O ingrediente farmacêutico ativo (API) doxiciclina (DOX), C22H24N2O8, 2-naphthacenecarboxamide, nome IUPAC 4(dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,5,10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-, [4S-(4α, 4aα, 5α, 5aα, 6α,12aα)], é um antibiótico de largo espetro usado no tratamento de infecções respiratórias e do trato urinário e, a exemplo de outros medicamentos, pode ter a eficácia afetada pelo fenômeno do polimorfismo em sólidos farmacêuticos. Até o presente momento, só é conhecida a estrutura cristalina do hiclato de doxiciclina (DOX•HIC), C22H24N2O8, HCl, ½ C2H6O (etanol), ½ H2O, 512,9 g/mol, o qual é o nome genérico da forma pseudo-polimórfica da DOX usada como API de medicamentos de referencia como DORYX®, PERIOSTAT®, ATRIDOX® e VIBRAMYCIN®. Parte desse trabalho apresenta, pela primeira vez, a caracterização estrutural por meio de difração de raios X por monocristal (MXRD), de outra forma pseudo-polimórfica comercial da DOX conhecida como doxiciclina mono-hidratada (DOX•H2O), C22H24N2O8, H2O, 462,45 g/mol, o qual é o nome genérico do insumo usado na fabricação de medicamentos de referencia como MONODOX® e ORACEA®. Além de reportar pela primeira vez a estrutura da DOX•H2O, nesse trabalho foram sintetizadas e cristalizadas duas novas formas pseudo-polimórficas da DOX: 1) A doxiciclina dihidratada co-cristalizada/solvatada com ácido acético (DOX•HAc), C22H24N2O8, 2H2O, C2H4O2 (ácido acético), 512,93 g/mol; e 2) o nitrato de doxiciclina hemi-hidratado (DOX•NIT), C22H24N2O8, HNO3, ½H2O, 516,46 g/mol. As estruturas cristalinas das duas formas inéditas também foram determinadas inambiguamente por MXRD. As estruturas das três formas pseudo-polimorfos inéditas da DOX foram comparadas à estrutura do DOX•HIC e analisadas em termos de suas geometrias intra e intermoleculares. Todas as formas cristalizam-se como “zwitterions” da DOX no qual o grupo dimetilamina está protonado e uma hidroxila está desprotonada. Dois confôrmeros foram observados para a DOX•NIT, a exemplo do que foi observado previamente para o DOX•HIC, o que significa que o grupo amina está próximo do enolato de um dos confôrmeros (T1) e próximo à carbonila no outro (T2). Em outras palavras, ocorre uma rotação de 180º em torno da ligação C-C do grupo amida que direciona o oxigênio do grupo amida para a direção do grupo dimetilamina, no caso de um dos confôrmeros (T1) presente no estado sólido, enquanto na outra molécula de DOX, independente por simetria (T2), o átomo de nitrogênio da amida está do mesmo lado da amina. Outra importante similaridade entre o DOX•HIC e o DOX•NIT é que em ambas a DOX possui duas cargas positivas e uma negativa e é portanto um cátion, diferentemente da DOX•H2O e da DOX•HAc, para as quais o “zwitterion” gera uma carga positiva e uma negativa, sendo a molécula neutra. Apesar da DOX•H2O e da DOX•HAc serem neutras e apresentarem apenas uma moléculas de DOX na unidade assimétrica, as duas estruturas diferem significativamente em outros aspectos estruturais. Na DOX∙HAc é o átomo de nitrogênio do grupo amida que está voltado para o grupo dimetilamina, enquanto na DOX·H2O é o átomo de oxigênio da amida que está voltado para o grupo dimetilamina. Portanto, a DOX·HAc sólido exibe a forma tautomérica e a conformação da amida observada no DOX∙HYC T2, enquanto a DOX·H2O sólida exibe a forma tautomérica do DOX∙HYC T2 e a conformação da amida do DOX∙HYC T1. Em termos gerais, desde que a doxiciclina é uma molécula robusta do ponto de vista conformacional (poucos ângulos diedros), sua geometria intramolecular apresenta poucas distorções como resultado de forças intermoleculares. Contudo, a presença de solventes, águas e íons na rede cristalina parece afetar a rotação da ligação C-C da amida levando aos confôrmeros e, ou tautômeros T1 e T2. O empacotamento cristalino das formas pseudo-polimórficas da DOX estudadas nesse trabalho são estabilizadas por várias ligações de hidrogênio intermoleculares clássicas e não-clássicas envolvendo interações DOX-DOX, DOX-água, DOX-solvente, DOX-íon, água-água, solvente-solvente, íon-íon, água-solvente, íon-solvente e íon-água. Essas diferenças nas interações intermoleculares tem como consequência comportamentos diferenciados na solubilidade e no perfil de dissolução do DOX•HIC, da DOX•H2O, da DOX•HAc e do DOX•NIT. Apesar disso, os testes de dissolução e solubilidade mostraram que todas as formas pseudo-polimórficas apresentam biodisponibilidade equivalente aos API comercializados. Todas as formas pseudo-polimórficas foram também caracterizadas por difração de raios X por pó e espectroscopia na região do infravermelho. / The active pharmaceutical ingredient (API) doxycycline (DOX), C22H24N2O8, 2-naphthacenecarboxamide, IUPAC name 4(dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,5,10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-, [4S-(4α, 4aα, 5α, 5aα, 6α,12aα)], is a broad-spectrum antibiotic mainly used in the treatment of respiratory and urinary tract infections and, like many drugs, its efficacy may be affected by the polymorphism phenomenon. Up to now, only the crystal structure of doxycycline hyclate (DOX•HIC), C22H24N2O8, HCl, ½ C2H6O (ethanol), ½ H2O, 512,9 g/mol, which is the generic name of a DOX pseudo-polymorphic form used as API in brand names such as DORYX®, PERIOSTAT®, ATRIDOX®, and VIBRAMYCIN®, has been reported. Part of this study presents the monocrystal X-ray diffractometry (MXRD) structural characterization of another DOX commercial pseudo-polymorphic form, namely, doxycycline monohydrate (DOX•H2O), C22H24N2O8, H2O, 462,45 g/mol, which is the generic name of brand names such as MONODOX® and ORACEA®. Beyond to report for the first time the crystal structure of DOX•H2O, others two news pseudo-polymorphic forms of the DOX were synthetized and crystallized in the present study: 1) doxycycline dihydrate co-crystallized/solvated with acetic acid (DOX•HAc), C22H24N2O8, 2H2O, C2H4O2 (acetic acid), 512,93 g/mol; and 2) doxycycline nitrate hemihydrate (DOX•NIT), C22H24N2O8, HNO3, ½H2O, 516,46 g/mol. The crystal structure of DOX•HAc and DOX•NIT were also unambiguously determined by MXRD methods. The three new pseudo-polymorphic forms of DOX were compared with the known one, DOX•HIC, and analyzed in terms of intra and intermolecular geometries. All forms crystallize as zwitterions in which the dimethylamine group is protonated and one hydroxyl group is disprotonated. Two conformers were observed in the DOX•NIT as previously reported for DOX•HIC, i.e., the amine group is next to the enolate in one of them (T1) and beside the carbonyl in the other one (T2). In other words, occurs a rotation around the C–C bond of the amide group, directing the oxygen toward the amine group in one (T1) of the two conformers present in these solid state phases, while in the other crystallographically independent molecule (T2), the amide nitrogen atom is at the same side of the amine. Another important similarity of DOX•HIC and DOX•NIT is that in both structure the DOX appears as a cation, differently of DOX•H2O and DOX•HAc for which the DOX is neutral. In spite of being both neutral and present just one DOX molecule in the asymmetric unit, DOX•H2O and DOX•HAc differ themselves. While DOX•HIC and DOX•NIT present two tautomers, T1 and T2, the conformer T1 and tautomerism observed for T2 was found in DOX•HAc and either conformer or tautomer of T2 was found in DOX•H2O. In general, since doxycycline is a conformationally robust molecule, its framework adopts only small distortions due to variable intermolecular hydrogen bonding patterns. Nevertheless, the presence of crystallization solvent, water and/or ions in the lattice affects the rotation around the C–C bond of the amide group, directing the NH2 portion toward the amine in one (T2) of the two crystallographically independent molecules, while in the another one (T1), the amide oxygen atom is next to amine.. The crystal packing of DOX forms studied here are stabilized by several intermolecular hydrogen bonds (classical and non-classical), involving interactions DOX-DOX, DOX-water, DOX-solvent, DOX-ion water-water, solvent-solvent, ion-ion, water-solvent, ion-solvent, ion-water. The differences of these supramolecular interactions when the pseudo-polymorphic forms are compared result in significant differences in the solubility and in the dissolution profile of the DOX•HIC, DOX•H2O, DOX•HAc, and DOX•NIT also performed in this work. However, all forms do not show significant differences in the bioavailability of the API DOX. The four DOX pseudo-polymorphic forms were also characterized by powder X-ray diffraction and infrared spectroscopy. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A presente dissertação de Mestrado é dividida em duas partes: a primeira, dedicada à obtenção de extratos das sementes e frutos de Rheedia brasiliensis Pl. & T para isolamento de benzofenonas polipreniladas bioativas e identificação de suas estruturas moleculares e cristalinas, contem dois artigos científicos acerca da elucidação estrutural, por técnicas espectroscópicas e cristalográficas, de dois produtos naturais, gutiferona A e garciniafenona; a segunda, por sua vez, é constituída de um artigo científico no qual é descrita a atividade inibitória dos dois compostos supracitados e de outras duas benzofenonas, epiclusianona, também isolada de Rheedia brasiliensis, e 2,2’,4-triidroxibenzofenona, sintetizada através de substituição eletrofílica aromática, sobre quatro proteases: papaína, tripsina, catepsina B e catepsina G. Garciniafenona foi isolada pioneiramente dos frutos de Rheedia brasiliensis e sua completa caracterização é apresentada em um dos artigos supracitados. No outro, a estrutura cristalográfica de gutiferona A, uma benzofenona natural com propriedades inibitórias sobre a infecção por HIV e isolada pela primeira vez de Symphonia globulifera, é reportada. Em ambos os artigos, as estruturas de garciniafenona e gutiferona A são discutidas comparando os parâmetros geométricos, eletrônicos e estéricos determinados, com aqueles descritos na literatura para epiclusianona e o seu epímero, clusianona, esclarecendo relações entre configuração e tautomerismo ceto-enólico. O artigo relativo ao efeito inibitório das benzofenonas sobre proteases traz resultados experimentais que foram correlacionados com certos motivos estruturais cristalograficamente estimados, possibilitando o estabelecimento de relações entre as estruturas químicas dos compostos testados e a atividade anti-proteolítica, as quais são fortemente suportadas por ensaios computacionais de ancoragem dos inibidores no alvo macromolecular. / The present Master degree dissertation contains two parts: the first one, which was devoted to extract preparation from Rheedia brasiliensis seeds and fruits in order to isolate bioactive polyprenylated benzophenones and to identify their molecular and crystalline structures, leads two articles on structural elucidation of two natural products by X-ray crystallography and spectroscopic techniques: guttiferone A and garciniaphenone; the second one is a paper describing the inhibiting activity of the two compounds before mentioned and other two benzophenone-type derivatives, epiclusianone, which was also isolated from Rheedia brasiliensis, and 2,2’,4- trihydroxybenzophenone, which was synthesized by aromatic electrophilic substitution, against four proteases, papain, trypsin, cathepsin B and cathepsin G. Garciniaphenone has been discovered for the first time in Rheedia brasiliensis fruits and its complete characterization is given on a paper of the series. The crystallographic structure of a HIV-inhibitory benzophenone that was initially isolated from Symphonia globulifera, guttiferone A, is reported on another article of the series. On both papers, the structures of garciniaphenone and guttiferone A are analyzed matching their steric, electronic and geometrical features to that found in the literature for epiclusianone and its epimer, clusianone, which has allowed to state relationships between configuration and keto-enol tautomerism. The article concerning the inhibiting effect of benzophenones on proteases shows experimental data that were correlated with certain structural motifs determined by X-ray diffraction crystallography, establishing structure-activity relationships strongly supported by theoretical investigations using computational docking to predict the inhibitor-enzyme complex interaction pattern. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Neste trabalho serão apresentados os quatro polimorfos do fármaco diurético e anti-hipertensivo Clortalidona, (RS)-2-Cloro-5-(1-hidroxi-3-oxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-1-il)benzeno-1-sulfonamida (CTD), ressaltando que todos eles foram elucidados pelo Grupo de Cristalografia da UNIFAL-MG e que o polimorfo mais recentemente elucidado, forma II, é um resultado direto da condução deste trabalho de Mestrado. Será estabelecida uma correlação estrutura/propriedades do estado sólido para explicar as diferenças nos resultados obtidos pela caracterização dos polimorfos I e II da CTD por Espectroscopia de absorção no Infravermelho (IV) e Análises térmicas (TG/DSC) com base nas características estruturais de ambos os polimorfos, evidenciando como o fenômeno do polimorfismo pode impactar e afetar as propriedades físico-químicas de um IFA sólido. Também serão apresentadas duas estruturas cristalinas inéditas do ácido 4’-cloro-3’-sulfamoilbenzofenona carboxílico (CCA), o qual é um produto de hidrólise da CTD e consiste em uma impureza inerente às suas formulações, mas que também é um composto biologicamente ativo e pode atuar como diurético. Além disso, serão apresentadas as rotas sintéticas que resultaram na formação do CCA e de outras duas substâncias relacionadas à CTD, bem como um estudo mecanístico que permite prever e propor a síntese de outros compostos. / In this work will be presented the four polymorphs of the diuretic and antihypertensive drug Chlorthalidone, (RS)-2-Chloro-5-(1-hydroxy-3-oxo2,3-dihydro-1H-isoindol-1-yl)benzene-1-sulfonamide (CTD) , noting that all of them were elucidated by the Group of Crystallography of the UNIFAL-MG and polymorph recently elucidated , is a direct result of the conduct of this work of Science Master. There will be correlation structure/properties of solid state to explain the differences in results obtained by the characterization of polymorphs I and II of the CTD by infrared spectroscopy and thermal analysis based on the intrinsic structural features of both polymorphs, showing as the phenomenon of polymorphism can impact and affect the physicochemical properties of a drug. Two novel crystal structures of 4’-chloro-3’-sulfamoylbenzophenone carboxylic acid (CCA) will also be presented. This is a hydrolysis product of CTD and also a biologically active compound that can act as a diuretic. Furthermore, synthetic routes that resulted in the formation of CCA and two other CTD related substances will be presented, as well as a mechanistic study that allows predict and propose the synthesis of other related compounds. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Os dispositivos SAW (SurfaceAcousticWaves) são amplamente empregados em diversas aplicações, tais como a utilização em sistemas de telecomunicações, desde celulares até diversos dispositivos eletrônicos sem fio (wireless), como ressonadores e filtros. Outra aplicação importante, atribuída a esses dispositivos, é a de sensores, podendo atuar na área química, biológica e mecânica. Operam em diversos ambientes e são funcionais em uma vasta faixa de frequências, desde uma escala de centésimos de hertz até centenas de terahertz. Estes dispositivos são constituídos por um substrato recoberto por um material piezoelétrico e estimulados por sinais ondulatórios que se propagam ao longo de sua superfície. Sobre o revestimento piezoelétrico são depositados eletrodos metálicos chamadas de transdutores interdigitais (IDTs), que são responsáveis pelos estímulos ondulatórios e pelo acoplamento eletromecânico do dispositivo. Neste trabalho é apresentado o dispositivo SAW, a sua estrutura, a simulação da propagação ondulatória sobre a superfície de nitreto de alumínio (AlN) e a caracterização elétrica de um dispositivo. As propriedades mecânicas e elétricas do material piezoelétrico foram avaliadas com o intuito de compreender os fundamentos físicos durante a propagação da onda. A propagação ondulatória sobre a superfície de AlN, com diferentes espessuras, foi analisada em simulações utilizando o programa COMSOL Multiphysics. As espessuras de AlN simuladas foram de 5,0 ?m e 1,0 ?m, observando-se que em ambas as simulações a propagação ondulatória ocorre preferencialmente na superfície do material. As respostas de intensidade de sinal (dB) em função da frequência (MHz) de um dispositivo SAW foram obtidas através da análise das caracterizações de perdas de inserção (InsertionLoos - IL) e perdas por retorno (ReturnLoos - RL) e as medidas de frequência de ressonância atingiram valores em torno de 10,0 MHz.

Os receptores nucleares são uma família de fatores de transcrição que regulam a transcrição gênica em resposta a ligantes e estão envolvidos em vários processos fisiológicos e metabólicos do organismo. O receptor ativado por proliferadores peroxissomais γ (PPARγ) está envolvido em vários processos fisiológicos incluindo adipogênese, homeostase da glicose, metabolismo de lipídios e inflamação e foi identificado como alvo molecular para o tratamento do diabetes tipo II. A importância desse receptor ficou ainda mais evidente pela descoberta de mutações que prejudicam sua função, causando a Síndrome de Resistência ao Ligante, na qual os pacientes apresentam um fenótipo de lipodistrofia parcial, profundas desordens metabólicas como severa resistência à insulina e início precoce de diabetes mellitus tipo II. O PPARγ possui um amplo bolsão de ligação que permite que uma variedade de ligantes possa se ligar ao receptor. Essa variedade de ligantes pode induzir interações diferenciadas com correguladores, o que induzirá uma resposta biológica específica. Os agonistas totais, como as tiazolinedionas (TZDs) são eficientes sensibilizadores da insulina utilizados no tratamento do diabetes tipo II, porém seu uso tem sido limitado devido a efeitos adversos e novas abordagens terapêuticas são necessárias. Neste trabalho, o PPARγ foi caracterizado na presença de ligantes naturais (luteolina, ácidos graxos) e sintéticos (aintiinflamatórios não esteroidais AINEs) e também os mutantes envolvidos na Síndrome de Resistência aos Ligantes do PPARγ através de ensaios funcionais e cristalografia de proteínas. A luteolina apresentou um comportamento de agonista parcial, com atividades antiinflamatórias e com modo de ligação ao receptor diferente da rosiglitazona, resultando em uma diferenciação na expressão gênica em adipócitos. Os AINEs por sua vez, apresentaram diferentes perfis de ativação e modos de ligação ao receptor, além da capacidade de induzirem a diferenciação de adipócitos. Por fim, foi resolvida a estrutura cristalográfica do mutante V290M envolvido na Síndrome de Resistência ao Ligante, que mostrou que a mutação causa significativas alterações na estrutura do receptor, prejudicando sua função, o que representa um importante passo no entendimento das bases moleculares dessa síndrome. / Nuclear receptors are a family of ligand activated trancription factors that regulate gene transcription in response to ligands and are involved in several aspects of human physiology and metabolism. Peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) is involved in a range of distinct physiological processes including the regulation of adipogenesis, glucose homeostasis, lipid metabolism and inflammatory responses and it has been identified as a molecular target in the treatment of several diseases as diabetes type II. The importance of this receptor became even more evident by the discovery of mutations that impair its function causing Ligand Resistance Syndrome, in which patients have a phenotype of partial lipodystrophy, profound metabolic disorders such as severe insulin resistance and early onset of diabetes mellitus type II. PPARγ has a large binding pocket that permits that a wide range of ligands can bind to this receptor. This variety of ligands can induce differential interactions with coregulatory factors that will be translated into a specific biological response. PPAR full agonists, like thiazolidinediones (TZDs), are effective insulin sensitizers and antiinflammatories but their use is limited by adverse side effects and new therapeutic approaches are needed. In this study, the PPARγ, as well as their respective mutants involved in Ligand Resistance Syndrome, were characterized in the presence of natural (luteolin) and synthetic ligands (nonsteroidal anti-inflamatory drugs - NSAIDs) by functional assays and protein crystallography. Luteolin showed a partial agonist behaviour, with anti-inflammatory activity and a different binding mode in comparion with rosiglitazone, resulting in a different pattern of gene expression in adipocytes. NSAIDs showed different profiles of activation and binding modes, and they can promote adipocyte differentiation. Finally, we solved the crystal structure of the mutant V290M involved in the Ligand Resistance Syndrome, which showed that the mutation causes significant changes in the structure of the receptor, impairing its function. This structure represents an important step in understanding the molecular basis of this syndrome.

Orientador: Marcio Vinicius Bertacine Dias / Banca: Gustavo Fernando Mercaldi / Banca: Cristiane Rodrigues Guzzo Carvalho / Banca: Robson Francisco de Souza / Banca: Felipe Santiago Chambergo Alcade / Resumo: As epóxido hidrolases (EHs) são enzimas que catalisam a conversão de epóxidos em dióis vicinais. Esses compostos são menos reativos, menos mutagênicos, menos tóxicos e são excretados mais rapidamente das células pois apresentam maior solubilidade. Nas reações de catálise, as EHs utilizam a água como o único co-substrato, o que é uma característica particular desta classe enzimática. Em microrganismos, elas atuam na adaptação ao meio ambiente, metabolizando fontes naturais de carbono e contaminantes. Em patógenos, como M. tuberculosis, atuam na virulência e desintoxicação. Além disso, têm importantes aplicações industriais, farmacêuticas e agroquímicas, como a degradação de xenobióticos, separação enantiomérica de misturas de epóxidos, hidrólise regio e enantiosseletiva de de epóxidos quirais e biossíntese de antibióticos poliéteres ionóforos. Os objetivos do presente trabalho são a cristalização e resolução estrutural das epóxido hidrolases B1EPH2 de Streptomyces wadayamensis e TrEH de Trichoderma reesei, que apresentam interesse biotecnológico devido a propriedades enantioseletivas e do mutante Lsd19 E197D (S. lasaliensis) e TsnB (S. longisporoflavius), envolvidas na biossíntese dos antibióticos poliéteres ionóforos lasalocida e tetronasina, respectivamente. Estas enzimas foram co-cristalizadas com diferentes epóxidos, inibidores, substratos e análogos de substrato e as estruturas foram resolvidas por substituição molecular. A B1EPH2 e TrEH apresentaram... / Abstract: Epoxide hydrolases (EHs) are enzymes that catalyze the conversion of epoxides to vicinal diols. These compounds are less reactive, less mutagenic, less toxic and are excreted more rapidly from the cells because they have greater solubility. In the catalysis reactions, the EHs use water as the only co-substrate, which is a particular characteristic of this enzymatic class. In microorganisms, they act in the adaptation to the environment, metabolizing natural sources of carbon and contaminants. In pathogens, such as M. tuberculosis, they act on virulence and detoxification. In addition, they have important industrial, pharmaceutical and agrochemical applications, such as degradation of xenobiotics, enantiomeric separation of epoxide mixtures, regio and enantioselective hydrolysis of chiral epoxides and biosynthesis of ionophores polyethers antibiotics. The objectives of the present work are the crystallization and structural resolution of the epoxide hydrolases B1EPH2 from Streptomyces wadayamensis and TrEH from Trichoderma reesei, which show biotechnological interest due to enantioselective properties and the mutant Lsd19 E197D (S. lasaliensis) and TsnB (S. longisporoflavius), involved in the biosynthesis of the ionophores antibiotics lasalocid and tetronasin, respectively. These enzymes were co-crystallized with different epoxides, inhibitors, substrates and substrate analogues and the structures were resolved by molecular substitution. B1EPH2 and TrEH showed ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-05-26Bitstream added on 2014-06-13T19:19:38Z : No. of bitstreams: 1 watanabe_l_dr_sjrp.pdf: 4283837 bytes, checksum: 4fd2d1873c6c4b18af51c7364b914145 (MD5) / A cristalografia tem tido um papel significativo no melhoramento do nosso entendimento no modo de ação das molécular biológicas, resultando em abrangentes aplicações indústriais desta técnica. Dentro das grandes linhas de estudos envolvendo a enzima Álcool Desidrogenase Secindária (SADH) de bactérias termofílicas, essa pesquisa procurou entender as bases estruturais que controlam e regulam (i) a especificidade dela por seu substrato. Com o objetivo de aperfeiçoar suas atuais aplicações como um catalisador nas fermentações alcoólicas industriais e como catalisador em sínteses assimétricas nas indústrias faramcêuticas. Poderosas técnicas de mutagênese combinadas com cristalografia foram utilizadas. Mutações de resíduos (Gly 198 r Tyr218) que interagem com o cofator e são considerados importantes para a determinação da sua especificidade, foram planejados e executados com o objetivo de permitir o uso de um cofator alternativo que é viável para uso em escala industrial. Análises cinéticas do mutante Gly198 indicam que este é um potencial candidato e é um passo na direção certa. Mutações em aminoácidos que formam o sítio ativo foram conduzidos em um pesquisa para uma mutação com uma grande habilidade em reduzir cetonas, produzindo uma grande variedade de (R)-álcoois. Onze mutantes foram desenvolvidos e que podem exibir essas característica desejadas. Três destas enzimas mutantes foram cristalizadas e duas delas na presença de NADP e suas estruturas foram determinadas e refinadas com o objetivo de entender as bases estruturais da sua enantioseletividade para posterior desenvolvimento de uma enzima mais eficiente na utlização de cofator e produção de substratos específicos / Crystallography has played role in significantly improving our understanding of the mode of action of biological molecules resulting in wide industrial applications of thies technique.Within the framework of research dealing with Secondary Alcohol Dehydrogenases (SADHs) isolated from thermophilic bacteria, this project aims at understanding the strucutral basis which control and regulate (i) the specificity of this enzyme for the cafactor and (ii) its stereo and enantio selectivity for its substrate. With the aim of widening its realm of application as a catalyst in industrial fermentation of alcohols and as calyst in the asymmetric synthesis as applied pharmaceutically. The powerful techniques of mutagenesis combined with crystallography were utilized. Mutations of residues (Gly198 and Tyr218) wich interact with the cofactor and are considered important for determinimg its specificity were planned and executed in an attempt to permit the use of an alternative cofactor which is viable for use in an industrial scale. Kinetic analysis of the mutant (Gly198) indicates that this is a potential candiadate and is a step in the right direction. mutations of amino acids that form the active site were conducted in a search for a mutant with a greater ability to reduce ketones, producing a wide variety of r-alcohols

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Ana Marisa Chudzinsky-Tavassi / Banca: Francisco Javier Medrano Martin / Banca: Richard Charles Garratt / Resumo: A cristalografia tem tido um papel significativo no melhoramento do nosso entendimento no modo de ação das molécular biológicas, resultando em abrangentes aplicações indústriais desta técnica. Dentro das grandes linhas de estudos envolvendo a enzima Álcool Desidrogenase Secindária (SADH) de bactérias termofílicas, essa pesquisa procurou entender as bases estruturais que controlam e regulam (i) a especificidade dela por seu substrato. Com o objetivo de aperfeiçoar suas atuais aplicações como um catalisador nas fermentações alcoólicas industriais e como catalisador em sínteses assimétricas nas indústrias faramcêuticas. Poderosas técnicas de mutagênese combinadas com cristalografia foram utilizadas. Mutações de resíduos (Gly 198 r Tyr218) que interagem com o cofator e são considerados importantes para a determinação da sua especificidade, foram planejados e executados com o objetivo de permitir o uso de um cofator alternativo que é viável para uso em escala industrial. Análises cinéticas do mutante Gly198 indicam que este é um potencial candidato e é um passo na direção certa. Mutações em aminoácidos que formam o sítio ativo foram conduzidos em um pesquisa para uma mutação com uma grande habilidade em reduzir cetonas, produzindo uma grande variedade de (R)-álcoois. Onze mutantes foram desenvolvidos e que podem exibir essas característica desejadas. Três destas enzimas mutantes foram cristalizadas e duas delas na presença de NADP e suas estruturas foram determinadas e refinadas com o objetivo de entender as bases estruturais da sua enantioseletividade para posterior desenvolvimento de uma enzima mais eficiente na utlização de cofator e produção de substratos específicos / Abstract: Crystallography has played role in significantly improving our understanding of the mode of action of biological molecules resulting in wide industrial applications of thies technique.Within the framework of research dealing with Secondary Alcohol Dehydrogenases (SADHs) isolated from thermophilic bacteria, this project aims at understanding the strucutral basis which control and regulate (i) the specificity of this enzyme for the cafactor and (ii) its stereo and enantio selectivity for its substrate. With the aim of widening its realm of application as a catalyst in industrial fermentation of alcohols and as calyst in the asymmetric synthesis as applied pharmaceutically. The powerful techniques of mutagenesis combined with crystallography were utilized. Mutations of residues (Gly198 and Tyr218) wich interact with the cofactor and are considered important for determinimg its specificity were planned and executed in an attempt to permit the use of an alternative cofactor which is viable for use in an industrial scale. Kinetic analysis of the mutant (Gly198) indicates that this is a potential candiadate and is a step in the right direction. mutations of amino acids that form the active site were conducted in a search for a mutant with a greater ability to reduce ketones, producing a wide variety of r-alcohols / Doutor

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Coorientador: Agnes Alessandra Sekijima Takeda / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Rafael Lemos Miguez Counãgo / Banca: Valber de Albuquerque Pedrosa / Banca: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: Danos no DNA, podem ocorrer tanto por agentes genotóxicos endógenos quanto agentes exógenos, que podem promover a instabilidade do genoma e levar diretamente a doenças, como por exemplo, o câncer, alterações neurológicas, imunodeficiências e envelhecimento prematuro. Auxiliando na manutenção da estabilidade, as células apresentam uma série de vias de reparo de DNA, as quais realizam o processo em múltiplas etapas para resolver lesões específicas no DNA e manter a integridade do genoma. A importação nuclear é um pré-requisito para as funções das proteínas de reparo do DNA e dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. A Importina-β (Impβ) atua como o transportador enquanto a Importina-α (Impα) atua como adaptador, reconhecendo as sequências de localização nuclear (NLS) presentes nas proteínas que possuem função no núcleo. Esse trabalho trata especificamente dos estudos estruturais de complexos da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando técnicas de cristalografia e ensaios de afinidade pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A expressão e purificação da Impα de Mus musculus truncada em sua porção N-terminal foi realizada, bem como a co-cristalização da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA, correspondentes as sequências MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2. Peptídeos mutados em regiões importantes de reconhecimento nuclear para os peptídeos MLH1 e PMS2 também foram selecionados para o desenvolvimento deste projeto. Dados de difração de raios-X foram coletados dos cristais obtidos e processados no intervalo de 2,0-2,8 Å de resolução. Com esses resultados, as estruturas contendo cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2 foram elucidadas. As proteínas do complexo MutLα, a MLH1 e... / Abstract: DNA damage can occur by endogenous and exogenous genotoxic agents, which may promote instability of the genome and directly lead to diseases such as cancer, neurological disorders, immunodeficiencies and even premature aging. Helping in the maintenance of the stability, the cells display a number of DNA repair pathways, which carry out the process in multiple steps to resolve specific DNA damage, and maintain the integrity of the genome. The nuclear import is a pre-requisite for the functions of DNA repair proteins and, among the mechanisms responsible for regulation of nuclear import, the classical pathway constituted by the heterodimer importin-α / β is a major shift mechanisms. Importin-β (Impβ) acts as the carrier while the importin α-(Impα) acts as an adapter recognizing the nuclear localization sequence (NLS) present in proteins that have function into the nucleus.This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques and binding assays by isotermal titration calorimetry technique (ITC). The expression and purification of Mus musculus Impα truncated at its N-terminal portion was performed, as well as co-crystallization with Impα NLSs peptides of proteins related to DNA repair, the corresponding sequences MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2. Peptides mutated in key regions of nuclear recognition for MLH1 and PMS2 peptides were also selected for this project. X-ray diffraction data collected from crystals were obtained and processed in the range of 2.0-2.8 Å resolution. With these results, the structures containing cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2 were elucidated. The MutLα complex proteins, MLH1 and PMS2, related to the mismatch repair (MMR), bound to the Impα similarly to the T antigen NLS of SV40 in the major binding site. ITC experiments corroborate the crystallographic results, which suggest that both NLSs are classic... / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A teoria dinÃmica da difraÃÃo de raios X Ã uma teoria que ao contrÃrio da teoria cinemÃtica tem sua origem nas equaÃÃes de Maxwell e na lei de Bragg e com um tratamento fÃsico mais completo e adequado levando em consideraÃÃo todas as interaÃÃes entre os campos de onda eletromagnÃticos dentro do cristal e logo, leva em conta tambÃm, as propriedades fÃsicas do meio cristalino. Estas interaÃÃes trazem consigo efeitos que sÃo desprezados na teoria cinemÃtica, teoria mais tradicional e mais comumente utilizada quando se trata de difraÃÃo de cristais pouco espessos. Este trabalho visa calcular os perfis de difraÃÃo pela teoria dinÃmica com o intuito de confirmar e analisar a presenÃa dos efeitos dinÃmicos que, por sua vez, se acentuam com o aumento da espessura da amostra. Esses efeitos sÃo a absorÃÃo anÃmala e os efeitos de extinÃÃo. Os cÃlculos foram feitos com o uso da linguagem de programaÃÃo Fortran 90 aplicados em monocristais de silÃcio, germÃnio, arseneto de gÃlio e fosfeto de Ãndio, com o objetivo de estudar a influÃncia da espessura do cristal e da razÃo entre as partes imaginÃria e real do fator de estrutura, nos perfis de difraÃÃo. Por fim, tendo-se a largura a meia altura, determinados pelos grÃficos dos perfis, em funÃÃo da espessura pÃde-se concluir que a equaÃÃo de Scherrer se aplica bem em cristais pouco espessos, regiÃo de espessura onde os efeitos dinÃmicos sÃo desprezÃveis.