resolvida a uma resolução de 3,2Å, a mais alta até o momento. Na estrutura da HbGp as quatro cadeias de globina se associam na forma de um heterotetrâmero, que se repete três vezes formando uma estrutura dodecamérica denominada cap. A estrutura do cap associada a um heterotrímero de linkers forma o então mencionado protômero. A estrutura completa permite uma descrição mais detalhada dos contatos entre subunidades que são essenciais para a manutenção da partícula como um todo. Além disto descrevemos sítios de ligação a metais (Zn2+ e Ca2+) e sítios de glicosilação, alguns dos quais são inéditos. Em seguida, a subunidade d isolada da HbGp foi cristalizada e resolvida a 2.1Å. Uma analise dos contatos cristalinos demonstra um arranjo completamente diferente daquilo visto para a subunidade d no complexo inteira. Ao invés de associar-se na formar trimeros, como acontece no complexo, a cadeia d isolada forma dímeros cristalográficos, com interface similar a aquela observada entre as cadeias d e a. Estas observações contribuíram para a compreensão de como são os possíveis mecanismos de associação das globinas para a montagem do cap. Finalmente, as eritrocruorinas de quatro outras espécies foram cristalizadas, que resultou na obtenção de uma estrutura cristalográfica preliminar para a eritrocruorina de Eisenia Andrei a uma resolução de 4.7Å. / Erythrocruorins are giant haemoglobins in the form of a hexagonal bilayer of total molecular mass between 3 and 4 MDa. Their structures are based on a basic unit called the protomer. Twelve of these comprise the entire particle, six in each hexagonal layer, resulting in a structure containing 180 subunits. In the type I erythrocruorins the protomer is composed of four types of globin chains: a, b, c e d, and three types of linker; L1, L2 e L3. Our current understanding of their mechanism of action is limited by the resolution of the crystal structures available. To address this question we have attempted to crystallize a series of erythrocruorins from different species with a view to determining a crystal structure at higher resolution. In the first part of this thesis all chains of the erythrocruorin from Glossoscolex paulistus were completely sequenced and the structure of the full particle solved at 3.2Å, the highest reported to date. In the structure the four globin chains associate to form a heterotetramer, three of which unite to form a dodecameric cap. The latter associates with a heterotrimer of linkers to form the aforementioned protomer. The full structure permits a more detailed description of the contacts between subunits which are essential for particle stability. Furthermore, we describe metal binding sites (Zn2+ e Ca2+) and glycosylation sites, some of which are have not been reported previously. Subsequently the isolated d chain was crystallized and solved to 2.1Å. An analysis of the crystal contacts shows an arrangement which is completely different to that seen in the full particle. Instead of forming trimers, as seen in the complex, the isolated d chain associates to form a dimer across a crystallographic twofold axis making use of the interface normally used to associate with subunit a. These observations contributed to our understanding of the possible mechanisms of association of globin chains during the formation of the cap. Finally, the erythrocruorins from four other species were crystallized, which resulted in the preliminary determination of the structure of that from Eisenia Andrei at 4.7Å.

Doenças tropicais negligenciadas compartilham características que permitem que elas persistam nas condições de pobreza, onde se aglomeram e se sobrepõe frequentemente. Mais de um bilhão de pessoas sofrem de uma ou mais doenças tropicais negligenciadas. Entre estas está a doença de Chagas, resultante da infecção pelo protozoário parasito hemoflagelado Trypanosoma cruzi, tendo insetos triatomíneos como vetores. Topoisomerases são enzimas envolvidas na regulação do superespiralamento do DNA resolvendo problemas topológicos associados com replicação, transcrição, recombinação e reparo. As topoisomerases do tipo II são essenciais para tripanossomatídeos por atuarem na replicação e organização do DNA contido em uma região especializada da mitocôndria denominada cinetoplasto. O estudo da Topoisomerase II Mitocondrial (TcTopoIImit) foi realizado através de análises sequenciais e estruturais de outras topoisomerases para a determinação de construções para a clonagem. As construções para o domínio N-terminal foram clonadas no vetor pTZ57R/T e subclonadas em vetores do sistema pET para expressão proteica em E. coli. Experimentos de expressão foram realizados em diferentes cepas, vetores, soluções tampão e outros parâmetros variáveis visando a obtenção dos produtos recombinantes na forma solúvel, porém, tais resultados não foram obtidos. A flavoproteína Old Yellow Enzyme de Trypanosoma cruzi (TcOYE) é uma oxidoredutase que usa NAD(P)H como cofator. Esta enzima é clinicamente relevante devido ao seu papel no mecanismo de ação de alguns agentes tripanocidas, utilizados no tratamento da doença de Chagas, por produzirem espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho, a enzima recombinante TcOYE foi produzida, purificada, cristalizada pelo método de difusão de vapor e sua estrutura cristalográfica, resolvida por substituição molecular e refinada. A TcOYE foi cristalizada nas formas cristalinas P212121 e P21 e os dados de difração foram coletados para o máximo de resolução de 1,27 e 2,00 Å, respectivamente. As coordenadas atômicas e fatores de estrutura das estruturas da TcOYE nas formas cristalinas P212121 e P21 foram depositados no Banco de Dados de Proteínas com os códigos de acesso 4E2B e 4E2D, respectivamente. A TcOYE apresenta um enovelamento canônico em um barril (α/β)8 com o grupo prostético localizado na cavidade maior do sítio ativo. Após a obtenção dos modelos cristalográficos análises sequenciais e estruturais foram realizadas para a TcOYE e outras OYEs. A região 141-156 do subdomínio capping em TcOYE, assim como em outras OYEs, é intrinsecamente desestruturada exibindo altos valores de fatores B. A região mais divergente entre as OYEs é o loop estendido (289-297), que pode variar em comprimento e composição mudando o volume e a acessibilidade ao sítio ativo. / Neglected tropical diseases share features that allow them to persist in conditions of poverty, which clump together and frequently overlap. More than 1 billion people suffer from one or more neglected tropical diseases. Among them is the Chagas disease is an important parasitic disease resulting from infection by the flagellate protozoan parasite Trypanosoma cruzi, with triatomine insects as vectors. Topoisomerases are ubiquitous enzymes involved in the regulation of DNA supercoiling and overcoming topological barriers during replication, transcription, recombination and repair. The type II topoisomerases are essential for trypanosomatids since, in addition to their role in nuclear DNA metabolism, these enzymes might also play an important role in the replication and organization of the DNA contained in the specialized region of the mitochondrion known as the kinetoplast. The study of Mitochondrial Topoisomerase II from T. cruzi (TcTopoIImit) was performed by sequence and structural analyses into topos members for determination of domains constructions for cloning. Constructions for the N-domain were then cloned in pTZ57R/T vector and subcloned into pET system vectors for protein expression in E. coli. The protein expression experiments were performed by different strain cells, vectors, buffers solutions and others adjustable parameters for improve the solubility but recombinant products in soluble form were not obtained. The flavoprotein Old Yellow Enzyme from Trypanosoma cruzi (TcOYE) is an oxidoreductase that uses NAD(P)H as cofactor. This enzyme is clinically relevant due to its role in the action mechanism of some trypanocidal drugs used in the treatment of Chagas disease by producing reactive oxygen species. In this work, the recombinant enzyme TcOYE was produced, purified, crystallized by the vapour diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. TcOYE was crystallized in two crystalline forms, P212121 and P21 and diffraction data were collected to a maximum resolution of 1.27 and 2.00 Å, respectively. The atomic coordinates and structure factors of the TcOYE structure in P212121 and P21 crystalline forms have been deposited in the Protein Data Bank with the accession codes 4E2B and 4E2D, respectively. TcOYE displays a canonical (α/β)8-barrel fold with a FMN prosthetic group located at the large active-site cavity. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for TcOYE and others OYEs. The region 141-156 of the capping subdomain in TcOYE as well as in others OYEs is intrinsically flexible exhibiting high B-factor values. The most divergent region among these OYEs is the extended loop (289-297), which can vary in length and composition changing the volume and accessibility to the active site.