Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345764.pdf: 1327591 bytes, checksum: 16526788a991cb47c5948515e0df47a4 (MD5) Previous issue date: 2016 / Surtos de doença de Chagas aguda associados à transmissão pela via oral têm sido reportados no Brasil e em outros países da América do Sul. Contudo, estudos sobre a dinâmica da infecção por via oral ainda são incipientes. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a interação in vitro e in vivo de linhagens transfectadas de T. cruzi TcI e TcII com plasmídeos pTREXRFP/GFPNeo e pROCKGFPNeo. Para tanto, foram geradas linhagens da cepa SC25 (TcI) e SC96 (TcII) expressando de maneira estável as proteínas fluorescentes RFPe GFP, respectivamente. A cepa Y expressando GFP foi utilizada em ensaios de interação parasito-hospedeiro. Estudos in vitro mostraram que a transfecção não alterou o crescimento e a capacidade de infecção das cepas. Ensaios de co-infecção em células THP-1 mostraram que misturas de parasitos TcI e TcII em diferentes proporções apresentaram níveis de infecção inferiores aos observados para as cepas em infecções isoladas eque uma mesma célula comporta a infecção pelas duas linhagens de parasitos. Triatomíneos infectados isoladamente com cada uma das cepas transfectadas apresentaram taxa de infecção semelhante. Contrariamente, infecções mistas nos insetos mostraram um predomínio de parasitos da linhagem TcII. Em camundongos a infecção pela via oral da cepa TcI não foi capaz de induzir parasitemia sanguínea detectável nos animais. Por outro lado, a cepa YGFP ocasionou parasitemia sanguínea patente e nas inoculações com misturas de TcI e TcII, apenas parasitos TcII foram detectados no sangue e tecidos de animais infectados. O tratamento de tripomastigotas da cepa SC25RFP com pepsina reduziu significativamente sua capacidade de infecção em células THP-1, sugerindo que a passagem pelo ambiente gástrico pode ter interferido negativamente na infecção de camundongos pela via oral. A avaliação histopatológica mostrou que o processo inflamatório na fase aguda foi mais intenso e com presença de parasitismo apenas no tecido cardíaco para a cepa YGFP. Na fase crônica a inflamação foi reduzida e não foram encontrados parasitos visíveis nos tecidos avaliados. Contudo, a PCR revelou a presença de DNA do parasito em todos os tecidos examinados. Os resultados do presente trabalho sugerem que a dinâmica da co-infecção está mais associada às características das cepas de T. cruzi do que a linhagem genética (DTU) à que elas pertencem. Parasitos transfectados expressando genes repórteres distintos pode ser uma ferramenta útil no estudo da dinâmica de infecção mista.<br> / Abstract : Acute Chagas' disease outbreaks associated with oral transmission have been reported in Brazil and other South American countries. However, oral infection dynamics studies are still incipient. The present work aimed to evaluate the in vitro and in vivo interaction of T. cruzi TcI and TcII transfected strains with plasmids pTREXRFP / GFPNeo and pROCKGFPNeo. Transfected SC25 (TcI) and SC96 (TcII) strains were showed stable RFP and GFP fluorescent proteins expression, respectively. Y strain expressing GFP was used in parasite-host interaction assays. In vitro studies showed that transfection did not afected the strains growth. Co-infection assays in THP-1 cells showed that mixtures of TcI and TcII parasites in different proportions had lower levels of infection than those observed for the isolated strains and that the same cell carries infection by the two strains of parasites. Triatomines infected with each transfected strains showed a similar infection rate. In contrast, mixed infections showed a predominance of TcII lineage parasites in the insect gut. In mice, oral infection with TcI strainwas not able to induce detectable blood parasitemia in the animals. On the other hand, the YGFP strain caused patent blood parasitemia and in mixed infections only TcII parasites were detected in blood and tissues of infected mice. Treatment of trypomastigotes of the SC25RFP strain with pepsin significantly reduced their ability to infect THP-1 cells, suggesting that passage through the gastric environment may have interfered with the parasite capacity to infect mice by oral route. The histopathological evaluation showed that inflammatory process was more intense in the acute phase and YGFP parasites were detected only in heart. In the chronic phase inflammation was reduced and no visible parasites were found in the evaluatedt issues. However, PCR revealed parasite DNA in all examined tissues. The present work suggest that co-infection dynamics is more associated with the T. cruzi strain characteristics than the genetic lineage (DTU) to which they belong. Transfected parasites expressing different reporter genes may be a useful tool for the study of mixed infection dynamic.

MELLO, C. P. Estudo in vitro da atividade tripanocida da batroxicidina–catelecidina da glândula de veneno da serpente Bothrops atrox. 2017. 114 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by ciências farmacêuticas pgcf (pgcf.ufc@gmail.com) on 2017-08-28T11:42:27Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-28T11:49:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T11:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) Previous issue date: 2017-07-12 / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, is a potentially fatal disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi. There are two drugs available for the treatment of the disease, nifurtimox and benzonidazole. Both are toxic and have limited efficacy, requiring the search for new therapeutic alternatives. Antimicrobial peptides (AMPs) may be potential alternatives to conventional treatments already available, as they have a rapid action mode, a low resistance development and can work with existing drugs. The aim of this study was to investigate the effects of Batroxicidin (BatxC), a catalicidine peptide of the venom Bothrops atrox venom gland, on the different forms of of Trypanosoma cruzi Y strains. The treatment with BatxC at 24, 48 and 72 h caused a decrease in the viability of the parasites in almost all the studied concentrations (1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25 and 50 μM) with an IC50 of 11, 3; (0.045, 0.09, 0.18, 0.39, 0.78 and 1.56 μM), respectively, with a selectivity index of 315. Assays with trypomastigote forms at different concentrations demonstrated that BatxC is toxic from concentrations of 0.18 μM, approaching 100% lethality at the concentration of 1.56 μM. Amastigote forms were also performed following cytotoxicity study in LLC-MK2 and RAW264.7 cells, showing that the studied concentrations (0.44 and 0.88 μM) in 24h, was a reduction of 40% and 45% of infected cells, respectively. In 48h, there was no decrease in the percentage of cell infection. The percentage inhibition of amastigote forms treated with BatxC was 33% (IC50) and 43.5% (2xIC50) in 24h, and 23% (IC50) and 33% (2xIC50) in 48h. These results demonstrated a reduction in the survival rate of amastigote forms. Subsequently, flow cytometric assays with Annexin V-PE and 7- aminoactinomycin (7-AAD) demonstrated a higher population of 7ADAD-labeled parasites at IC 50 (11.3μM) and 2x IC 50 (22.6μM ) demonstrating that death induced by BatxC was predominantly by necrosis. Then, the experiments were performed with DCF and Rhodamine 123 to investigate the involvement of reactive oxygen species (EROS) and alteration of the mitochondrial membrane potential in cell death mechanism. The results showed that there was an increase in EROS and alteration of mitochondrial transmembrane potential. The T.cruzi cell death pathway by a necrotic mechanism was finally confirmed by scanning electron microscopy (SEM) that observed loss of cellular membrane integrity. In conclusion, BatxC inhibited all forms of T. cruzi Y strain, with high selectivity index, inducing necrosis. / A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença potencialmente fatal causada pelo parasito Trypanosoma cruzi. Existem atualmente, dois medicamentos disponíveis para o tratamento da doença, o nifurtimox e o benzonidazol. Ambos são tóxicos e apresentam eficácia limitada, sendo necessária a busca de novas alternativas terapêuticas. Os peptidios antimicrobianos (PAMs) podem ser alternativas potenciais aos tratamentos convencionais já disponíveis, pois eles apresentam mecanismo de ação rápido, baixa probabilidade de desenvolvimento da resistência e podem atuar em conjunto com esquema de fármacos existentes. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da Batroxicidina (BatxC), um peptideo relacionado à catalicidina da glândula de veneno da serpente Bothrops atrox, sobre as formas diferentes formas evolutivas de cepas Y de Trypanosoma cruzi . O tratamento com BatxC em 24,48 e 72h, causou diminuição da viabilidade dos parasitos em praticamente todas as concentrações estudadas (1,56; 3,12;6,25; 12,5;25 e 50μM) com um IC50 de 11,3; 6,33 e 9,6 μM respectivamente, com índice de seletividade de 315. Ensaios com as formas tripomastigotas em diferentes concentrações (0,045; 0,09; 0,18; 0,39; 0,78 e 1,56 μM), demostraram que o BatxC é tóxico a partir das concentrações de 0,18 μM, aproximando-se 100% de letalidade na concentração de 1,56 μM. Finalizando os ensaios de toxicidade do BatxC, ensaios em formas amastigotas também foram realizados após estudo da citotoxidade em células LLC-MK2 e RAW264.7, mostrando que nas concentrações testadas (0,44 e 0,88 μM) em 24 , houve uma redução de 40% e 45% de células infectadas, respectivamente. Em 48h não houve diminuição do percentual de infecção das células. O percentual de inibição das formas amastigotas tratadas com BatxC foi de 33% (IC50) e 43,5% (2xIC50) em 24h, e 23% (IC50) e 33% (2xIC50) em 48h. Esses resultados demostraram uma redução do índice de sobrevivência de formas amastigotas. Posteriormente, ensaios de citometria de fluxo com Anexina VPE e 7-aminoactinomicina (7-AAD), demostraram uma maior população de parasitos marcados com 7-AAD, nas concentrações avaliadas IC50 (11,3μM) e 2x IC50 (22,6μM) demostrando que a morte induzida pela BatxC é predominantemente por necrose. Em seguida foram realizados ensaios com DCF e Rodamina 123, para investigar o envolvimento de espécies reativas de oxigênio (EROS) e alteração do potencial de membrana mitocondrial, na morte celular induzida por BatxC. Os resultados obtidos demostraram que houve um aumento dos EROS e alteração do potencial transmembranico mitocondrial. A via de morte celular de T.cruzi por um mecanismo necrótico foi finalmente confirmada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) que demostrou perda de integridade da membrana celular. Em conclusão, a BatxC inibiu todas as formas evolutivas de cepa Y de T. cruzi, com alto índice de seletividade, induzindo necrose.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo teve como objetivo ampliar a compreensão dos mecanismos de invasão celular por tripomastigotas metacíclicos das cepas G e CL de T. cruzi, que diferem marcadamente em sua infectividade in vitro e in vivo. Os nossos dados indicam que a cepa CL, que utiliza a molécula de superfície gp82 para entrar em células epiteliais in vitro e para invadir o epitélio da mucosa gástrica após inoculação oral em camundongos, aciona durante a invasão vias de sinalização envolvendo proteína quinase C e fosfatidil inositol-3 quinase. Na cepa G, que é pouco infectiva e utiliza gp35/50 para a invasão, são ativadas principalmente adenilato ciclase e a proteína quinase dependente de AMP cíclico. Durante a invasão mediada por gp82, as formas metacíclicas da cepa CL induzem a desorganização do citoesqueleto de actina da célula hospedeira, enquanto a cepa G parece estimular o recrutamento de actina. Consistente com esse achado, a invasão celular de tripomastigotas metacíclicos da cepa CL é inibida na presença de Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), que depende da actina do citoesqueleto para entrar em células, ao contrário da cepa G. As moléculas gp35/50 e a gp82 recombinante, purificadas, mostraram efeito antagônico sobre a entrada de EIEC em células, a primeira induzindo o aumento e a segunda inibindo a invasão bacteriana. Esses dados, em conjunto, sugerem que a invasão celular mediada por gp35/50 está associada com eventos de sinalização que favorecem o recrutamento de actina, em contraste àquela dependente de gp82, que envolve a indução de vias de transdução de sinal que resulta em despolimerização de Factina. Um outro fator que pode contribuir para a capacidade infectante de formas metacíclicas é a cruzipaína, a cisteíno protease majoritária do T. cruzi. Ao contrário da cepa G, cuja atividade de cruzipaína não é detectável, as formas metacíclicas da cepa CL expressam cruzipaína, cuja atividade, se inibida, interfere na invasão celular. Com este trabalho, mais alguns passos importantes foram dados para a melhor compreensão do processo de infecção por tripomastigotas metacíclicos das cepas G e CL / This study aimed at further understanding the mechanisms of cell invasion by metacyclic trypomastigotes from Trypanosoma cruzi strains G and CL, whose infectivities differ markedly in vitro and in vivo. Our data indicate that the CL strain parasites, which engage the surface molecule gp82 to invade epithelial cells in vitro and to enter the gastric mucosal epithelium upon oral inoculation into mice, triggers the activation of protein kinase C and phosphatidyl inositol 3-kinase signaling pathways. Conversely, the less infective G strain, which invades cells through gp35/50 molecules, induces the activation of adenylate cyclase and cAMP-dependent protein kinase. During gp82-mediated cell invasion by CL strain metacyclic forms, host cell actin cytoskeleton is disorganized whereas the gp35/50- dependent internalization of G strain involves target cell actin recruitment to the site of entry. Compatible with this finding, cell invasion by CL strain but not G strain metacyclic forms is inhibited in the presence of enteroinvasive Escherichia coli (EIEC), which requires the actin cytoskeleton for invasion. Treatment of cells with gp35/50 increased EIEC entry whereas the recombinant gp82 inhibited bacterial invasion. These data suggest that gp35/50-mediated cell invasion is associated with signaling events that favor actin recruitment, as opposed to gp82-dependent internalization, which triggers signal transduction pathways that lead to F-actin depolymerization. Another factor contributing to the infective ability of CL strain metacyclic forms is cruzipain, the T. cruzi´s major cysteine proteinase, which is undetectable in G strain. Our work provides further important information towards understanding the mechanisms underlying infection by T. cruzi metacyclic trypomastigotes / BV UNIFESP: Teses e dissertações

BEZERRA, Claudia Mendonça. Hospedeiros domésticos, peridomiciliares e silvestres na transmissão de Trypanosoma cruzi pelo Triatoma brasiliensis em área de caatinga no município de Tauá – CE. 2013. 147 f. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-08-02T12:56:23Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:51:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Traditionally, the control of human transmission of Trypanosoma cruzi is accomplished by the application of insecticides with residual action. However, knowledge about the role of hosts domestic and wild outdoor environments are critical for determining the maintenance and / or dispersion of T. cruzi. This study aimed to characterize the importance of domestic reservoirs, wild and peridomestic transmission of T. cruzi in the rural municipality of Taua (EC), inserted in Caatinga area, with emphasis on environments colonized by Triatoma brasiliensis. Among the animals household and neighbors were considered dogs, cats, pigs, goats and sheep 83 housing units (DUs). In the wild capture and examination was performed on small mammals at three sites with different degrees of antropofização, and also the capture of insects. The survey of domiciliary infestation by triatomines was performed in 251 DUs. Direct parasitological examinations were performed in insects and mammals, animals in serologic household and neighbors, Multiplex PCR on wild reservoirs and research of wild food source for insects. The proportion of infection of pigs was 6% (2/34), ovine 1% (1/102), cats 2.4% (1/41) dogs 38% (20/53). We captured nine species among rodents and marsupials. The Trichomys laurentius, with 74% (83/112), was the most abundant and widely distributed in the wild, followed by rock Kerodon 10% (11/112) and Didelphis albiventris 3.5% (4/112). 749 triatomines were captured in the household survey, with 369 (49.3%) of T. brasiliensis and 377 (50.3%) of Triatoma pseudomaculata. Only specimens of T. brasiliensis were infected with T. cruzi (25, 12.8%). Of these 3 (5.9%) were inside the home and 22 (14%) outside the home. Of the 166 triatomines captured, 132 (79%) were nymphs and other 35 (21%) adults. These, a fifth instar nymph and one male were infected with T. cruzi. The T. brasiliensis sharing the natural environment with T. laurentius, K. rock, D. albiventris, M. domestica, G. spixii, W. pyrrhorinos, C. and M. semistriatus musculus (captured animals) and G. spixii, K. cave, T. oreadicus and T. merianae (identified via food source), and animals observed during the catch (Athene cuniculariae and Felis catus) and confirmed via food source (C. hircus and G. gallus). The movement of the T. cruzi between sylvatic, peridomestic household in mammals and insects emphasizes the possibility of cases of Chagas disease in the studied region, as well as the difficulty and real necessity for its control in semi-arid areas in Northeast Brazil. / Tradicionalmente o controle da transmissão humana do Trypanosoma cruzi é realizado pela aplicação de inseticidas de ação residual. Entretanto, o conhecimento sobre o papel desempenhado por hospedeiros domésticos, peridomiciliares e silvestres são fundamentais para a determinação da manutenção e/ou dispersão do T. cruzi. Esta pesquisa teve por objetivo caracterizar a importância dos reservatórios domésticos, peridomiciliares e silvestres na transmissão de T. cruzi na zona rural do município de Tauá (CE), inserido em área de Caatinga, com ênfase nos ambientes colonizados por Triatoma brasiliensis. Dentre os animais domiciliares e peridomiciliares foram considerados cães, gatos, suínos, caprinos e ovinos de 83 unidades domiciliares (UDs). No ambiente silvestre foi realizada captura e exame de pequenos mamíferos em três locais, com diferentes graus de antropofização, e também a captura de triatomíneos. A pesquisa de infestação domiciliar por triatomíneos foi realizada em 251 UDs. Foram realizados exames parasitológicos diretos em insetos e mamíferos, sorológicos em animais domiciliares e peridomiciliares, PCR Multiplex em reservatórios silvestres e pesquisa de fonte alimentar em insetos silvestres. A proporção de infecção para os suínos foi de 6% (2/34), ovinos 1% (1/102), gatos 2,4% (1/41), cães 38% (20/53). Foram capturados nove espécies dentre roedores e marsupiais. O Trichomys laurentius, com 74% (83/112), foi a mais abundante e amplamente distribuída no ambiente silvestre, seguida por Kerodon rupestres 10% (11/112) e Didelphis albiventris 3,5% (4/112). Foram capturados 749 triatomíneos na pesquisa domiciliar, sendo 369 (49,3%) de T. brasiliensis e 377 (50,3%) de Triatoma pseudomaculata. Apenas espécimes de T. brasiliensis estavam infectados por T. cruzi (25, 12,8%). Destes 3 (5,9%) estavam no intradomicílio e 22 (14%) no peridomicílio. Dos 166 triatomíneos silvestres capturados, 132 (79%) eram ninfas e outros 35 (21%) adultos. Destes, uma ninfa de 5º estádio e um macho encontravam-se infectados pelo T. cruzi. O T. brasiliensis partilha o ambiente natural com T. laurentius, K. rupestres, D. albiventris, M. domestica, G. spixii, W. pyrrhorinos, C. semistriatus e M. musculus (animais capturados) e com G. spixii, K. rupestres, T. oreadicus e T. merianae (identificados via fonte alimentar), além de animais observados durante as capturas (Athene cuniculariae e Felis catus) e confirmados via fonte alimentar (C. hircus e G. gallus). A circulação do T. cruzi entre o ambiente silvestre, peridomiciliar e intradomiciliar em mamíferos e insetos enfatiza a possibilidade de ocorrência de casos da doença de Chagas na região estudada, bem como a dificuldade e real necessidade de seu controle em áreas do semiárido no Nordeste Brasileiro.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69318.pdf: 2705339 bytes, checksum: 57938129a86016619372b159e93db18e (MD5) 69318.pdf.txt: 146396 bytes, checksum: d375b57913c69cc2fa43e4ddc043a908 (MD5) 69318.pdf.jpg: 1174 bytes, checksum: eee38814774015c69c4605ad49e693ac (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades. Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. Cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-II) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela primeira vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. Cruzi com propriedades similares ao complexo \03B3-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as sequências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-1). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-1, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenilina identificou por immunoblotting a banda de 48kDa na fração CZP-I como sendo presenilina, enquanto o soro anti-peptídeo NIC-1 de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. Cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. Cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-II (solúvel). Ensaios enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto XXI/E da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. Cruzi possui uma constituição semelhante ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sítio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5\03BCM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXI/E não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. Cruzi é um bom alvo quimioterapêutico e imunológico / The diagnostic methods used today for Chagas disease, although simple and may present low sensitivity and specificity or cross drugs used nowadays to treat metabolic targets suggested, proteases have been identified as candidate molecules due to its particularities. Recently our group identified two aspartyl proteases in (Cruzipsin-II) and a membrane remained unknown. Our results demonstrat proteolytic complex in T. cruzi eukaryotic cells. Using bioinformatics tools proteins (presenilin, nicastrin and Aph information was important for parallel synthesis of peptides epitopes of proteins using sera from eight patients. P nicastrina, 5 and Aph-1, 10. Some epitopes we sera were obtained in rabbits. Serum immunoblotting a 48 kDa band in fraction CZP of nicastrin also presented a marking in the same position. of epimastigotes localized addition, the markings were localization of both proteins in the inner membranes of the cell. An ELISA employ synthetic peptides for T. cruzi specificity and 70.53%. Using after affinity chromatography confirm were like those of strain Y: 37 and 34 kDa in CZP-II fraction (soluble allosteric modulators DAPT and Compound XXI/E that the catalytic site of T. cruzi while significant differences were observed in the allosteric site. T 685,458 was able to inhibit 100% of enzyme activity at 5 and Compound XXI/E showed no significant inhibition. Therefore, our studies suggest that due to their enzymatic funct target for chemotherapeutic and cross-reactions with other pathogens. Likewise, Chagas disease show severe side effects. Among the various membrane-bound (Cruzipsin-I); however, their demonstrate for the 1st time, the existence of a with similar properties to the -secretase tools, the primary sequences of three of four complex Aph-1) where localized at a protein database. and the identi Presenilin presented were selected by different criteria and anti anti-peptide PRE-2 of presenelin CZP-I as presenelin, while the anti Analysis by confocal microscopy the proteins mainly at anterior and middle portions of th found to be stronger in permeabilized cells, suggesting co presenilin and nicastrin presented sensitivity . differential detergent extraction and analysis by SDS confirmed that the profile bands present in the strain CL Brener 240, 56, 48 and 34 kDa in fraction CZP-I (detergent), and 56, 52, soluble). Enzyme assays using the inhibitor L APT of human presenilin apparently suggested presenilin has a constitution similar to the human presenilin, The active site inhibitor 458 M, while the modulator functions and cellular localization the presenilin for immune system. unexpensive, T. cruzi: a soluble biological functions membrane complex of other This identification of linear 10 major epitopes, re anti-peptide identified by , anti-peptide NIC-1 the cells. In colocalization employing four of 71.59% and SDS-PAGE says L-685,458 and he LM, modulators DAPT of T. cruzi is a good target for chemotherapeutic and for immune system.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-02-26T17:21:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AvaliaçãoiImunopatológicaTecido.pdf: 2317446 bytes, checksum: f62f2d34e8d10255b4c402c58c290344 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-02-27T18:24:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AvaliaçãoiImunopatológicaTecido.pdf: 2317446 bytes, checksum: f62f2d34e8d10255b4c402c58c290344 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T18:24:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AvaliaçãoiImunopatológicaTecido.pdf: 2317446 bytes, checksum: f62f2d34e8d10255b4c402c58c290344 (MD5) Previous issue date: 2014 / As duas formas de infecção pelo Trypanosoma cruzi, tripomastigota metacíclica (TM) e sanguínea (TS) são distintas em relação ao processo de interação com as células do hospedeiro, devido às moléculas presentes em sua superfície. Esta diferença pode desencadear diferente resposta imunológica. Resposta esta, que também pode ser alterada com o tratamento pelo fármaco Azatioprina. Com base nestes aspectos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imune no coração de cães tratados com a Azatioprina ou não, durante a fase aguda da infecção por formas TM ou TS da cepa Berenice-78 do T. cruzi. Ao avaliar o parasitismo e a resposta imune no tecido muscular cardíaco de cães infectados por formas TM, verifica-se que estes apresentaram um aspecto histopatológico mais preservado, com baixo parasitismo, um balanço favorável, evidenciado pela razão, da expressão da IL-12p40 e uma maior expressão dos receptores TLR2 e TLR4. Em contrapartida, os cães infectados por formas TS apresentaram destruição tecidual, alto parasitismo, intenso processo inflamatório e elevada expressão das citocinas, quimiocinas, CCR5 e TLR9. Nos animais submetidos à infecção por diferentes formas do T. cruzi e tratados com a Azatioprina, ocorreu um aumento do parasitismo em ambos os grupos (TMA e TSA) e do processo inflamatório no grupo TMA, sendo estes fatores determinantes na gênese das lesões da fibra muscular cardíaca. Além disso, pode-se constatar aumento das citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 e TGF-β1, da quimiocina CCL3/MIP-1α e TLR9 no grupo TMA. Em suma, a ação da Azatioprina parece conduzir à resposta imune distinta. Esta evidência foi observada em ambas as formas de infecção, culminando em uma piora dos aspectos histopatológicos, principalmente naqueles do grupo TMA. Este fato pode estar ligado a mecanismos co-estimulatórios, via CD28. Sabe-se que a Azatioprina pode levar ao bloqueio desta via que é de grande importância para desencadear uma resposta imune Th1. Neste sentido, o bloqueio ou mesmo o desequilíbrio desta via e, consequentemente, da resposta imune de cunho protetora, favorece a replicação parasitária. Sugere-se a possível importância da via CD28 nos mecanismos de defesa contra o T. cruzi e chama-se a atenção para a função dos receptores TLR2 e TLR4 na infecção chagásica, pois estes podem desempenhar função protetora. _____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The two infective forms of Trypanosoma cruzi, metacyclic trypomastigote (MT) and blood trypomastigote (BT), are distinct with respect to the host cell interaction process due to molecules present on the surface of the parasite, which could trigger different immune responses. Therefore, this study clarifies some aspects inherent of the two major infective forms of T. Thus, investigating the two forms of infection, this work highlights the aspects related to a possible imbalance in the immune response by treating the dogs with Azathioprine drug. Based on these aspects, it was evaluated the immune response in the hearts of dogs treated with Azathioprine or not, during the acute phase of infection by MT or BT forms of Berenice -78 strain of T. cruzi. Analysis of the parasitism and immune response in cardiac muscle tissue of dogs infected MT forms demonstrated that this group had a more preserved histopathology, lower tissue parasitism, a favorable cytokine balance, evidenced by the ratio of the expression of IL-12p40 and increased expression of TLR2 and TLR4 receptors. In contrast, infected dogs with BT forms have tissue destruction, higher tissue parasitism, an intense inflammation and increased expression of cytokines, chemokines, CCR5 and TLR9 receptor. In infected by different forms of T. cruzi and treated with Azathioprine, it appears that there was an increase of cardiac parasitism in both groups (MTA and BTA) and inflammation (MTA group), which are determining factors in the genesis of the cardiac muscle fiber lesions. Moreover, it was not notice differences in other parameters, such as an increased on mRNA cytokine expression for instance TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 and TGF-β1, chemokine CCL3/MIP-1α and TLR9 in MTA Group. In summary, the action of Azathioprine leads to a distinct immune response, in both forms of infection, resulting in a worsening of histopathological aspects, especially those of the MTA group. This may be associated to co-stimulatory mechanisms, via CD28. It is known that Azathioprine can block this pathway, which is of great importance to elicit a Th1 immune response. In this sense, the block or even the imbalance of this pathway and of the protective immune response favors the parasite replication. Finally, this study presents a more severe form of Chagas infection with BT forms, which could have implications in non-endemic areas, such as USA and Europe. Moreover, it suggests a possible role and significance of CD28 pathway in defense mechanisms against T. cruzi and draws attention to the role of TLR2 and TLR4 receptors in infection, as these can play a protective role.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-05-11T17:55:25Z No. of bitstreams: 1 2017_JulianaVieiraFerreiraName.pdf: 1833058 bytes, checksum: b4c218ac98286257ce515f3efda357b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-17T12:34:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_JulianaVieiraFerreiraName.pdf: 1833058 bytes, checksum: b4c218ac98286257ce515f3efda357b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T12:34:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_JulianaVieiraFerreiraName.pdf: 1833058 bytes, checksum: b4c218ac98286257ce515f3efda357b8 (MD5) / A Doença de Chagas ou tripanossomíase americana é uma doença causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e é considerada endêmica em 21 países da América Latina. Estudos mostraram que a infecção por T. cruzi interfere na expressão em nível pós-transcricional de proteínas da via de apresentação MHC classe I, especificamente as subunidades induzíveis do imunoproteassoma (β1i, β2i e β5i), a subunidade PA28α, a proteína TAP e o MHC I. O presente estudo teve como objetivo avaliar se as regiões 5’ e 3’ UTR dos mRNAs dessas proteínas estão envolvidas na inibição da expressão no nível traducional pelo parasita, utilizando como modelo a subunidade β1i do imunoproteassoma. Para isso, essas duas regiões foram amplificadas e clonadas flanqueando o gene repórter EGFP em um vetor de expressão para células eucarióticas. Células transfectadas foram infectadas com T. cruzi e após quatro dias foram realizadas citometria de fluxo e microscopia de fluorescência para analisar a expressão da EGFP. Foi possível observar que as células HeLa transfectadas com a montagem do gene EGFP contendo as regiões 5’UTR e 3’UTR da subunidade B1i e infectadas com o parasita apresentaram queda na expressão da EGFP em sua população. Em uma visão mais individualizada por microscopia foi observado que células que apresentavam uma parasitemia elevada não emitiam fluorescência, ou apresentavam menor intensidade que as células na mesma população não infectadas. Nas células transfectadas com o gene EGFP sem as regiões UTRs observamos que a presença dos parasitas no interior das células não interferiu na expressão da EGFP. Esses resultados indicam que há uma interferência na expressão da subunidade β1i do imunoproteassoma durante a infecção por T. cruzi e que as regiões UTR são alvos nesse processo de inibição pós-transcricional. / Chagas disease or American trypanosomiasis is a disease caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and is considered endemic in 21 countries in Latin America. Studies have shown that T. cruzi infection interferes in post-transcriptional level expression of MHC class I pathway proteins, specifically the inducible subunits of the immunoproteasome (β1i, β2i and β5i), the PA28α subunit, the TAP protein and the MHC I. The present study aimed to evaluate whether the 5 'and 3' UTR regions of the mRNAs of these proteins are involved in the inhibition of expression at the translational level by the parasite, using as template the β1i subunit of the immunoproteasome. To that end, these two regions were amplified and cloned flanking the EGFP reporter gene into an expression vector for eukaryotic cells. Transfected cells were infected with T. cruzi and after four days flow cytometry and fluorescence microscopy were performed to analyze EGFP expression. It was possible to observe that HeLa cells transfected with EGFP gene assembly containing the 5'UTR and 3'UTR regions of the β1i subunit and infected with the parasite showed a decrease in EGFP expression in their population. In a more individualized view by microscopy it was observed that cells that had a high parasitemia did not emit fluorescence or were emitted much less intensely than cells in the same uninfected population. In cells transfected with the EGFP gene without the UTRs regions we observed that the presence of the parasites inside the cells did not interfere in the EGFP expression. These results indicate that there is interference in the expression of the β1i subunit of the immunoproteasome during T. cruzi infection and that the UTR regions are targets in this post-transcriptional inhibition process.

Orientador : Prof. Dr. Marcel Iván Ramírez Araya / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 31/01/2017 / Inclui referências : f. 78-87 / Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas. Considerada como uma doença tropical negligenciada, esta doença acomete milhões de pessoas do mundo e atinge também mamíferos silvestres e domésticos. Para produzir uma infecção o parasito T. cruzi precisa evadir o sistema imune inato do hospedeiro. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra patógenos; e o sistema complemento representa o principal mecanismo da defesa inata. O sistema complemento é formado por um conjunto de proteínas que são ativadas em cascata e, que culmina na formação de um poro na membrana do patógeno, provocando a sua lise. Todavia, muitos organismos patogênicos como o T. cruzi têm desenvolvido vários mecanismos para escapar o ataque do sistema complemento afin de progredir no seu ciclo de vida, e portanto estabelecer a infecção. Recentemente, foi descrito um novo mecanismo de evasão empregado por patógenos, que é a liberação de microvesículas. Microvesículas são estruturas bicamadas lipídicas complexas (0.1-1 ?m), oriundo da brotamento e fissão da membrana plasmática e que transportam várias moléculas derivadas das células de origem tais como proteínas e ácidos nucleicos. Nosso grupo de pesquisa recentemente descreveu alguns aspectos das características e papel das microvesículas nos mecanismos de evasão do sistema imune inata e durante os eventos de infecção, utilizando como modelo as microvesículas liberadas durante a interação de apenas uma cepa de T. cruzi com células hospedeiras. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo analisar microvesiculação em diferentes cepas de T. cruzi durante a interação com células hospedeiras e availar seu efeito. Apresentamos evidências de que a liberação de microvesículas é induzida durante a interação entre tripomastigotas metacíclicos de diferentes cepas de T. cruzi, G (TcI) e Y (TcII), e células sanguíneas (monócitos) e que existem diferenças na produção de microvesículas entre as diferentes cepas. Os nossos resultados também demostram o envolvimento das microvesículas isoladas nos mecanismos de resistência de T. cruzi à lise mediada pelo complemento e os mecanismos de invasão. A adição de microvesículas a 6,25% de soro humano normal aumentou a resistência dos parasitos da cepa Y à lise mediada por complemento de 50% para 80%; este fenômeno foi mais pronunciado em parasitos da cepa G, pois este aumento quase dobrou. Em termos do papel das microvesículas na infectividade de parasito, verificamos que as microvesículas induziram um aumento de invasão celular pelo parasito. Na presença de microvesículas, o número de parasitos da cepa Y invadindo células mamíferas aumentou por aproximadamente 50%, entretanto mais uma vez este fenômeno foi mais evidente para parasitos da cepa G, o número de parasitos que penetraram as células mamíferas duplicou. Curiosamente, foi observado que o papel das microvesículas na resistência à lise do complemento e na invasão é de classe específica, uma vez que as microvesículas de uma classe não tinha efeito sobre os parasitos de outra classe. Isto indica que as cepas têm mecanismos de inibição independentes e que os componentes de microvesículas poderiam ser diferentes. Finalmente foi comprovado que as microvesículas carreiam proteínas parasitárias envolvidas na interação parasitohospedeiro e que soro de pacientes chagásicos possuem anticorpos que reagem com componentes das microvesículas. Isto fornece evidências de que as microvesículas poderiam ser utilizadas por T. cruzi para transferir fatores de virulência a células hospedeiras e do potencial das mesmas como biomarcador para o diagnóstico da doença. Com esse trabalho foi possível demostrar novos aspectos da relevância de microvesículas durante a interação de diferentes cepas de T. cruzi com células hospedeiras. Palavras-chave: microvesículas. sistema complemento. invasão. / Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Considered a neglected tropical disease, this disease affects millions of people worldwide as well as wild and domestic mammals. In order to produce an infection, the T. cruzi parasite has to evade the host's innate immune system. The innate immune system is the first line of defense against pathogens; and the complement system represents the main mechanism of innate defense. The complement system is composed of a set of proteins that are activated in cascade, culminating in the formation of a pore in the membrane of the pathogen, resulting in its lysis. However, many pathogenic organisms such as T. cruzi have developed several mechanisms to escape the attack of the complement system, in order to progress in their life cycle, and thus establish an infection. Recently, a new evasion mechanism used by pathogens has been described, this is, the release of microvesicles. Microvesicles are complex lipid bilayer structures (0.1-1 ?m), originating from the outward blebbing and fission of plasma membrane, and which carries molecules derived from the parent cell such as proteins and nucleic acids. Our research group recently described some aspects of the characteristics and role of microvesicles as a mechanism of evasion of the innate immune system and during the infection process, using as model, the microvesicles released during the interaction of only one strain of T. cruzi with host cells. Accordingly, the objective of the present work was to analyse microvesiculation during interaction of different T. cruzi strains with host cells and to evaluate their effect. We present evidence that microvesicle release is induced during the interaction between metacyclic trypomastigotes from different T. cruzi strains, G (TcI) and Y (TcII), and blood cells (monocytes). Our results also demonstrate the involvement of microvesicles, isolated from T. cruzi and host cells interaction, in parasite resistance to complementmediated lysis and invasion mechanisms. Addition of microvesicles to 6,25% normal human serum increased parasite resistence to complement-mediated lysis from 50% to 80% in parasites of Y strain; this inhibition was more pronounced in G parasites since this increase was almost doubled. In terms of the role of microvesicles in parasite infectivity, we verified that the microvesicles induced an increase in cellular invasion by the parasite. In the presence of microvesicles, the number of parasites of the Y strain invading mammalian cells increased by approximately 50%, however once again this phenomenon was more evident for parasites of G strain, the number of parasites that penetrated the mammalian cells duplicated. Interestingly, it was observed that the role of microvesicles in resistance to complement lysis and invasion is class-specific, since microvesicles of one class had no effect on the parasites of the other class. This indicates that the strains have independent inhibition mechanisms and that the components of microvesicles could be different. Lastly, it was demonstrated that microvesicles carry parasite proteins involved in the parasite-host cell interaction and that sera from chagasic patients contain antibodies that react with microvesicular components. This provides evidence that microvesicles could be used by T. cruzi to transfer virulence factors to host cells and their potential application as a biomarker for the diagnosis of this disease. With this work, it was possible to demonstrate new aspects of the relevance of microvesicles released during the interaction of different T. cruzi strains with host cells. Key words: microvesicles. complement system. invasion.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-24T15:32:27Z No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-27T11:11:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-27T11:11:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / As publicações de pesquisadores do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, na Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, sugerem que a patogênese da doença de Chagas pode ser explicada pela auto-imunidade de origem genética (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011). A hipótese que levou as investigações sobre transferência de DNA do Trypanosoma cruzi para o genoma do hospedeiro mamífero foi feita depois que se observou que coelhos tratados com a droga tripanocida benzonidazol desenvolveram lesões destrutivas no coração com intensidade semelhante àquela encontrada nos coelhos chagásicos que não tinham recebido a droga. Entretanto, pesquisadores de outros centros consideram que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado benzonidazol é eficaz nos casos agudos da doença. Ademais, há os que tratam chagásicos com a infecção crônica, na expectativa de aliviar sintomas e melhorar o prognóstico do caso. Não obstante, vários autores sugerem que o tratamento com o nitroderivado não elimina a infecção pelo T, cruzi e não melhora o quadro da doença clínica. Esta polêmica tem mais que importância semântica, pois, se a quimioterapia da doença de Chagas fosse satisfatória poderia esclarecer os papéis das infecções persistentes e da autoimunidade na patogênese da doença. Os estudos prévios de Nitz e cols., 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011, mostram que sequências de minicírculo de DNA mitocondrial de T. cruzi (kDNA) integram frequentemente em retrotransposons LINE-1 no genoma hospedeiro, e sugerem que clones de linfócitos geneticamente modificados atacam e destroem o coração chagásico. Este estudo foi iniciado com o propósito de tentar falsear a teoria da origem genética da autoimunidade na doença de Chagas. Para isto, empregaram-se vários esquemas terapêuticos pelos quais grupos de camundongos com as infecções recentes pelo T. cruzi eram tratados com o nitroderivado benzonidazol, em dose quatro vezes acima (43 mg/kg) daquela usada para tratar a doença em humanos, e que era utilizado, alternativamente, em combinação com zidovudina (AZT) e ciprofloxacino (CIPRO), respectivamente, inibidores da transcriptase reversa e da Topoisomerase II. Essas enzimas bloqueiam vias metabólicas essenciais na integração do kDNA do T. cruzi no genoma (Rosa, 2005). Os resultados da investigação mostraram que os grupos de animais chagásicos tratados apenas com benzonidazol, ou em combinação com os inibidores, tiveram diminuição da quantidade de tripomastigotas de T.cruzi no sangue. Entretanto, jamais se observou cura parasitológica e imunológica (ausência de anticorpos específicos) nos animais submetidos aos diferentes esquemas terapêuticos. Ademais, todos os animais nos grupos tratados obtiveram positividade nos exames PCR específicos para identificação de DNA nuclear (nDNA) e de (kDNA) do protozoário. Diante desses resultados, foram conduzidos experimentos para avaliar se os esquemas terapêuticos empregados tinham bloqueado a integração do kDNA no genoma dos camundongos, infectados e infectados-tratados. Os resultados desses experimentos mostraram integrações de kDNA em retrotransposons LINE-1 do genoma de animais chagásicos que foram submetidos aos vários esquemas de tratamento, com frequências similares aquelas documentadas nos genomas dos camundongos controle positivos, infectados com T. cruzi e deixados sem tratamento. As populações de linfócitos T citotóxicos CD8+, γδ, e β (Vβ e Vβ1) atacam e destroem o coração chagásico. O conjunto de resultados desses experimentos mostra que não foi possível refutar (negar) a teoria auto-imune da patogênese da doença de Chagas. Lamentavelmente, confirmou-se que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado é insatisfatório. / The investigations conducted at the Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory at the Faculty of Medicine of the University of Brasilia suggest that the origin of the pathogenesis of Chagas Disease may be explained by the genetically driven autoimmune rejection of the target host tissues. Early experiments had shown that chagasic rabbits treated with the anti-Trypanosoma cruzi nitroderivative benznidazole developed destructive lesions in the heart similar to those found in chagasic, but untreated animals. This observation led to the hypothesis that the parasite DNA retained in the body could call out autoimmune mechanisms in Chagas disease. This hypothesis spurted further investigations on the transfer of T. cruzi DNA to the host's genome. Inasmuch some researchers continue to believe that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benzonidazole cure the Chagas disease, and others argue that the treatment should benefit those with the acute T. cruzi infections; prescriptions of the nitroderivative to treat the chronic infections aim at the prevention of disease outcome, aleviation of symptoms, and improvement of prognostics are recommended. Nevertheless, experimental and clinical investigations have shown that the treatment with the nitroderivative does not eradicate the T. cruzi infections and, therefore, the prognosis of the disease remains unchanged. This study subject bears practical importance, because it can show whether or not the chemotherapy of Chagas disease is satisfactory. Furthermore, its investigation in a suitable animal model may demonstrate any role played by the parasite persistence in the pathogenesis of the disease. Previous studies (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011) showed that the mitochondrial DNA minicircle sequence of T. cruzi integrates frequently into LINE-1 of the host's genome, and they suggest that clones of cytotoxic T lymphocytes, undergoing genotype modifications, attack and destroy the chagasic heart. This study was undertaken with the aim of falsifying the theory of the genetically driven autoimmune rejection of the heart in Chagas disease. We used several groups of mice with the T. cruzi infections, which were treated with the nitroderivative benznidazole four fold (43 mg/kg) above the dose used to treat human Chagas disease. Also, groups of chagasic mice were treated with benznidazole (43mg/ml) combined with either zidovudine (AZT) or ciprofloxacino (CIPRO), or with both, inhibitors of reverse transcriptase and of topoisomerase II,respectively. These enzymes were used to halt metabolic pathways for the integration of kDNA minicircle sequences into the host cell genome (Rosa, 2005). The results of these investigations showed that animals treated with benznidazole alone, or in combination with AZT, CIPRO, or with both inhibitors, diminished the number of T.cruzi trypomastigotes in the blood. However, the parasitologic cure was never achieved, for specif anti-parasite antibodies remained in tissues,regardless of the therapeutic regime used. Moreover, treated mice yielded positive PCR exams that identify the T. cruzi nuclear DNA (nDNA) and kDNA. Accordingly, further experiments were carried on to finding out whether the therapeutic regimes used had prevented the kDNA integration into the chagasic mice genome. These results revealed that the kDNA minicircle sequences integrated into retrotransposons LINE-1 of mice, which had received the therapeutic regimes, in a frequence not different from that observed in the positive control group of T. cruzi-infected mice, which did not receive any therapeutic regime. It was further shown that subsets of cytotoxic T lymphocytes CD8+, γδ, and β (Vβ and Vβ1) attacked and destroyed the chagasic heart. The results of these experiments reveal that it was not possible to falsify (deny) the genetically driven auto-immune theory that explains the pathogenesis of Chagas disease. Unfortunately, it was confirmed that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benznidazole is unsatisfactory.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-26T12:47:13Z No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Uma característica do Trypanosoma cruzi são as mudanças morfológicas que ocorrem durante seu ciclo de vida. A amastigogênese é um importante processo no ciclo de vida do parasita onde as formas tripomastigotas infectivas se diferenciam em amastigotas replicativas. A duplicação celular é um processo complexo, onde vários eventos estão envolvidos, dentre eles, a correta segregação das cromátides irmãs após a replicação do DNA, função exercida por um complexo denominado coesina. Neste trabalho, foi proposta caracterização de complexos proteicos de T.cruzi assim como a identificação de proteínas de complexos nucleares, cuja expressão se altera durante a amastigogênese. Por meio da técnica Blue Native PAGE (BN-PAGE) foi possível realizar a separação de complexos proteicos de lisado total das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os componentes individuais dos complexos puderam ser visualizados em segunda dimensão após o gel ter sido corado com nitrato de prata. Experimentos de detecção imunológica por western blotting demonstraram a ausência da subunidade SCC1 do complexo coesina em amastigotas gerados por diferenciação in vitro de formas tripomastigotas em cultura axênica em pH 5. Porém, a subunidade SCC1 pode ser detectada em extratos proteicos de formas amastigotas que foram reincubadas por 10 h em meio de cultura com pH ajustado para 7,5, sugerindo que essas formas são capazes de manter suas propriedades replicativas. Por espectrometria de massas do tipo LC-MS/MS, 1.339 proteínas de T. cruzi foram identificadas de amostras provenientes dos ensaios de amastigogênese. Destas, 560 proteínas foram anotadas em bancos de dados como proteínas reguladas, 65 possuíam localização nuclear e 66 foram preditas como pertencentes a complexos proteicos. Na classificação das proteínas identificadas os grupos que correspondem àqueles envolvidos em metabolismo de ácidos nucleicos aparecem como predominantes. Proteínas que se ligam a DNA (9,23%), proteínas de ligação a RNA (13,85%) e proteínas que se ligam a nucleotídeos (18,46%) correspondem juntas a 41,54% do total de proteínas nucleares reguladas, corroborando o fato de que intensa atividade de transcrição e processamento de DNA e RNA ocorre em todas as etapas de diferenciação, além de outros principais grupos como as peptidases (15,38%), proteínas estruturais (13,85%) e atividade de hidrolases (12,31%). Para proteínas reguladas e envolvidas com complexos proteicos durante a amastigogênese os maiores grupos estão envolvidos em processos de transporte (25,58%), processos metabólicos (19,77%), processos metabólicos de compostos contendo nucleotídeos (16,28%), geração de precursores metabólicos e de energia (8,14%). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / A feature of Trypanosoma cruzi is the morphological changes that occur during their life cycle. The amastigogenesisis an important process in the life cycle of the parasite where the infective trypomastigotes differentiate into replicative amastigotes. A cell replication is a complex process, where several events are involved, among them the correct segregation of sister chromatids after DNA replication, function performed by a complex called cohesin. In this work we proposed the characterization of T. cruzi protein complexes and the identification of proteins from nuclear complexes, whose expression is altered during amastigogenesis. Through the technique of Blue Native PAGE (BN-PAGE) it was possible the separation of protein complexes from total lysate of T. cruzi epimastigotes. The individual components of the complexes could be visualized after the second dimensional gel after stainingwith silver nitrate. Immunological detection experiments by western blotting demonstrated the absence of SCC1 subunit of cohesin complex in amastigotes generated by in vitro differentiation of trypomastigotes in axenic culture at pH 5.0. However, the subunit SCC1 was detected in protein extracts of amastigotes that were reincubated for 10 hours in a culture medium adjusted at pH 7.5, suggesting that these forms are able to maintain their replicative properties. By LC-MS/MS mass spectrometry, 1,339 proteins ofT.cruzi were identified in samples from mastigogenesis. Of these, 560 proteins were annotated in databases as regulated proteins, 65 have presented nuclear localization and 66 were predicted as belonging to protein complexes. In the classification of proteins involved in nucleic acid metabolism, this group appears to be predominant. Proteins which bind to DNA (9.23%), RNA-binding proteins (13.85%) and proteins that bind nucleotides (18.46%) correspond together to 41.54% of the total regulated nuclear proteins, confirming that strong transcription activity and DNA and RNA processing occur in all stages of differentiation, and other major groups such as peptidases (15.38%), structural proteins (13.85%) and activity of hydrolases (12.31%). For regulated proteins and protein complexes involved in amastigogenesis the largest groups are involved in transport processes (25.58%), metabolic processes (19.77%), metabolic processes of compounds containing nucleotides (16.28%), generation of metabolic precursors and energy (8.14%).