Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-11-14T12:47:05Z No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) Previous issue date: 2006 / Proteínas zinc finger são compostas por domínios compactados contendo α- hélices e folhas β unidos e estabilizados por um ou dois átomos de zinco. Arranjos repetidos de zinc fingers são comumente utilizados para reconhecimento de ácidos nucléicos. Dentre outras atividades, eles estão envolvidos em replicação, transcrição e reparo de DNA. No nucleocapsídeo do vírus HIV tipo 1 foi identificada uma proteína contendo o motivo zinc finger CX2CX4HX4C, estando esta proteína envolvida em várias etapas do ciclo de vida viral, incluindo a propriedade de encapsidação do RNA viral. Em tripanosomatídeos, somente poucas proteínas contendo o motivo zinc finger já foram identificadas até o presente momento. Em um fragmento genômico de 17 kb da banda XX de T. cruzi, nós identificamos três genes in tandem codificando para proteínas zinc finger do tipo CX2CX2HX4C. Nós também demonstramos que genes similares estão presentes em T. brucei e L. major como três definidos grupos monofiléticos entre esses tripanosomatídeos. Em T. cruzi, TcZFP8 corresponde a um novo gene codificando para uma proteína com oito motivos zinc finger. O homólogo de TcZFP8 em T. brucei é aparentemente ausente, enquanto um candidato foi identificado em L. major. A clonagem molecular e a expressão heteróloga de TcZFP8 foi realizada para produção de anticorpos e procedimentos como imunocitolocalização, SELEX e EMSA. Análise por Western blotting revelou a presença dessa proteína nas três formas do parasita. Análises usando extratos protéicos nucleares e citoplasmáticos de T.cruzi mostraram que essa proteína está presente na porção nuclear. Esse resultado foi confirmado através de análise de microscopia por imunofluorescência indireta. Experimento de SELEX demonstrou quatro diferentes populações com uma região interna rica em C e/ou G, porém sem seqüências consenso específicas. Análises preliminares de EMSA de uma das quatro populações selecionadas revelaram evidências de que TcZPP8 possa ter afinidade de ligação à fita simples de DNA. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Zinc fingers are compact protein domains composed of a α-helix and a β-sheet held together by a zinc ion. Tandem arrays of zinc fingers are commonly used to recognize nucleic acids. Among other activities, they are involved in the processes of replication, transcription, and DNA repair. The nucleocapsid protein of HIV-1 contains a zinc finger motif CX2CX4HX4C that contributes to multiple steps of the viral life cycle, including the proper encapsidation of HIV RNA. In trypanosomatids, only a few of the proteins that contain such fingers were identified. In a 17-kb genomic fragment of Trypanosoma cruzi chromosome XX we identified three tandemly linked genes coding for CX2CX4HX4C zinc finger proteins. We also showed that similar genes are present in Trypanosoma brucei and Leishmania major sharing three monophyletic groups among these trypanosomatids. In T. cruzi, TcZFP8 corresponds to a novel gene coding for a protein containing eight zinc finger motifs. Homologous of TcZFP8 in T. brucei is apparently absent, while one candidate in L. major was identified. Molecular cloning of gene TcZFP8 and heterologous expression were performed in Escherichia coli. The purified recombinant protein His6x-TcZFP8 was used to produce antibody in rabbits and GST-TcZFP8 in SELEX and EMSA procedures. Using Western blot analysis, we observed the presence of this protein in all three forms of the parasite: amastigote, trypomastigote and epimastigote. Analysis using cytoplasm and nuclear cell extracts showed that this protein is present in the nuclear extracts and indirect immunofluorescence microscopy analysis confirmed the nuclear localization of the TcZFP8. SELEX experiment showed four different populations rich in C and/or G nucleotides, but with none consensus sequence. Preliminary EMSA from one population gave evidence that TcZFP8 has affinity to bind to singlestranded DNA.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2011 / Submitted by alcianira lima persch (alcyrpl@yahoo.com.br) on 2011-06-22T22:29:43Z No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-27T11:52:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-27T11:52:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5) / O sistema biológico depende de rígido controle do processo de oxidação proveniente do metabolismo. A oxidação pode resultar em danos irreparáveis em inúmeras moléculas importantes para a manutenção da fisiologia celular. Assim, há uma via metabólica voltada para manter esse sistema reduzido, que nos tripanosomatídeos parece ser única, e alguma interrupção causaria danos ao parasito. Nesse intuito, esse trabalho teve como objetivo estudar duas enzimas participantes da via de óxido-redução do Trypanosoma cruzi identificadas como -glutamilcisteína sintetase (GCS) e glutationa sintetase (GS). A sequência nucleotídica dos gene gcs e gs de T. cruzi codificam proteínas de 693 e 535 resíduos de aminoácidos de massa molecular 79,67 kDa e 58,63 kDa respectivamente. Essas proteínas já foram estudadas em muitos organismos, e apresentam sequências altamente conservadas entre os tripanosomatídeos patogênicos. O baixo grau de identidade com a enzima humana é bastante interessante, pois podem representar alvos específicos para o desenvolvimento de quimioterápicos seletivos. As proteínas recombinantes foram expressas em sistema heterólogo de E. coli, a partir do vetor de expressão gcs-pET28a e gs-pET28a. As proteínas foram purificadas sob condições desnaturantes, pois a rGCSTc só está presente na fração insolúvel do lisado bacteriano, e rGSTc da fração solúvel apresentou dificuldades em se ligar na coluna de afinidade. Os anticorpos policlonais produzidos pelos camundongos imunizados foram eficientes no reconhecimento das proteínas recombinantes e das proteínas nativas no extrato total de epimastigotas de T. cruzi. Análise da imunofluorescência revelou que as enzimas são expressas por todas as formas do T. cruzi e localizam-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biological systems depend on the strict control of the oxidation process derived from the metabolism. Oxidation can result in irreparable damage to many molecules important to the maintenance of cellular physiology. Thus, there is a pathway to keep the system reduced, that in trypanosomatids appears to be unique, and any disruption would cause damage to the parasite. At this purpose, this work aimed to study two enzymes participating in the redox pathway of Trypanosoma cruzi, identified as _-glutamylcysteine synthetase (GCS) and glutathione synthetase (GS). The nucleotide sequence of the T. cruzi gcs and gs genes encode proteins of 693 and 535 amino acid residues with molecular masses 79.67 kDa and 58.63 kDa respectively. Their proteins have already been studied in many organisms and their sequences are highly conserved among pathogenic kinetoplastids. The low degree of identity with the human enzyme may represent specific targets for the development of selective chemotherapeutic agents. The recombinant proteins were expressed in E. coli using the expression vectors gcs-pET28a and gs-pET28a. The proteins were purified under denaturing conditions, because the rGCSTc is only present in the insoluble fraction of bacterial lysate and the soluble fraction of rGSTc does not bind to the affinity column under non-denaturating conditions. Polyclonal antibodies against the purified enzymes, raised in mice, were effective in the recognition of the recombinant proteins and their native forms in the total extract of epimastigotes of T.cruzi. Immunofluorescence analysis revealed that the enzymes are expressed in all forms of T. cruzi and located within vesicles in the cytoplasm of the parasite.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:14:57Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / O agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se principalmente ao nível pós-transcricional o que dificulta a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e torna atrativa a abordagem proteômica. Estudos teóricos anteriores predisseram uma distribuição bimodal entre as faixas ácidas e básicas de géis bidimensionais virtuais de tripanossomatídeos. Contudo, trabalhos experimentais com T. cruzi tem gerado perfis 2-DE com uma distribuição assimétrica e poucos spots protéicos na região alcalina. Com o objetivo de verificar se as diferenças entre os perfis reais e virtuais eram resultado de limitações técnicas das metodologias atuais de 2-DE em faixas básicas de pH, foram feitas análises proteômicas das formas de vida do T. cruzi utilizando-se condições otimizadas para a faixa de pH 6-11. Assim, os subproteomas alcalinos das formas tripomastigota e epimastigota foram comparados usando-se a metodologia de “gel dois-em-um” (“two-in one gel”) a qual, por minimizar as variações inerentes a 2-DE, facilitou a análise computacional de imagens. Um segundo estudo, concentrou-se na comparação das formas tripomastigota e amastigota, também utilizando uma estratégia de 2-DE-MS. Os resultados revelaram diferenças na expressão de proteínas entre as formas adaptativas do parasito, de acordo com suas características biológicas e corroboraram estudos proteômicos anteriores. Por exemplo, as enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e desidrogenases foram mais abundantes na forma epimastigota, enquanto que trans-sialidases e proteínas paraflagelares foram encontradas especificamente na forma tripomastigota Sabendo-se que o fenômeno de fosforilação/desfosforilação de proteínas está implicado na diferenciação do T. cruzi, procedeu-se o estudo da variação do fosfoproteoma do parasito durante a amastigogênese pela detecção direta das proteínas fosforiladas em géis 2-DE. Assim, verificou-se que várias proteínas apresentaram variação de fosforilação ao longo da amastigogênese, principalmente aquelas associadas ao citoesqueleto, envolvidas no enovelamento protéico e com funções metabólicas. / The etiological agent of Chagas disease is the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The fact that T. cruzi gene expression regulation occurs mainly at post transcriptional level prevents the direct correlation between mRNA and protein levels, and makes the proteomic approach very attractive. Previous theoretical studies predicted a bimodal distribution among acid and alkaline pH ranges in virtual 2-DE gels of trypanosomatides. On the other hand, 2-DE experiments on T. cruzi have generated assimetric profiles with very few spots on the alkaline region of the gel. Aiming at verifying whether the differences between real and virtual profiles were due to the technical imitations of current 2-DE methodologies in the basic pH range, we carried out proteome analysis of T. cruzi life stages using conditions optimized for the 6-11 pH range. Therefore, trypomastigote and epimastigote alkaline subproteomes were compared using the “two-inone gel” methodology which, by minimizing inherent 2-DE limitations, facilitated computational image analysis. A separate study focused on the comparison between trypomastigote and amastigote life stages also using a 2-DE-MS approach. Overall, the results revealed differences in protein expression between the adaptative forms of the parasite, in agreement with their biological traits, as well as corroborated previous proteomic studies. For instance, enzymes related with aminoacid metabolism and dehydrogenases were more abundant in the epimastigote stages while trans-sialidases and paraflagellar proteins were specifically found in trypomastigote 2-DE profiles. Since phosphorylation/dephosphorylation is implicated in T. cruzi differentiation, we followed variations of T. cruzi phosphoproteome during amastigogenesis through direct phosphoprotein detection in 2-DE gels. Thus, we verified that several proteins presented variation in phosphorylation profiles during amastigogenesis, specially those proteins associated wih cytoskeleton, involved in protein folding and those with metabolic functions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2014-05-20T12:37:28Z No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma parasitose de grande relevância na América Latina. A divisão celular do T. cruzi possui características incomuns à maioria dos eucariotos, dado que durante o processo não ocorre o desaparecimento da membrana nuclear e condensação de seus cromossomos. O objetivo deste trabalho foi o estudo do conjunto de proteínas (proteoma) presentes no núcleo da forma epimastigota do T. cruzi. Para tanto, lisados celulares do parasito foram submetidos a um fracionamento celular por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. O enriquecimento nuclear foi validado por microscopia de fluorescência com marcação para DNA e as imagens comparadas com a microscopia de campo claro, mostrando que a fração nuclear foi obtida com alto grau de pureza. A análise por SDS-PAGE mostrou diferenças evidentes de perfil proteico entre o extrato nuclear e extratos das demais frações obtidas durante o fracionamento. As proteínas do subproteoma nuclear foram posteriormente analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e por digestão tríptica seguida de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Usando esta última abordagem foi identificadas mais de 800 proteínas sendo quase 30% hipotéticas. Dentre os principais processos biológicos encontrados para as proteínas identificadas estão processos catabólicos, biossintéticos, geração de metabólitos e energia, processo metabólicos nucleares e tradução. As proteínas encontradas poderão ser alvos de futuros estudos para a elucidação de processos como divisão celular, transcrição gênica e formação de cromossomos, que hoje ainda não são bem elucidados. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas´ disease, a disease of great relevance in Latin America. The replication process of the T. cruzi possesses unusual features, when compared to other eukaryotes; given that during this process, the nuclear membrane does not disappear and there is not chromosome condensation. The goal of this project was to study the set of proteins (proteome) that are present in the nucleus of the T. cruzi epimastigote life form. To this end, the parasite cell lysates were subjected to cell fractionation by sucrose gradient ultracentrifugation. As a way to validate these purity of the isolated cell fractions, we used optical microscopy methods including bright field analysis and fluorescence microscopy after DNA labeling. The images demonstrated that the nuclear fractions were obtained with high purity. Furthermore, SDS-PAGE analysis showed differences in protein profiles between the nuclear extracts and extracts of other fractions obtained during the fractionation. The proteins of the nuclear subproteome were subsequently analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Using the latter approach, we identified more than 800 proteins with almost 30 % being hypothetical. Among these proteins many are involved in important biological processes such as catabolic and biosynthetic pathway, metabolites and energy generation, nuclear metabolites and translation. Hence, the proteins describe in this work may be use in future studies to elucidate processes such as cell division, transcription and chromosomes packaging, which are not fully well understood.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2775_1.pdf: 2530217 bytes, checksum: f1c3233880017dc9673198e936977f37 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A doença de Chagas é uma infecção causada pelo Trypanosoma cruzi, o qual é transmitido ao homem através da picada de insetos pertencentes à espécie Triatoma infestans. Em sua fase aguda, a doença provoca febre e miocardite. No entanto, alguns pacientes podem desenvolver a forma crônica, quando então surgem as principais conseqüências cardíacas e gastrointestinais. Muitos estudos foram feitos na busca de novos fármacos e alguns deles descrevem o potencial efeito anti-T. cruzi de derivados imidazolidínicos e acridínicos, ambos conhecidos pelo suas variadas ações biológicas. Neste trabalho, descreve-se a síntese e características físico-químicas de novos derivados imidazolidínicos e imidazacridínicos. Todos os compostos sintetizados tiveram suas estruturas químicas comprovadas por espectroscopia de Infravermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H), espectrometria de Massas (MS) e cristalografia. Adicionalmente, investigou-se a citotoxicidade de todos os compostos utilizando-se células esplênicas de camundongos. O estudo da atividade anti-parasitária dos derivados imidazacridínicos e do composto 5-(9H-fluoren-2-il-metileno)-2-(4-nitrobenzilsulfonil)- 3,5-diidro-imidazol-4ona (LPSF/NN-237) foi realizado através da técnica de ensaio MTT. O cálculo da IC50, para esses mesmos compostos, foi determinado por meio de uma regressão linear simples utilizando o software Prisma 4 Graphpad. Os resultados demonstraram que o composto 5-(acridin-9-il-metileno)- 3-benzil-4-tioxo-imidazolidin-2-ona (LPSF/AC-128) obteve os melhores resultados de atoxidade e atividade anti-parasitária para T.cruzi, sendo um potencial candidato a novos fármacos no combate à doença de Chagas

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-13T17:36:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Doutorado Jana Sandes.pdf: 7518474 bytes, checksum: ffe5eecd1e8f6f0f35f618607ab2e4c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T17:36:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Doutorado Jana Sandes.pdf: 7518474 bytes, checksum: ffe5eecd1e8f6f0f35f618607ab2e4c3 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / FACEPE / O retículo endoplasmático (RE) é uma organela vital para as células eucarióticas, envolvido na síntese, modificação e enovelamento de proteínas, homeostase do cálcio e metabolismo de lipídios. Variações no nível de cálcio, inibição da glicosilação, estresse oxidativo, entre outros, podem levar o RE a uma condição de estresse, a qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibe a tradução de novas proteínas e aumenta a degradação de proteínas mal enoveladas. No entanto, quando o estresse é severo ou persistente, a UPR induz mecanismos de morte celular, principalmente por apoptose. Embora o RE possua papel fundamental na sobrevivência das células de mamíferos, estudos sobre a fisiologia desta organela em Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, ainda são escassos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar molecular e morfologicamente a resposta de formas epimastigotas de T. cruzi ao estresse do RE induzido por ditiotreitol (DTT) ou tunicamicina (TM). As células tratadas com DTT apresentaram inibição do crescimento de maneira dose-dependente, com recuperação do crescimento após a retirada da droga. O tratamento com DTT não alterou os níveis proteicos de BiP (binding protein) mas reduziu significativamente os níveis de RNAm de BiP e calreticulina (CRT), sugerindo que o T. cruzi tenha uma resposta diferente da UPR de eucariotos superiores. O estresse persistente do RE induzido pelo DTT causou drásticas alterações morfológicas e fisiológicas compatíveis com morte celular por apoptose tardia/necrose, como observado pela dupla marcação com anexina-V e iodeto de propídeo, além da redução do tamanho do corpo celular, inchaço e desorganização das cristas mitocondriais, despolarização do potencial de membrana mitocondrial (ψm) e aumento da produção (21 – 94%) de espécies reativas de oxigênio (ROS). No entanto, a presença de perfis do RE envolvendo porções do citoplasma sugere que a autofagia também esteja ocorrendo. Por outro lado, a TM apresentou um forte efeito tripanostático, sem crescimento celular independentemente da dose ou do tempo de incubação, inclusive após a retirada da droga. O tratamento com a TM também não foi capaz de alterar os níveis proteicos de BiP, porém induziu um aumento nos níveis de RNAm de BiP e CRT. A análise por citometria de fluxo demonstrou que o tratamento com TM induziu despolarização do ψm sem um aumento pronunciado na produção de ROS, e apenas cerca de 10% das células tratadas apresentaram fenótipos de apoptose. Alterações ultraestruturais também foram observadas nas células tratadas com TM, como o arredondamento do corpo celular, a presença de inclusões lipídicas e um grande número de perfis de RE ao redor de estruturas citoplasmáticas em processo de degradação. Dessa forma, nossos resultados sugerem que o tratamento com DTT compromete o funcionamento da célula de maneira geral mais do que atua como estressor do RE, devido ao seu forte efeito oxidativo, levando à morte da célula. Já a TM atua mais especificamente sobre o RE, desencadeando um processo de autofagia/RE-fagia na tentativa de reverter o estresse de RE sem induzir morte celular por apoptose. / The endoplasmic reticulum (ER) is a vital organelle to eukaryotic cells, involved in the protein synthesis, folding and modification, calcium homeostasis and lipid metabolism. Changes in calcium levels, glycosylation inhibition, oxidative stress or others, can lead to an ER stress condition, which triggers specific signaling pathways including the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR promotes an increase in the chaperone expression, inhibits the translation of new proteins and increases the degradation of unfolded proteins. However, when the stress is severe or persistent, the UPR induces cell death mechanisms, mainly by apoptosis. Although the ER has a pivotal role in the survival of mammalian cell, studies about the physiology of this organelle in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, are still scarce. In this regard, the aim of this study was to characterize molecular and morphologically the response of epimastigote forms of T. cruzi to the ER stress induced by dithiothreitol (DTT) or tunicamycin (TM). DTT-treated cells showed a dose-dependent growth inhibition, with growth recovery after drug withdrawal. The DTT treatment did not alter the BiP (binding protein) protein levels but significantly reduced the mRNA levels of BiP and calreticulin (CRT), suggesting that T. cruzi has a different response from higher eukaryotes UPR. Persistent ER stress induced by DTT caused drastic morphological and physiological changes compatible with cell death by late apoptosis/necrosis, as observed by double staining with annexin-V and propidium iodide, reduction of cell body, swelling and disorganization of mitochondrial cristae, mitochondrial membrane potential (ψm) depolarization and increasing of reactive oxygen species (ROS) production (21-94%). However, the presence of ER profiles involving cytoplasmic portions suggests that autophagy may also be occurring. On the other hand, the TM showed strong trypanostatic effect, with no cell growth observed independent of the dose and the time of incubation, even after drug withdrawal. The TM treatment was also unable to change the BiP protein levels, but induced an increase in BiP and CRT mRNA levels. The flow cytometry analysis showed that TM-treatment induced ψm depolarization without a pronounced increase in the ROS production (10 - 15%) and only about 10% of the treated cells exhibited apoptotic phenotypes. Ultrastructural changes were also observed in TM-treated cells, such as rounding of the cell body, the presence of lipid inclusions and a large number of ER profiles surrounding cytoplasmic structures in degradation process. Therefore, our results suggest that the DTT treatment compromises the whole cell function rather than acts as a specific inductor of ER stress, due to its strong oxidative effect, leading to cell death. The TM treatment acts more specifically on the ER, triggering an autophagy/ER-phagy process in an attempt to reverse the ER stress, without inducing cell death by apoptosis.

Orientador: Irineu Jose Barsanti de Camargo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T07:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nagamatsu_RoselyYukiko_M.pdf: 14747556 bytes, checksum: 774a8d03fd93c514b223bc33693a8bb0 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Foram estudadas respostas imunológicas apresentadas por diferentes linhagens de camundongos à infecção por estoques de Tripanosoma cruzi, cepa Y, mantidos em in vitro (TC) ou in vivo (TS). Foi observado que a manutenção do parasita em cultura celular atenua a virulência, refletida em menor mortalidade. As linhagens também apresentaram diferentes graus de resistência. Entretanto a linhagem BALBI/cJ, de mortalidade intermediária à linhagem AI J e C57Bl61 J, apresentou uma cinética parasitêmica maior, e portanto a parasitemia nem sempre correlaciona com a taxa de mortalidade. A imunização com o TC seguido de desafio após 72hs com o TS provocou uma proteção parcial à letalidade desse estoque. Análises imunohistoquímicas na fase precoce da infecção demonstraram uma hipertrofia do linfonodo poplíteo, do baço e das respectivas áreas povoadas por linfócitos, entretanto sem diferença entre localização das células T CD4 e T CD8. A análise percentual mostrou que na fase inicial da infecção existe zuna variação do número de linfócitos T CD4 e T CD8 dependente do estoque utilizado, que pode refletir a proteção induzida por TC / Abstract: Imune responses from differents strains of mice were studied after infection by stocks of Trypanosoma cruzi, Y strain, with in vitro (TC) or in vivo (TS) maintance. It was observed that maintance of parasite in celullar culture reduces virulence, reflected by smaller parasitemia. The strains of mice present differents levels of resistance to mortality. However, the BALBI cJ strain, of intermediated level of mortality between AI J and C57Bl61 J strains, presented greatest parasitemic kinectic, and therefore the parasitemia may not always correlacionate with mortality. The imunization with TC following challenge 72hs after with TS partially protected the lethal action of this stock. Imunohistoquimics analysis of early phase of infection demonstred hypertrophy in spleen, poplite linphonode and respectives limphocyte populated areas, however without difference between T CD4 or T CD8 lymphocyte localization. The percentual analysis showed that exist a variation of T CD4 and T CD8 lymphocyte subpopulations quantity in initial phase of infection depended of stock utilizated, which may reflect the protection induced by TC / Mestrado / Mestre em Imunologia

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:17:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_AnnaMariaAlvesdePiloto_M.pdf: 1840150 bytes, checksum: 0aff6011fffecb965f2404ee6d9ed22a (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado

Orientadores: Fernanda Ramos Gadelha, Luis Eduardo Soares Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T10:57:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_RenataVilela_M.pdf: 5015994 bytes, checksum: 1edbb85678d6958681c2f20e5bc88952 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi caracterizar e comparar a atividade enzimática da triparedoxina peroxidase (TXNp) em duas cepas de T. cruzi que apresentam diferentes resistências ao estresse oxidativo. A identificação da TXNp foi feita em extratos celulares totais da forma epimastigota de T. cruzi das cepas Y e Tulahuen 2. De um modo geral, a cepa Tulahuen 2 tem uma concentração maior desta enzÍma do que a Y. Variações na concentração da TXNp dentro de uma mesma cepa com origens geográficas diferentes também foi observada. A TXNp obtida em extratos celulares totais de T. cruzi epimastigotas possui função antioxidante, protegendo a glutamina sintetase (GS) contra as espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas pelo sistema oxidante DTT/Fe3+/02. Parece não estar envolvida com a proliferação celular, uma vez que uma correlação não pôde ser estabelecida através da análise por Western blotting entre os diferentes dias de crescimento e a quantidade desta proteína. A triparedoxina (TXN) também foi encontrada nos mesmos extratos e variações em sua concentração foram observadas quando as cepas e seus diferentes dias de crescimento foram comparados. Neste caso também as células Tulahuen 2 apresentaram uma maior concentração da TXN. Uma maior resistência às EROs geradas pelo sistema DTT/Fe3+/02 pode ser explicada pela maior concentração de TXN e TXNp encontradas. Isto levaria a um metabolismo de hidroperóxidos mais efetivo, quando comparado à cepay. Os "sheddings" de T. cruzi de ambas as formas (epimastigota e tripomastigota) mostraram a liberação de TXNp para o meio extracelular / Abstract: The objective of this work was to charactetize and compare the tryparedoxin peroxidase (TXNp) enzymatic activity in two strains of T. cruzi that have different resistances to oxidative stress. TXNp identification was made in total ceIlular extracts ITom epimastigote of Y and Tulahuen 2 strain. In a broad sense, Tulauen 2 strain has a higher concentration of this enzyme when compared to the Y strain. Differences in TXNp concentration into a same strain with different geographic origins were also observed. TXNp present in total ceIlular extracts ITom T. cruzi epimastigote has an antioxidant function, protecting glutamine synthetase (GS) against reactive oxygen species (ROS) produced by the DTTlFe3+/02 oxidant system. lt appears not to be involved with cellular proliferation, since a correlation could not be stablished using Westem Blot analysis, between the different growth days and the amount of this protein. Tryparedoxin (TXN) was also found in the same extracts and variation in its concentration were observed when strains and different growth days were compared. Also in this case, Tulahuen 2 ceIls had a higher concentration of TXN. The higher resistance observed in the Tulahuen 2 strain against ROS generated by DTTlFe3+/02 system can be explained by the higher concentration of TXN and TXNp found. This would led to a hydroperoxide metabolism system more effective, when compared to the Y strain. T. cruzi sheddings of both forms (epimastigote and trypomastigote) showed liberation ofTXNp to the extraceIlular environrnent / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiavegatto_CamilaWhonrathMorisco_M.pdf: 6305800 bytes, checksum: d06eeff5b5078e4a1fd37a8c2c30a3b3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Em resposta a invasão pelo Trypanosoma cruzi (T.cruzi) a célula libera uma série de espécies reativas de oxigênio e ao mesmo tempo ocorre um aumento de concentração de cálcio no citosol indispensável para a penetração do parasita. O T.cruzi apresenta uma capacidade limitada em lidar com o estresse oxidativo, levando esta área a ser de grande interesse para a terapêutica. A triparedoxina peroxidase (TXNPx) é uma enzima antioxidante que participa de uma cascata enzimática para a detoxificação de hidroperóxidos descrita em T.cruzi que oferece novas opções para o desenvolvimento de agentes tripanossomicidas mais específicos. Duas cepas com diferentes resistências ao estresse oxidativo gerado pelo peróxido de hidrogênio foram utilizadas nesse trabalho. A cepa Tulahuen 2 apresenta menor tempo de geração e uma maior resistência ao estresse oxidativo, além de um maior índice de crescimento e concentração de TXNPx em relação a cepa Y. Correlacionando o número de células com o conteúdo protéico total, a cepa Tulahuen 2 apresenta uma relação maior do que a outra cepa estudada. Durante a fase lag, em ambas as cepas, ocorre um aumento da expressão da TXNPx. Nas condições testadas, as duas cepas metabolizaram o H2O2 na mesma velocidade. Baixas concentrações de H2O2, levaram a um estímulo da proliferação celular (cepa Y) dando suporte a idéia que este agente pode agir como segundo mensageiro. Essas células são capazes de se adaptar ao estresse oxidativo quando tratadas inicialmente com uma concentração citotóxica e depois desafiadas com uma dose citostática. Esta adaptação é temporária, induzindo a resistência até l h 30min após o pré- tratamento. A triparedoxina peroxidase está envolvida na adaptação ao estresse oxidativo de células epimastigotas de T. cruzi uma vez que tratando-se as células com baixas e altas concentrações de H2O2 observa-se um aumento da expressão desta proteína / Abstract: In response to invasion by T. cruzi, cells generate reactive oxygen species (ROS), occurring at the same time an increase in cytosolic calcium concentration that is essential for invasion. T. cruzi has a limited capacity to deal with oxidative stress, being this area of great interest for therapeutics. Typaredoxin peroxidase (TXNPx) is an antioxidant protein that participates in an enzymatic cascade for hydroperoxide detoxyfication in T. cruzi offering new options for the development of more specific drugs. Two T. cruzi strains with different resistance to the oxidative stress generated by H2O2, were used in this study. Tulahuen 2 strain has a smaller doubling time and a higher growth index, tryparedoxin peroxidase expression and resistance to oxidative stress. The correlation between cell number and total protein content was also higher in this strain. During the lag phase, for both strains, there is a higher expression of TXNPx. In the conditions used, both strains metabolized H2O2 at the same rate. Low concentrations of H2O2 were able to stimulate cell growth in T. cruzi (Y strain) giving support to the idea that it can act as a second messenger. These cells were also able to adapt to oxidative stress when treated with atoxic H2O2 concentrations and then challenged with citostatic concentrations. This adaptation is transient inducing resistance to challenging for a maximum of 1 h 30 min. Tryparedoxin peroxidase is involved in the adaptation of T. cruzi (Y strain) to oxidative stress since treatment with lower and higher H2O2 doses induced an increase in its expression / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular