Le génie tissulaire est la discipline qui vise à reconstruire des tissus biologiques à partir de cellules humaines ou animales. Ces tissus, destinés à la recherche fondamentale ou appliquée, peuvent ensuite être développés pour la greffe clinique chez des patients. Ainsi, la production de substituts cutanés composés de plusieurs couches cellulaires permet d'obtenir un modèle d'étude de la peau, composé d'un épiderme et d'un derme, et des pathologies pouvant s'y rattacher. L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique rare causée par une mutation dans le gène COL7A1 responsable de la production du collagène VII, provoquant une jonction dermo-épidermique (JDE) non fonctionnelle et se manifestant par une diminution de la force d'adhérence entre le derme et l'épiderme. La production de peaux reconstruites par la méthode d'auto-assemblage (PR), combinée à la correction des gènes défectueux par thérapie génique, est prometteuse pour la greffe autologue chez les patients atteints d'EBDR. Cependant, il n'existe pas de méthodes standardisées permettant de quantifier ou de caractériser l'intégrité de la JDE sur les PR produites in vitro. L'objectif de ce mémoire de maîtrise était de développer une méthode permettant d'évaluer les propriétés fonctionnelles de la JDE du modèle de PR, par essais destructifs puis non-destructifs, pour en caractériser l'intégrité avant la greffe chez le patient. La première étape du projet fut de mettre au point une méthode adaptée à la mesure de la force d'adhérence entre le derme et l'épiderme du modèle de PR. Le succès des expérimentations liées à cette première étape a permis de valider l'utilisation d'un banc d'essai électrodynamique pour effectuer des essais de décollement entre deux substrats organiques. Il a été possible d'évaluer la différence de force d'adhérence dermoépidermique entre différentes conditions expérimentales, dont la condition pathologique d'EBDR. Par la suite, un montage de thermographie active dynamique a été développé pour évaluer l'intégrité de la JDE de façon non-destructive. Les résultats de cette seconde partie ont montré la validité de l'instrument sur des matériaux non organiques. Cependant, une optimisation reste à être appliquée pour discriminer une différence significative dans le temps de thermalisation des échantillons de PR. Somme toute, l'aboutissement de ce projet a mis à la disposition du génie tissulaire de nouvelles techniques d'évaluation de l'intégrité de la JDE pour les PR destinées à l'application clinique. / Tissue engineering is the discipline that aims to reconstruct biological tissues and organs from human or animal cells. These tissues, intended for basic or applied research, can then be improved for clinical transplantation in patients. Thus, the production of skin substitutes composed of several cell layers makes it possible to obtain a study model of the skin, composed of an epidermis and a dermis, and the pathologies that may be associated with it. Recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is a rare genetic disorder caused by mutations in the COL7A1 gene, which encodes type VII collagen, which forms the anchoring fibrils that ensure dermal-epidermal cohesion in the skin. The disease is manifested by an incomplete dermal-epidermal junction (DEJ) and decreased adhesion strength between the dermis and the epidermis. The fabrication of tissue-engineered reconstructed skin (TES), combined with the correction of defective genes through gene therapy, makes autologous transplantation a promising treatment for patients with EBDR. However, there are no proven methods to quantify or characterize the integrity of DEJ. The objective of the master's thesis was to develop a method capable of evaluating the functional properties of the DEJ of the model of skin reconstructed by the self-assembly method, by destructive then non-destructive testing, in order to check its quality before grafting on the patient. The first step of the project was to develop a method suitable for measuring the strength of adhesion between the dermal and the epidermal layers of the TES model. The success of the experiments linked to this first step made it possible to validate the use of an electrodynamic bench test to perform peel tests between two organic substrates. It was possible to assess the difference in dermal-epidermal adhesion strength between different conditions, including the pathological condition of RDEB. Subsequently, a dynamic active thermography setup was developed to assess the integrity of the DEJ in a non-destructive manner. The results from this second part showed the validity of the instrument on non-organic materials. However, an optimization remains to be applied to discriminate a significant difference in the thermalization time of the TES samples. In conclusion, the development of these new methods has made available new techniques for assessing the integrity of DEJ of TES intended for clinical applications.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les lymphomes T cutanés constituent un ensemble hétérogène de lymphomes non-hodkinniens. Les lymphomes T cutanés sont définis par une prolifération clonale de lymphocytes T malins et de cellules NK (natural killers) de localisation cutanée. Dans l'Union Européenne, l'indication du bexarotène par voie orale est le traitement des manifestations cutanées des lymphomes cutanés T épidermotropes (LCT), au stade avancé (ou dès un stade précoce aux États Unis). L'objectif de ce travail a été d'étudier les effets indésirables du bexarotène chez les patients atteints de lymphome cutané. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux interactions du bexarotène avec le système de la coagulation et avec le métabolisme lipidique.Dans la première partie de nos travaux, nous avons étudié l'origine de la coagulopathie induite par le bexarotène. Nous avons montré que le bexarotène inhibe les facteurs IX et X de la coagulation, ce qui provoque le prolongement du temps de coagulation ; ces effets pourraient être à l'origine de la coagulopathie observée chez les patients traités au bexarotène.Dans la deuxième partie, nous avons montré que le bexarotène interagit également avec le métabolisme lipidique par l'activation du CETP et par l'inhibition de la lipoprotéine lipase, ce qui provoque une chlolésterémie et une triglyéridémie.Enfin, nous avons présenté les résultats préliminaires de l'essai clinique organisé au niveau de la région ouest de la France sur les effets indésirables du bexarotène.Les résultats de ce travail mettent en évidence l'importance de la structure chimique du bexarotène (effets de charges) dans la neutralisation des facteurs de coagulation d'une part et dans le mécanisme d'interaction avec le métabolisme lipidique (CETP et lipoprotéine lipase) d'autre part. La compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à une coagulopathie et à la dyslipidémie représente un enjeu majeur pour prévenir la toxicité du bexarotène et pour permettre une meilleure prise en charge du patient. / The cutaneous T cell lymphomas are a heterogeneous group of non-lymphoma hodkinniens. The cutaneous T cell lymphomas are defined by a clonal proliferation of malignant T cells and NK (natural killer) cells from skin location. In the European Union, the indication of oral bexarotene is the treatment of cutaneous manifestations of cutaneous T-cell lymphomas epidermotropic (LCT) to advanced (or at an early stage in the United States). The objective of this work was to study the adverse effects of bexarotene in patients with cutaneous lymphoma. We are particularly interested in the interactions of bexarotene with the coagulation system and lipid metabolism.In the first part of our work, we studied the origin of the coagulopathy induced by bexarotene. We have shown that bexarotene inhibited factors IX and X of the coagulation causing the extension of clotting time and coagulopathy that was observed in bexarotene-treated patients. In a second part, we showed that Bexarotene induces in vitro cholesteryl ester transfer protein activity, and suppress lipoprotein lipase activity in human plasma.Finally, we presented the preliminary results of the clinical trial conducted at the western region of France on the adverse effects of bexarotene.The results of this study highlight the importance of the chemical structure of bexarotene (charge effects) in the neutralization of coagulation factors mechanisms on the one hand and in its interaction with lipid metabolism (CETP and lipoprotein lipase) on the other hand. Understanding the molecular mechanisms leading to coagulopathy and dyslipidemia is a major issue to prevent the toxicity of bexarotene and to elicit better management of the bexarotene-treated patient.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les carcinomes épidermoïdes cutanés (CEC) sont des cancers invasifs du kératinocyte qui se développent suite à la subversion du système immunitaire. Une reprogrammation de l’immunité antitumorale par stimulation locale des cellules dendritiques (DC) et des macrophages pourrait être bénéfique. Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été de comprendre l’hétérogénéité ontogénique, phénotypique et fonctionnelle de ces cellules immunitaires au cours de la carcinogenèse cutanée afin de développer des approches thérapeutiques les stimulant. Nous avons, d’abord, caractérisé les macrophages de la peau de souris et infiltrant les CEC chez l’homme. Nous avons identifié par cytométrie en flux spectrale une population de macrophages matures, autofluorescents et résidents de la peau de souris. Ces macrophages résidents présentent une polarisation fonctionnelle d’homéostasie et de réparation tissulaire. Dans les CEC humains, les macrophages autofluorescents semblent avoir les mêmes caractéristiques que leurs équivalents dans la peau de souris. Dans une seconde étude, nous avons mis en évidence que les DC associées aux tumeurs sont dysfonctionnelles. Une immunothérapie locale composée d’un agoniste de TLR9 et d’un anticorps bloquant la signalisation sous le récepteur à l’IL-10 induit la régression de tumeurs cutanées. Cette approche permet la reprogrammation fonctionnelle des DC et la génération de lymphocytes T CD8+ producteurs d’IFNγ, de TNFα et d’IL-17. Ces résultats mettent en évidence l’hétérogénéité fonctionnelle des cellules myéloïdes dans la peau et les CEC. Leur reprogrammation fonctionnelle permettrait le développement de nouvelles thérapeutiques contre les CEC chez l’homme. / Skin Squamous cell carcinoma (sSCC) are invasive keratinocyte tumor that develop after immune system subversion. The reprogrammation of anti-tumoral immunity using local stimulation of dendritic cells (DC) and macrophages could be useful. In this line, the aim of my thesis was to understand ontogenic, phenotypic and functional heterogeneity of these cell subsets along skin carcinogenesis to develop new immunotherapies. First, we characterized skin macrophage subsets in mouse and those infiltrating sSCC in human. Using spectral flow cytometry, we identified matured autofluorescent tissue-resident macrophages. These macrophages are anti-inflammatory polarized. In human sSCC, autofluorescent macrophages seem to have same properties that their mouse counterparts. In second study, we identified tumor-infiltrating DC with altered functions. We used a local immunotherapy composed by a TLR9 agonist and blocking antibody against α-chain of IL-10 receptor. This combination induced tumor regression through DC reprogrammation and IFNγ+, TNFα+ IL17A+ T CD8+ lymphocyte generation. These results highlight functional myeloid heterogeneity in skin and sSCC. Their reprogrammation could promote the development of immunotherapies against sSCC in human.

Le syndrome de Sézary (SS) est un variant leucémique et érythrodermique de lymphomes T cutanés. Il est caractérisé par la présence d’une population clonale de LT CD4+, présentant un noyau cérébriforme atypique, dans la peau, les ganglions lymphatiques et le sang périphérique. Après un bilan clinique, le diagnostic de cette pathologie est confirmé par l’analyse immunohistochimique d'une biopsie cutanée. Néanmoins, la cytomorphologie des cellules de Sézary circulantes n’est pas uniquement associée au SS. Notre laboratoire a identifié CD158k comme marqueur membranaire spécifique des cellules de Sézary. Ce récepteur offre un intérêt dans le diagnostic du SS et dans le suivi de l’évolution de la pathologie. Ainsi, nos résultats montrent qu’un immuno-marquage CD3+ CD158k+, analysé en cytométrie en flux, est une technique spécifique et sensible de détection de la cellule de Sézary par rapport à la cytomorphologie. Alors que dans plus de 30% des cas le SS passe inaperçu durant l’examen cytomorphologique, une analyse en cytométrie en flux permet la mise en évidence de cellules tumorales résiduelles. La présence systématique de CD158k à la surface des cellules de Sézary nous a conduit à rechercher l’expression d’autres KIRs. Sur les lymphocytes tumoraux circulants d’un patient ainsi que sur la lignée cellulaire correspondante, l’expression des formes activatrices et inhibitrices des récepteurs CD158a/h et CD158b/j est détectée. A la différence des lymphocytes NK et T CD8+, le récepteur présentant une fonction inhibitrice (KIR-L) ne l’emporte pas sur celui ayant une fonction activatrice (KIR-S) dans la cellule de Sézary. En fait, les KIR-L, à l’exception de CD158k, sont trouvés non fonctionnels dans la cellule tumorale. Ainsi, l’engagement des formes activatrices CD158h ou CD158j permet une régulation positive de la voie de signalisation CD3-dépendante de JNK et de la prolifération tumorale. Une étude fonctionnelle de la population T CD4+ KIR+, équivalent normal de la cellule de Sézary, a aussi été réalisée. Nous avons mis en évidence une expression préférentielle de la forme activatrice ou inhibitrice des récepteurs KIR homologues, selon le donneur. D’autre part, les KIRs activateurs ou inhibiteurs, exprimés à la surface des LT CD4+, jouent un rôle de co-récepteur vis-à-vis du TCR. Ainsi, une régulation positive ou négative de la prolifération et de la voie de signalisation CD3-dépendante de ERK est observée en fonction du type de récepteur co-engagé. Il est bien établi que les KIR-S s’associent à la molécule adaptatrice KARAP/DAP12 pour la transduction d’un signal d’activation. Dans les cellules T CD4+ saines et tumorales, la protéine recrutée par ces récepteurs est encore non identifiée. Notre étude sur la population T CD4+ CD158j+ de sujets sains montre l’implication de la protéine HS1 dans la signalisation mise en place par le récepteur KIR activateur. La réalisation de ce travail a permis de mieux comprendre les mécanismes mis en place à partir des KIRs dans les cellules T CD4+. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives concernant le rôle de ces récepteurs dans les mécanismes permettant l'expansion tumorale des cellules de Sézary / Sézary syndrome (SS) is a leukemic and erythrodermic variant of cutaneous T-cell lymphomas. It is characterized by the presence of a clonal CD4+ T lymphocyte population in the skin, lymphnodes and peripheral blood. After clinical assessment, diagnosis of this disease is confirmed by immunohistochemistry analysis of a skin biopsy. However, the cytomorphology of circulating Sézary cells is not just associated to SS. Our laboratory has identified CD158k as a phenotypic marker for Sézary cells. This receptor can be used in the diagnosis of the SS and in monitoring the evolution of the disease. Our results show that the CD3/CD158k immunostaining, analysed by flow cytométrie, is more specific and sensitive than cytomorphology to detect atypical circulating cells. While more than 30% of the SS is misdiagnosed by the cytomorphologic identification, flow cytometry analysis allows the detection of residual tumor cells. Given the systemic expression of CD158k on Sézary cells, we next investigated the expression of additional KIRs. On circulating malignant lymphocytes from one patient and the corresponding cell line, the expression of inhibitory and activating forms of CD158a/h and CD158b/j receptors was detected. In contrast to NK cells and CD8+ T lymphocytes, the inhibitory receptor signaling (KIR-L) does not outweigh the activating receptor signaling (KIR-S) in the Sézary cell. In fact, KIR-L, except CD158k, are found not functional in the tumor cell. Thus, CD158h or CD158j engagement results in an enhanced CD3-induced cell proliferation and JNK activation. A functional study of CD4+ KIR+ T lymphocyte population, the normal equivalent of Sézary cells, was then performed. We observed an exclusive expression of the activating or the inhibitory form of KIR receptors, depending on the donor. Activating or inhibitory KIRs, expressed on the CD4+ T cell surface, act as coreceptors. Thus, a positive or negative regulation of the CD3-induced cell proliferation and ERK activation is observed by triggering the KIR-S or -L respectively. It is well known that stimulatory KIR initiates intracellular signals through their association with the adaptor protein KARAP/DAP12. However, in normal and malignant CD4+ T cells the protein recruited by these receptors is still not identified. Our study on CD4+ CD158j+ T lymphocyte population from healthy individuals showed the involvement of HS1 protein as a potential adaptor molecule in the activating KIR signaling pathway. This work has provided insight into the mechanisms of KIRs signaling in CD4+ T cells and opens new perspectives on the role of these receptors in proliferation of Sézary cells

Les études internationales indiquent que la pollution atmosphérique présente des effets néfastes sur la santé. Au Liban, les taux de polluants atmosphériques dépassent les seuils recommandés par l’OMS et les législations sont presque absentes. Dans ce contexte, cette thèse tentera d’étudier les effets de l’exposition aux polluants de l’air sur la santé respiratoire, cardiaque et cutanée à Beyrouth en utilisant la méthodologie d’analyse des séries temporelles. Pour estimer l’effet de la pollution sur la santé de la population beyrouthine, nous avons principalement utilisé des données extraites des registres des urgences de sept hôpitaux ainsi que celles du réseau de surveillance de la qualité de l’air à Beyrouth et ce pour une période de dix-huit mois. L’analyse de régression, appliquée aux indicateurs de pollution, de santé et d’autres facteurs de confusion nous a permis de montrer une relation significative entre les admissions pour causes respiratoires, cardiaques et cutanées et l’augmentation des niveaux de polluants atmosphériques. Les analyses menées chez les enfants et les personnes âgées ont montré qu’il existe une relation significative entre les admissions aux urgences pour causes respiratoires et l’augmentation de la concentration des particules de 10µg.m-3 au-dessus des normes exigées et ceci au jour même. Cependant, nous avons montré qu’une association significative existe chez les adultes mais pour un délai de six à sept jours. La relation entre l’augmentation des niveaux de polluants et les admissions aux urgences pour causes cardiovasculaires n’a pas été très significative. Par contre une relation a été considérée positive et importante entre l’élévation des taux de polluants et les admissions aux urgences pour des maladies cutanées. En conclusion, nos résultats ont mis en évidence l’effet des polluants sur la santé des habitants à Beyrouth surtout chez des groupes vulnérables (enfants et personnes âgées) et ont souligné la nécessité de mener des études supplémentaires sur ce sujet. / International studies show that air pollution has adverse effects on health. In Lebanon, air pollutants exceed the limits recommended by WHO and laws barely exist. This thesis attempts to study the effects of exposure to air pollutants on respiratory, cardiovascular and skin diseases in Beirut using the methodology of time series analysis.To estimate the health effects of air pollution in Beirut, we mainly used data from emergency registers of seven hospitals as well as data from the air quality monitoring network in Beirut for a period of eighteen months. Regression analysis taking into consideration pollution and health indicators and other confounding factors allowed us to demonstrate a significant relationship between admissions for respiratory, cardiovascular and skin diseases and the increased levels of air pollutants. The analysis conducted in children and elderly groups apart have shown that there is a significant relationship, same day, between emergency admissions for respiratory causes and the increase in particles concentrations of 10μg.m-3. However, this significant association exists in adults group but for a delay of six to seven days. The relationship between increasing levels of air pollution and emergency admissions for cardiovascular causes was barely significant. Beside strong association was found between air pollutants and emergency admissions for skin diseases. In conclusion, our results proved the effect of air pollution on health in Beirut especially among vulnerable groups (children and elderly groups) and stressed the need to conduct additional studies on this subject.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La spectroscopie vibrationnelle est une technologie permettant de générer une grande quantité de données très informatives quant à la composition moléculaire des échantillons analysés. Lorsqu'elle est couplée à des méthodes chimiométriques de traitement et de classification de données, elle devient un outil très performant pour l'identification de structures et sous-structures des échantillons. Appliqué dans le domaine du biomédical, cet outil présente alors un fort potentiel pour le diagnostic de maladie. C'est dans ce cadre qu'ont été réalisés les travaux de ce manuscrit. Dans une première étude relevant du développement algorithmique, un algorithme automatique de classification non supervisée (basé sur les Fuzzy C-Means) et récemment implémenté au sein du laboratoire pour apporter une aide au diagnostic de cancers cutanés par imagerie infrarouge, a été amélioré afin de i) considérablement réduire le temps nécessaire à son exécution ii) augmenter la qualité des résultats obtenus sur les données infrarouge et iii) étendre son champs d'application à des données réelles et simulées, habituellement employées dans la littérature. Cet outil a été testé sur des données infrarouge acquises sur 16 échantillons de cancers cutanés (BCC, SCC, maladie de Bowen et mélanomes), et sur 49 jeux de données réels et simulés. Les résultats obtenus ont montré la capacité de ce nouvel algorithme à estimer des partitions proches de la réalité quelque soit le type de données étudié. La seconde étude de ce manuscrit avait pour but de mettre au point un outil chimiométrique autonome d'aide au diagnostic de la leucémie lymphoïde chronique par spectroscopie Raman. Dans ce travail, des traitements numériques et l'algorithme de classification supervisée Support Vector Machines, ont été appliqués à des données acquises sur des cellules sanguine de 27 témoins et 49 patients présentant une leucémie lymphoïde chronique. Les résultats de classification obtenus ont montré une sensibilité de 80% et une spécificité de 100% dans la détection de la maladie. / Vibrational spectroscopy is a technology able to record a large amount of molecular information from studied samples. Coupled with chemometrics and classification methods, vibrational spectroscopy is an efficient tool to identify sample structures and substructures. When applied to the biomedical field, this tool shows a high potential for disease diagnosis. It is in this context that the works presented in this thesis have been realized. In a first study, dealing with algorithmic development, an automatic and unsupervised classification algorithm (based on the Fuzzy C-Means) and developed by our laboratory in order to help for skin cancer diagnosis using IR spectroscopy, was improved in order to i) reduce the computational time needed to realize clustering, ii) increase results quality obtained on infrared data, iii) and extend its application fields to simulated and real datasets, commonly used in the literature. This tool has been tested on 16 infrared spectral images of skin cancers (BCC, SCC, Bowen's disease and melanoma), and 49 real and simulated datasets. The obtained results showed the ability of this new algorithm to estimate realistic data partitions regardless the considered dataset. The second study of this work aimed at developing an independent chemometric tool to assist for chronic lymphocytic leukemia diagnosis by Raman spectroscopy. In this second work, different numerical preprocessing steps and a supervised classification algorithm, Support Vector Machines, have been applied on data recorded on blood cells coming from 27 healthy persons and 49 patients with chronic lymphocytic leukemia. The classification results showed a sensitivity of 80% and a specificity of 100% in the disease diagnosis.