Orientador: Igor Polikarpov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:56:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aparicio_Ricardo_D.pdf: 10766761 bytes, checksum: 2b97932107d603afe676093a0fe399a6 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A presente tese resume os resultados obtidos durante o programa de doutorado do autor. O projeto principal consistiu em estudos estruturais das enzimas b-manosidase do fungo Trichoderma reesei e Triose fosfato isomerase (TIM) de músculo de coelho. Cristalografia de Proteínas e Espalhamento a Baixo Ângulo foram as técnicas mais utilizadas. Os principais resultados foram a determinação da estrutura de baixa resolução e o provável enovelamento da b-manosidase e três estruturas cristalográficas de TIM, resolvidas em duas formas cristalinas e a diferentes temperaturas. Na estrutura de TIM de maior resolução (1.5 ° A), o loop do sítio ativo de uma das subunidades encontra-se na conformação fechada, apesar da ausência de ligante, fato nunca antes observado. Em ambos os projetos de pesquisa, informação biológica nova e relevante foi obtida. Como um resultado dos trabalhos de doutorado, um total de cinco artigos foram publicados em períodicos internacionais e dois encontram-se em fase final de preparação / Abstract: This PhD thesis summarizes the results obtained during the PhD program of the author. The main project consisted in structural studies of b-mannosidase from Trichoderma reesei and rabbit muscle Triose phosphate isomerase (TIM). Protein Crystallography and Small-Angle X-ray Scattering have been the mostly used techniques. The main results are the low resolution structure and a putative fold of b-mannosidase and three cristallographic TIM structures, determined in two crystal forms and different temperatures. One of the subunits in the highest resolution TIM structure (1.5 ° A) has the active site loop in the closed conformation despite the absence of a ligand in the active site, what had not been observed before. Both projects have led to new and important biological information. As a result of the doctorate program, five articles have been published and two further are in preparation / Doutorado / Física / Doutor em Ciências

Orientadores: Igor Polikarpov, Jose Antonio Brum / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nagem_RonaldoAlvesPinto_D.pdf: 84837900 bytes, checksum: 8222e093b1d1050668af8bf8c256e0e2 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Atualmente, os modelos tridimensionais de macromoléculas biológicas obtidos por meio das técnicas de difração de raios-X (cristalografia) ou de ressonância magnética nuclear constituem uma das bases principais para o desenho racional de fármacos. Nesse contexto, a área de cristalografia de proteínas é responsável por cerca de 85% de todos os modelos estruturais de macromoléculas biológicas encontrados nos bancos de dados. Este fato, por si só, tem permitido um grande avanço da área tanto em instituições de pesquisa científica quanto em empresas farmacêuticas. Desde que a linha de luz CPr do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS, Campinas, SP, Brasil) foi construída e aberta à comunidade científica em 1997, centenas de conjuntos de dados de difração de raios-X por cristais de macromoléculas biológicas têm sido coletados. Grande parte desses conjuntos foi usada para resolver a estrutura de proteínas pela técnica de substituição molecular; técnica esta que utiliza um modelo tridimensional já conhecido semelhante àquele que se pretende determinar. Contudo, até 1999, quando o projeto desta tese foi escrito, não mais do que duas estruturas cristalográficas inéditas haviam sido resolvidas por grupos de pesquisa no Brasil. Em vista disso, o projeto teve como objetivo principal otimizar as condições necessárias para a resolução de estruturas inéditas de proteínas usando as facilidades da linha CPr do LNLS. O processo envolveu não só a preparação das amostras para a coleta de dados, mas também o processamento e a análise dos resultados. Durante os quatro anos desta tese, inúmeros conjuntos de dados foram coletados na linha CPr. Os primeiros experimentos utilizando uma proteína teste (lisozima) foram essenciais para avaliar tanto o método de crio derivatização rápida para a preparação das amostras quanto a qualidade dos conjuntos de dados coletados. Os experimentos iniciais possibilitaram aumentar ainda mais as potencialidades do método de crio derivatização rápida e ajustá-lo às condições da linha de luz CPr. A experiência adquirida com este trabalho inicial foi aplicada, em seguida, na resolução de algumas estruturas inéditas de proteínas de organismos variados. Os resultados permitiram concluir que a aplicação do método de crio derivatização rápida para a preparação dos cristais e o uso de radiação monocromática (1,54 Å), proveniente do síncrotron brasileiro, podem aumentar, significativamente, as chances de sucesso para a determinação de estruturas inéditas de macromoléculas biológicas no país. Apesar de todo o trabalho ter sido realizado com uma fonte de radiação síncrotron (LNLS), os resultados obtidos no final desta pesquisa permitem adiantar e prever o uso de geradores convencionais de raios-X junto com o método de crio derivatização rápida para a resolução de estruturas inéditas em laboratórios de pequeno porte. Isso poderá proporcionar, sem sombra de dúvida, um grande avanço nos projetos pós-genoma em desenvolvimento no país. Palavras-chave: Cristalografia de Proteínas, Radiação Síncrotron, Método de Crio Derivatização Rápida e Estruturas Macromoleculares Inéditas / Abstract: Nowadays, three-dimensional models of macromolecules obtained by X-ray diffraction (crystallography) and nuclear magnetic resonance techniques are one of the main bases for rational drug design. The protein crystallography field is responsible for almost 85% of all macromolecule models found in databases. This fact, by itself, is responsible for great progress of the field in research institutions and pharmaceutical industries. From the time when the CPr beamline of the Brazilian National Synchrotron Light Source (LNLS, Campinas, SP, Brazil) was built and its use by the scientific community was authorized in 1997, hundreds of X-ray diffraction datasets have been collected. Most of the datasets collected at the CPr beamline were used to solve the structure of proteins by the molecular replacement method. This method involves the use of a known search model, closely similar to the investigated macromolecule. However, until 1999, when the project for this thesis was written, no more than two novel crystallographic structures had been solved in Brazil. As a result of this, the project had the main goal to optimize the conditions required to the solution of novel macromolecule structures using the CPr beamline at the LNLS. This project involved not only preparation of samples for data acquisition, but also processing and analysis of results. During four years, several X-ray diffraction datasets were collected at the CPr beamline. First experiments using a test protein (lysozyme) were essential to check the quick cryo soaking approach for sample preparation as well as the quality of datasets. These initial experiments allowed to increase the applicability of the quick cryo soaking approach and to adjust it to the CPr beamline. The experience acquired as a result of this initial work was used to solve the structure of a few novel proteins from different organisms. The main conclusion achieved after this work is that the use of the quick cryo soaking approach to prepare crystals for data collection and the use of monochromatic radiation (1,54 Å) from the Brazilian synchrotron can noticeably increase the chances of success in the determination of novel protein structures in our country. Even thought only synchrotron radiation was used in this work, results obtained at the end of this research indicate and forecast the use of conventional X-ray sources with the quick cryo soaking approach to solve the structure of novel proteins in small laboratories. This may promote, with no doubt, great advances in pos-genomic projects under development in our country. Key words: Protein Crystallography, Synchrotron Radiation, Quick Cryo Soaking Approach and Novel Macromolecule Structures / Doutorado / Física / Doutor em Ciências

Orientador: Gilbert Bannach / Banca: Éder Tadeu Gomes Cavalheiro / Banca: Roni Antônio Mendes / Banca: Flavio Junior Caires / Banca: Aroldo Geraldo Magdalena / Resumo: Neste trabalho são estudadas novas formas sólidas dos fármacos genfibrozila(GEM) e sinvastatina(SIM) e suas misturas binárias com os coformadores isonicotinamida (INCT), picolinamida (PA), nicotinamida (NA),benzamida (BZ), niacina (NCN) e pirazinamida (PZN) com uso do método mecanoquímico. Os fármacos são agentes antilipêmicos pertencentes à classe dos fibratos (GEM) e estatinas (SIM). A ênfase do trabalho é na formação de cocristais, no entanto, a existência de polimorfismo também foi estudada. A caracterização dos polimorfos e misturas binárias foram realizadas com uso de técnicas termoanalíticas: termogravimetria - análise térmica diferencial (TG-DTA), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termomicroscopia de luz polarizada (PLTM) e também por técnicas espectroscópicas: espectroscopia vibracional na região do infravermelho médio (FTIR) e difratometria de raios X pelo método do pó (PXRD) e de monocristal (SCXRD). Com isso, primeiramente, foram investigadas evidências da existência de polimorfismo dos fármacos quando submetidos a um tratamento térmico e também de moagem. A GEM exibiu polimorfismo mediante cristalização a partir do fundido, com relação monotrópica com a forma de partida, a qual acredita-se possuir estrutura semelhante à forma partida. Já a SIM não apresentou indícios de polimorfismo. Com relação ao método mecanoquímico de moagem, os fármacos e coformadores não apresentaram polimorfismo nas condições selecionadas. Em seguida, foram estudados os doze sis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work, new solid forms of the drugs gemfibrozil (GEM) and simvastatin (SIM) and their binary mixtures with coformers isonicotinamide (INCT), picolinamide (PA), nicotinamide (NA), benzamide (BZ), niacin (NCN) and pyrazinamide (PZN), through mechanochemistry method are studied. The drugs are antilipemic agents belonging to the fibrates (GEM) and statins (SIM) classes. The focus of this work is on the formation of cocrystals, however, the existence of polymorphism was also studied. The characterization of the polymorphs and binary mixtures were performed using thermoanalytical techniques: thermogravimetry - differential thermal analysis (TG-DTA), differential scanning calorimetry (DSC), polarized light thermomicroscopy (PLTM) and also by spectroscopic techniques: medium infrared (FTIR), powder X-ray diffraction (PXRD) and single crystal X-ray diffraction (SCXRD). Thereby, first of all, it was investigated evidence of polymorphism of the drugs studied when they were submitted to thermal treatment and also mechanochemistry grinding. GEM presented polymorphism by crystallization from the melt, exhibiting a monotropic relationship with the starting form, which is believed to have a similar structure with the starting form. The SIM did not exhibit evidence of polymorphism. About the mechanochemistry grinding method, the drugs and coformers did not show polymorphism in chosen conditions. Afterwards, the twelve system proposed were studied. It was confirmed the formation of cocr... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-11T15:16:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Rosane de Paula Castro - 2018.pdf: 6915380 bytes, checksum: 2dd6980ad13f95405b57166fa1a2637c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-11T15:49:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Rosane de Paula Castro - 2018.pdf: 6915380 bytes, checksum: 2dd6980ad13f95405b57166fa1a2637c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-11T15:49:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Rosane de Paula Castro - 2018.pdf: 6915380 bytes, checksum: 2dd6980ad13f95405b57166fa1a2637c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-05-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This thesis presents the structure determination using single crystal x-ray crystallography of four drug candidates under ambient conditions of temperature and pressure, as well as submitted to high pressure. The crystallographic analysis of this type of compound allows to obtain the three-dimensional structure in an unambiguous way. This information is useful for the development process of new drugs in order to achieve the planned properties, such as the study of combinations of the drug with the excipients to be used to guarantee the rate of expected release of the drug in the human body and the optimization of interaction between the drug and the target. Furthermore during the process of drug manufacturing in the pharmaceutical industry polymorphic phases may arise due to the application of pressure, which occurs during grinding and in the preparation of tablets, which may alter the bioavailability, solubility and stability of the medicament. Thus, identifying the conditions under which such modifications may occur guarantees the reliability of the final product. In this sense, the crystallization and crystallographic analysis of drug candidates developed by the Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) of the Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) was carried out. The compounds analyzed were: LASSBio-1773 and LASSBio-1774, which have hypoglycemic activity, LASSBio-1606, with anti-inflammatory properties, and LASSBio-1735, which has been shown to be active against several types of cancer. For the compounds LASSBio-1774 and LASSBio-1606 X-ray diffraction at high pressures was also performed with Diamond Anvil Cell (DAC), determining their unit cells and analyzing the effects of pressure on the crystalline arrangement. In both compounds reversible phase transitions were observed. The analysis of the structural changes for LASSBio-1774 due to pressure was performed with the aid of strain tensors. / Nesta tese serão apresentados os resultados de determinação estrutural por difração de raios X de monocristais de candidatos a fármacos em condições ambientes de temperatura e pressão, assim como submetidos à altas pressões. A análise cristalográfica desse tipo de composto permite obter a estrutura tridimensional de maneira inequívoca. Essa informação é útil para o processo de desenvolvimento de novos fármacos a fim de se alcançar as propriedades planejadas, tais como o estudo de combinações do fármaco com os excipientes a serem utilizados para garantir a taxa de liberação esperada do fármaco no corpo humano e a otimização da interação entre o fármaco e o alvo. Além disso, durante o processo de produção na indústria farmacêutica, podem surgir fases polimórficas devido à aplicação de pressão, que ocorre durante a moagem e na preparação de comprimidos, podendo alterar a biodisponibilidade, solubilidade e estabilidade do medicamento. Assim, identificar as condições nas quais tais modificações podem ocorrer, garante a confiabilidade do produto final. Nesse sentido, no presente trabalho foram realizadas a cristalização e análise cristalográfica de candidatos à fármacos desenvolvidos pelo Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Os compostos analisados foram: LASSBio-1773 e LASSBio-1774, que possuem atividade hipoglicemiante, LASSBio-1606, com propriedade anti-inflamatória, e LASSBio-1735, que se mostrou ativo contra diversos tipos de câncer. Para os compostos LASSBio-1774 e LASSBio-1606 foi realizada também a difração de raios X em altas pressões, com a Diamond Anvil Cell (DAC), determinando suas células unitárias e analisando os efeitos da pressão sobre o arranjo cristalino. Em ambos os compostos foram observadas transições de fase reversíveis. Para o LASSBio-1774 a análise das mudanças estruturais devidas à pressão foi realizada com o auxílio dos tensores de strain.

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Coorientador: Agnes Alessandra Sekijima Takeda / Banca: Maria Célia Bertollini / Banca: João Renato Carvalho Muniz / Resumo: Um dos mecanismos de transporte de macromoléculas do citoplasma para o núcleo celular ocorre através da passagem da macromolécula pelo complexo poro nuclear (CPN), presente no envoltório nuclear, e depende de proteínas transportadoras denominadas Importinas. Neste processo, conhecido como via clássica de importação nuclear, a proteína Importina-α (Impα) reconhece sequências de localização nuclear (NLSs) na proteína a ser transportada para a formação de um complexo junto a Importina-β (Impβ) permitindo o transporte da macromolécula. O objetivo do presente trabalho é o estudo estrutural da Impα proveniente do fungo filamentoso Neurospora crassa (ImpαNc), a fim de reconhecer as regiões que determinam especificidades da proteína, além de comparar seu comportamento nativo e na presença de um peptídeo NLS. Os primeiros experimentos com a ImpαNc permitiram uma caracterização inicial da proteína e seu comportamento em solução. Experimentos de cromatografia analítica de exclusão molecular, comparando duas amostras de ImpαNc: (1) na presença do peptídeo NLS da proteína FEN1 (FEN1 NLS) e (2) sem peptídeo NLS, indicaram a formação de aglomerados na amostra 2 e a conformação, predominantemente, monomodal na amostra 1, sugerindo uma maior estabilidade da proteína na presença de peptídeos NLS. Para aprofundar as informações sobre a ImpαNc, experimentos de cristalização foram conduzidos com a proteína complexada ao peptídeo de NLS clássica e monopartida do SV40 (SV40 NLS), conforme experimentos anteriores sugeriram a maior estabilidade da proteína na presença de NLSs. Um primeiro cristal (ImpαNc-1), obtido na condição 0,2mM fosfato de sódio dibásico dihidratado e 20% (w/v) de polietilenoglicol 3350, foi submetido á difração de raios X e apresentou padrão de difração satisfatório para elucidação da estrutura do complexo a uma resolução de 2,05 Å. Um segundo cristal (ImpαNc-2), obtido na ... / Abstract: The transport of macromolecules from the cytoplasm to the nucleus occurs by passage through the nuclear pore complex, present in the nuclear envelope. One of that nuclear transport pathway depends on carrier proteins called Importins. In this process, known as classical nuclear import pathway, the Importin-α protein (Impα) recognizes nuclear localization sequences (NLSs) in the protein to be transported to the formation of a complex with Importin-β (Impβ) allowing the transport of macromolecules. The aim of this work is the structural study of the protein Importin-α, from the filamentous fungus Neurospora crassa (ImpαNc) in order to recognize the regions that determine the specificity of the protein and to compare their behavior in its native state and in presence of a NLS peptide. The first experiments with ImpαNc allowed an initial characterization of the protein and its behavior in solution. Experiments of analytical size exclusion chromatography comparing two samples of Impα: (1) in the presence of the NLS peptide of the protein FEN1 ( FEN1 NLS) and, (2) without NLS peptide; indicated the formation of agglomerates in the sample 2 and the conformation predominantly monomodal, in the sample 1, suggesting a greater stability of the protein in the presence of NLS peptides. For further information about the ImpαNc, crystallization experiments were carried out with the peptide complexed to the classic NLS SV40 (SV40 NLS) protein as previous experiments have suggested the increased stability of the protein in the presence of NLSs. A first crystal obtained in the condition 0.2mM dibasic sodium phosphate dihydrate and 20% (w / v) polyethylene glycol 3350 were subjected to xray diffraction and showed satisfactory diffraction pattern for the elucidation of the structure of the complex at a resolution of 2.05 Å. A second crystal (ImpαNc-2) obtained under the condition of 0.2 mM bicine pH 8.5 and 20% PEG 6000, was subjected to x-ray ... / Mestre

Fumarato hidratases ou fumarases (FH) catalisam a reação estereoespecífica reversível de hidratação do fumarato em L-malato. Essas enzimas se apresentam em todas as classes de organismos, desde procariotos a eucariotos, e podem ser encontradas nas formas mitocondrial e citosólica. A enzima tem papel importante na produção de energia pois participa do ciclo do ácido cítrico, na resposta ao dano do DNA e como supressor tumoral. A fumarase humana (HsFH), que pertence à classe II, é codificada pelo gene 1q42.1, possui 467 aminoácidos em cada monômero com peso molecular de 50,2 kDa cada. Estudos associaram mutações no gene da FH com diversas doenças humanas como acidúria fumárica, leiomiomatoses de útero e pele (MCUL), que quando associadas com um agressivo carcinoma múltiplo de células é conhecido como leiomiomatose hereditária e câncer renal (HLRCC). Apesar da grande importância da fumarase humana no metabolismo energético, ainda há pouca informação em relação ao mecanismo catalítico adotado pela enzima e o efeito estrutural e cinético causado pelas mutações envolvidas com essas doenças. Diante disso, nosso trabalho utilizou uma abordagem híbrida que envolve a caracterização biofísica, bioquímica e estrutural da enzima HsFH, e seus mutantes: N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, G282VHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH e N373DHsFH, identificados em pacientes. Estudos cinéticos foram realizados em sete diferentes pHs e, pela primeira vez para fumarases, o ensaio foi realizado com os dois substratos presentes na mesma mistura reacional, confirmando a contribuição da reação reversa para a velocidade global da enzima. De acordo com os estudos de termoflúor a proteína é estabilizada em pHs alcalinos e através da ligação de compostos no sítio ativo. A estrutura da enzima HsFH nativa foi resolvida a 1,8 Å e identificou a presença de moléculas de HEPES complexadas na região C-terminal da enzima. Os estudos cinéticos demonstraram um aumento da eficiência catalítica na presença do HEPES, sugerindo um possível papel alostérico de seu sítio de ligação para a atividade catalítica. Foram determinadas as estruturas para os mutantes N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH e N373DHsFH. As mutações Q185R, E362Q, S365G e N373D foram identificadas no sítio ativo afetando diretamente a capacidade da proteína em ligar os substratos, enquanto que a mutação H180R foi localizada no sítio B, que conduz os substratos e produtos para dentro e fora do sítio ativo. Já a mutação K230R está localizada no domínio central, mas os resultados de termoflúor demonstram um efeito direto na capacidade da enzima em acomodar o substrato. A mutação N107T, localizada longe do sítio ativo foi a única que permaneceu ativa e teve seus parâmetros cinéticos residuais determinados. O presente trabalho contribui para o entendimento das bases estruturais que correlacionam mutações na HsFH, deficiência enzimática e patologia. / Fumarate hydratases or fumarases (FH) catalyze the reversible stereospecific hydration of fumarate to L-malate. They are present in all classes of organisms, from prokaryotes to eukaryotes, and can be found in the mitochondrial and cytosolic forms. The enzyme has an important role in energy production as part of the well-known Citric Acid Cycle, in DNA damage response and as tumor suppressor. Human fumarase (HsFH) belongs to class II and is encoded by 1q42.1 gene. HsFH is tetrameric and has 467 amino acids per monomer, with predicted molecular weight of 50.2 kDa. Several studies associated FH gene mutations with some human diseases such as fumaric aciduria, multiple cutaneous and uterine leiomyomatosis (MCUL), which when associated with an aggressive form of multiple cell carcinoma is known as hereditary leiomyomatosis and renal cancer (HLRCC) syndrome. Although the major role of HsFH in energetic metabolism, there are still little structural and kinetic information about the mutants involved in these diseases. Thus, this study aims, through a hybrid approach, composed by biophysics, biochemical and structural characterization of mutants N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, G282VHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH and N373DHsFH identified from patients. Steady-state kinetics studies were performed in seven different pHs and, for the first time, the contribution of both substrates was analyzed simultaneously in a single kinetic assay and allowed to quantify the contribution of the reverse reaction for kinetics. According to thermofluor studies, structural stability can be achieved at alkaline pHs and suggests that ligand binding can modulate the protein stability. HsFH crystal structure was solved at 1.8 Å resolution and identified HEPES molecules complexed with the enzyme C-terminal region. Kinetics studies with HEPES showed an increase of the catalytic efficiency and suggests that HEPES binding site might have an allosteric role. Crystal structures for the mutants N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH and N373DHsFH were determined. The mutations Q185R, E362Q, S365G and N373D were identified in the active site and affect the substrate binding capacity directly, while mutation H180R was localized in the B site, which conducts the substrates and products in and out the active site. The mutation K230R is localized in the central domain, but thermofluor results demonstrate a direct effect on the ability of the enzyme to accommodate the substrate. The N107T mutation located far from the active site was the only one that remained active and had its residual kinetic parameters determined. The present work contributes to the understanding of the structural bases that correlate mutations in HsFH, enzymatic deficiency and pathology.

Orientador : Hérida Regina Nunes Salgado / Coorientador: Cristina Helena dos Reis Serra / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Marcello Garcia Trevisan / Banca: Fernanda Nervo Raffin / Banca: Ana Dóris de Castro / Resumo: O darunavir, antirretroviral inibidor de protease, compõe a terapia considerada altamente eficaz no tratamento da síndrome da imunodeficiência humana adquirida, e é um dos fármacos disponibilizados gratuitamente pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Os produtos genéricos têm contribuído para a manutenção e abrangência desta política de distribuição gratuita de medicamentos, ao reduzir os custos desses produtos. Neste propósito, este estudo busca fornecer informações sobre o comportamento físicoquímico e estabilidade do fármaco e da formulação, diante de diferentes condições climáticas, bem como, sobre sua solubilidade e liberação a partir da formulação. Além disso, pretende apresentar ferramentas in vitro e in silico que contribuam, no futuro próximo, para a produção de novos produtos contendo darunavir que apresentem alta qualidade, especialmente, genéricos do medicamento referência. Para tanto, a solubilidade do fármaco foi investigada em diferentes meios. A baixa solubilidade aquosa do fármaco foi verificada, e os meios adequados aos testes de dissolução foram escolhidos. O perfil de dissolução in vitro do darunavir e de absorção in vivo a partir papel dos comprimidos de Prezista® contendo 300 mg de fármaco foram investigados. Obtevese um perfil de dissolução discriminativo para o produto e um método de quantificação por espectrofotometria derivada foi desenvolvido e validade. Uma correlação entre os dados de fração dissolvida in vitro e fração absorvida in vivo do darunavir foi alcançada (r2= 0,95). Este é um método preditivo para avaliar o desempenho in vivo do darunavir a partir de comprimidos de liberação imediata, com base em dados in vitro, e é importante para minimizar o uso de animais e seres humanos em experimentos durante o desenvolvimento novos produtos farmacêuticos contendo darunavir. Além disso, uma ferramenta in silico foi desenvolvida e validada para a previsão da ... / Abstract: Darunavir, a protease inhibitor, constitute the highly active antiretroviral therapy against the acquired immunodeficiency syndrome. It is one of agents given free by the Brazilian Health System (SUS). Generic products have contributed to the maintenance and the policy of free distribution of medicines by the decreasing of costs of these products. In this way, this study seeks to provide information on the physical and chemical behavior and stability of the drug and formulation, facing different weather conditions, as well as provide information on their solubility and release from the formulation. It also aims to provide in vitro and in silico tools to contribute in the near future, for the production of new products containing darunavir, especially generic medicines. Therefore, the solubility of the drug was investigated in different media. The low aqueous solubility of the drug was observed, and suitable media for dissolution testing were chosen. The in vitro dissolution profile of darunavir and the in vivo absorption from Prezista® (tablets containing 300 mg of drug) were investigated. It was obtained a discriminating dissolution profile of the product and a method of quantification by spectrophotometry derivative was developed and validated. A correlation between the data of in vitro dissolved fraction and in vivo absorbed fraction of darunavir was achieved (r2 = 0.95). This is a predictive method to evaluate the in vivo performance of darunavir from immediate-release tablets, based on in vitro data, and it is important to minimize the use of animals and humans in experiments during the development of new medicines containing darunavir. In addition, an in silico tool was developed and validated for predicting the oral bioavailability of darunavir formulations, from their dissolution profile. For this, physiologically based pharmacokinetic modeling was applied through Simcyp® software. These, in vitro and in silico tools, assist in ... / Doutor

Tuberculose (TB) é um grave problema de saúde pública, sendo a segunda maior causa de morte entre doenças infecto contagiosas. Em 2014, 9,6 milhões de casos e, aproximadamente, 1,5 milhão de mortes foram reportados. O Programa Nacional de Controle da Tuberculose preconiza para o tratamento a administração simultânea de quatro medicamentos. Contudo, casos de tratamento inadequado favorecem o surgimento de cepas multirresistentes e extensivamente resistentes aos medicamentos disponíveis. Diante disso, torna-se urgente a necessidade de investigar novos alvos moleculares e desenvolver novos fármacos que sejam úteis e eficazes para o tratamento da infecção. As proteínas tirosina fosfatases (PTPs) constituem uma grande família de enzimas responsáveis pela hidrólise do fosfato ligado aos resíduos de tirosina em proteínas. A importância destas fosfatases reside no fato de estarem envolvidas na regulação de uma série de funções celulares, tais como crescimento, interação intercelular, metabolismo, transcrição, motilidade e resposta imune. A partir da análise do genoma do Mycabacteirum tuberculosis, foram identificadas duas proteínas tirosinas fosfatases (PtpA e PtpB), responsáveis pela sua sobrevivência nos macrófagos do hospedeiro. Ambas as enzimas têm sido exploradas como alvo molecular para o desenvolvimento de novos fármacos para a tuberculose. Nessa dissertação, as sequências gênicas que codificam para as enzimas PtpA e PtpB de M. tuberculosis foram clonadas com sucesso nos vetores de expressão. A expressão solúvel das proteínas permitiu o estabelecimento de um protocolo padronizado de purificação. Ensaios de cristalização foram conduzidos e cristais de proteínas obtidos tiveram os dados cristalográficos coletados. Para a enzima PtpB foi possível determinar a estrutura cristalográfica em alta resolução em complexo com um grupo fosfato no sítio catalítico. Essa estrutura foi então utilizada na etapa posterior de descoberta de novos candidatos a inibidores. Os trabalhos computacionais conduzidos incluíram uma combinação de estratégias para a identificação de pontos de interação relevantes para o processo de reconhecimento molecular e ligação bem como para a construção de modelos farmacofóricos 3D específicos para cada enzima. Esses dados foram utilizados para a seleção de um conjunto de 8 candidatos a inibidores da PtpA e 5 candidatos a inibidores da PtpB. Portanto, estudos de biologia molecular estrutural e química medicinal foram empregados com sucesso para o estabelecimento de uma plataforma produtiva dos alvos selecionados bem como para a seleção de novos candidatos a inibidores. / Tuberculosis (TB) is a serious public health problem and the second leading cause of death among infectious diseases. In 2014, 9.6 million cases, and approximately 1.5 million deaths were reported. The National Program for Tuberculosis Control recommends the simultaneous administration of four drugs as treatment for the disease. However, inadequate treatment determines the emergence of multidrug- and extensively-resistant strains to available drugs. Therefore, new molecular targets and drugs are urgently needed for the treatment of the infection. The protein tyrosine phosphatases (PTPs) are a large family of enzymes responsible for the hydrolysis of phosphate group bound to tyrosine residues in proteins. The importance of these molecules is related to the regulation of a number of cellular functions, including growth, intercellular interaction, metabolism, transcription, motility and immune response. Based on Mycabacteirum tuberculosis genome analysis, two protein tyrosine phosphatases (PTPA and PtpB) were related to mycobacterium survival in host macrophages. Both enzymes have been explored as a molecular target for the development of new drugs for TB. In this dissertation, the gene sequences encoding the enzymes PtpA and PtpB from M. tuberculosis were successfully cloned in expression vectors. The soluble expression of the proteins allowed the establishment of a standardized purification protocol. Crystallization assays were conducted, protein crystals were obtained, and crystallographic data were collected. We determine the crystallographic structure of PtpB in complex with a phosphate group in the catalytic site at high resolution. This structure was then used in the subsequent step for the discovery of new inhibitor candidates. Computational studies included a combination of strategies for identifying interaction points relevant to the process of molecular recognition and binding as well as the construction of 3D pharmacophore models specific for each enzyme. These data were used to select a set of 8 and 5 compounds as PtpA and PtpB inhibitor candidates, respectively. Therefore, structural molecular biology and medicinal chemistry studies have been successfully conducted for the establishment of a platform aimed to the production of the selected targets as well as for the selection of new inhibitor candidates.

A ampliação do conhecimento sobre as formas de comunicação, controle e regulação existentes em bactérias traz luz aos avanços no combate das infecções hospitalares que são responsáveis por inúmeros prejuízos relacionados à saúde pública em todo planeta. DUMOULIN et al (2013), descreveram o regulador transcricional (RT) ElrR, que regula positivamente a transcrição do gene elrA, um fator de virulência de Enterococcus faecalis. ElrA apresenta grande similaridade com as internalinas de Listeria monocytogenes, que facilitam a invasão da bactéria ao hospedeiro. ElrR é considerada como pertencente à família Rgg-like de RT exclusivo de bactérias Gram positivas. Por vários motivos a família Rgg foi inserida à superfamília RNPP, gerando a superfamília RRNPP de RT. Os RRNPP fazem parte de um sistema de regulação por quorum sensing (QS), um sistema de comunicação célula-célula dependente de densidade celular, com função associada na ativação ou inibição da expressão de proteínas relacionadas, dentre outros, à virulência, formação de biofilme e esporulação. Para a melhor compreensão do mecanismo de como ocorre a ativação da transcrição do fator de virulência ElrA, este trabalho apresenta resultados de expressão heteróloga em E. coli e purificação das proteínas ElrR e ElrA, bem como resultados de experimentos biofísicos que caracterizam algumas propriedades estruturais e biológicas destas proteínas. Utilizando técnicas de cromatografia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), anisotropia de fluorescência, espalhamento dinâmico de luz (DLS), cristalografia de raios X e ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi possível a obtenção da estrutura tridimensional de ElrR e de indícios da interação com uma região de 25bp do DNA. Realizou-se ainda, em colaboração com Dra. Pascale Serror, a tentativa de obtenção da molécula autoindutora (AI) de ElrR. São apresentados primeiros resultados da obtenção heteróloga de ElrA, sua purificação e cristalização, com importantes características que permitirão a continuação da investigação deste fator de virulência. ElrR é composta somente por alfa-hélices e apresenta-se dimérico em solução. Apesar da similaridade estrutural dos RRNPP, a identidade da sequência entre ElrR e os outros membros é extremamente baixa, o que motivou a resolução das fases cristalográficas experimentalmente. A estrutura de ElrR apresenta-se similar às homólogas, porém, com maior interface de interação entre os protômeros, que formam o dímero. O sítio de ligação do AI, em ElrR, apresenta-se mais amplo, com cavidade maior que as demais estruturas estudadas, conservando vários dos resíduos apresentados nos homólogos que realizam a estabilização do AI. Os altos fatores de temperatura dos cristais de ElrR, adicionado a anisotropia dos átomos, de uma das estruturas obtidas, apresenta a grande flexibilidade desse RT. Os indícios de interação entre ElrR e DNA aqui apresentados, obtidos por SPR e anisotropia de fluorescência, apresentam que ElrR liga especificamente ao fragmento proposto do DNA, ainda na ausência do AI. A não cristalização do complexo (ElrR-DNA), adicionada a alta flexibilidade apresentada na estrutura e a instabilidade observada na ligação ao DNA (por SPR) apontam para a obrigatoriedade da molécula de regulação (AI) para que o complexo ElrR-DNA seja estável. / The enhancing of the knowledge about communication, control and regulation in bacteria bring possibilities on the advance of hospital-acquired infections control responsible for various prejudices related to public health worldwide. DUMOULIN, et al (2013) described ElrR, a transcriptional regulator (TR), that positively regulates transcription of the elrA gene, which codifies a virulence factor of Enterococcus faecalis. ElrA shows high similarity with Listeria monocytogeneses internalins, which facilitates host invasion by these bacteria. ElrR are considered belonging to Rgg-like TR family exclusive of Gram positive bacteria. Several reasons include the Rgg family into the RNPP superfamily, generating the RRNPP superfamily of TR. The RRNPP are controlled by a quorum sensing (QS) regulation system, a cell-cell communication system based on cellular density that activates or inhibits the expression of proteins related with virulence, biofilm formation, sporulation, and others. For a better understanding of the transcription activation mechanism of ElrA, this work shows ElrR and ElrA heterologous expression in E. coli and purification of these proteins, as well as biophysics assays to characterize some structural and biological features of both proteins. Using chromatography, circular dichroism (CD), fluorescence anisotropy, dynamic light scattering (DLS), X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR) technics, it was possible to obtain the tridimensional structure of ElrR, and evidences of ElrR-DNA complex formation, confirming DNA interaction site of ElrR with a 25 bp fragment. In collaboration with Dr. Pascale Serror, we attempted to achieve the ElrR auto-induction (AI) molecule. Also, results of the heterologous obtainment of ElrA are presented, as well as ElrA purification and crystallization, presenting important characteristics which will allow the further investigation of this virulence factor in near future. ElrR is composed by alpha-helices presenting dimeric fold in solution. Despite the similarity between the RRNPP members, the low identity of ElrR to the other members motivates the experimental crystallographic phases solution. ElrR structure is very similar to the homologous structures, presenting a higher interface between the protomers that compose the dimer. Its AI binding site is wider than the other structures studied, conserving several amino acid residues presented at the homologous proteins, that stabilizes the AI molecule. High temperature factors of the amino acid residues showed in all the obtained ElrR crystallographic structures plus the anisotropy of the atoms in one of those structures show the high flexibility of this TR. The evidence of the ElrR-DNA complex presented in this study, obtained by SPR and fluorescence anisotropy, indicates that ElrR binds at the proposed DNA site even in the absence of the AI molecule. The failure to obtain the ElrR-DNA complex crystals added to the high flexibility presented at some places of the structure and the observed instability at the formed complex (observed at SPR) suggest the mandatory need of the AI molecule to create a stable ElrR-DNA complex.

Neste trabalho foram desenvolvidas amostras de materiais padrão de referência para difratometria de policristais. Materiais de alta pureza foram tratados mecânica e termicamente até atingirem as características necessárias para serem usados como materiais padrão de referência de alta qualidade, comparáveis àqueles produzidos pelo NIST. As medidas foram feitas inicialmente em vários difratômetros convencionais de laboratório de difração de raios X, com geometria de Bragg -Brentano, difratômetros de nêutrons e, posteriormente, em equipamento de alta resolução com fonte síncrotron. Os parâmetros de rede obtidos foram calculados pelo programa Origin e ajustados pelo Método dos Mínimos Quadrados. Esses ajustes foram comparados com os obtidos pelo Método de Rietveld, usando o programa GSAS através da interface gráfica EXPGUI, mostrando-se bastante satisfatórios. Os materiais obtidos foram alumina-α, ítria, silício, céria, hexaboreto de lantânio e fluoreto de lítio, que apresentaram qualidade semelhante e, em alguns casos, superiores aos padrões desenvolvidos e comercializados pelo NIST, a custos bem menores. / In this work, samples of standard reference materials for diffractometry of polycrystals were developed. High-purity materials were submitted to mechanical and thermal treatments in order to present the adequate properties to be used as high-quality standard reference materials for powder diffraction, comparable to the internationally recognized produced by the USA National Institute of Standards and Technology NIST, but at lower costs. The characterization of the standard materials was performed by measurements in conventional X-ray diffraction diffractometers, high resolution neutron diffraction and high-resolution synchrotron diffraction. The lattice parameters were calculated by extrapolation of the values obtained from each X-ray reflection against cos2θ by the Least-Squares Method. The adjustments were compared to the values obtained by the Rietveld Method, using the program GSAS. The materials thus obtained were the α-alumina, yttrium oxide, silicon, cerium oxide, lanthanum hexaboride and lithium fluoride. The standard reference materials produced present quality similar or, in some cases, superior to the standard reference materials produced and commercialized by the NIST.