La connaissance des mécanismes qui contrôlent la transcription des gènes, comme l’interaction de facteurs protéiques au niveau des promoteurs, est essentielle pour comprendre plusieurs fonctions biologiques et espérer traiter certaines pathologies. Nous nous sommes attardés à mieux comprendre les mécanismes qui régulent trois gènes humains dont les patrons d’expression sont différents et qui sont impliqués dans diverses pathologies en tentant de mettre en parallèle les différences structurales et fonctionnelles entre ceux-ci. Les gènes AβPP et p21 sont exprimés chez l’adulte alors que GPC3 est exprimé uniquement chez l’embryon de façon spécifique aux tissus. L’expression d’AβPP est aussi spécifique aux tissus et sa surexpression fait partie des mécanismes mis en cause chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et du syndrome de Down. Le gène p21 est quant à lui exprimé dans plusieurs types cellulaires et est fortement induit suite à des dommages à l’ADN. Enfin, nous avons montré que GPC3 est exprimé de manière différentielle dans le neuroblastome (NB) et la tumeur de Wilms (WT), deux tumeurs embryonnaires. p21 : La caractérisation du promoteur proximal de p21 dans les fibroblastes humains normaux en prolifération nous a permis de localiser sept empreintes protéiques dont une au niveau de la séquence consensus pour NFI. Les études de retard sur gel, de transfection transitoire, d’immunoprécipitation de la chromatine et d’anti-ARN ont permis de confirmer la liaison de NFI et de le définir comme répresseur important de la transcription de p21. AβPP : Nous avons montré que USF et Sp1 se lient au promoteur de AβPP et que leur liaison est essentielle pour générer une activité maximale du promoteur. La caractérisation in cellulo du promoteur dans les neurones et les astrocytes normaux a révélé huit sites d’interaction ADN-protéine, entre-autres au niveau des sites de liaison des facteurs de transcription CTCF, USF et Sp1. GPC3 : La caractérisation du promoteur de GPC3 nous a permis de montrer 1) une struture chromatinienne particulière tout le long du promoteur et 2) plusieurs empreintes protéiniques putatives dont certaines spécifiques à la lignée SJNB-7 qui exprime GPC3. Parmi ces dernières, nous avons mis en évidence la liaison possible d’un facteur de transcription de type NF-Y. / Gene transcription is the first step to the production of any given protein. Understanding of the molecular mechanisms regulating gene expression, such as the binding of transcription factors to genes promoters, is essential to the understanding of biological functions and to develop new powerful therapies against many clinically documented pathologies. We investigated the transcriptional regulatory mechanisms of three human genes very differently expressed and involved in diverse pathologies in an attempt to reveal structurals and functionals differencies between these mechanisms. AβPP and p21 genes are both expressed in adult while GPC3 is only transcribed in a tissus specific manner before birth. The expression of the AβPP gene is also specific to tissue and its over-expression may be involved in Alzheimer disease and Down syndrome. P21 gene is expressed in many types of cells and is strongly induced by DNA damage. Finally, we demonstrated that GPC3 is differently expressed in neuroblastoma and Wilms' tumor. P21 : The characterization of the proximal promoter from the p21 gene in normal human proliferating fibroblasts revealed seven DNA-protein footprints of which one bears a perfect consensus sequence for the NFI family of transcription factors. EMSA, CHIP, anti-RNA and transient transfection of recombinant constructs analyses clearly demonstrated that NFI interact with the most proximal LMPCR footprint on the p21 promoter and functions as a repressor. Upon serum starvation, a change in the electrophoretic mobility of the NFI DNA-protein complex was observed that may contribute to the activation mechanistic of the p21 gene throughout cell senescence and differentiation. AβPP : We demonstrated that Sp1, like USF, recognizes an element in the human AβPP gene that is necessary for full promoter activity. In cellulo footprinting analysis revealed at least eight DNA-protein interactions including CTCF, USF and many Sp1 target sites. These results were further supported by EMSA and transient transfection analysis. GPC3 : The characterisation of the entire GPC3 gene promoter revealed 1) a particular DNA structure in the promoter and 2) eight large protected regions. The use of competitor oligos in EMSA experiments and super-shift assays showed that an NFY-type transcription factor (TF) may explain the GPC3 aberrant expression in SJNB-7.

Raisonnement: Les mécanismes post-transcriptionnels occupent une place importante au sein de la régulation de l’expression génique. L’expression génique est cruciale au bon développement de la cellule, mais également à sa survie. L’altération des mécanismes post-transcriptionnels fait maintenant l'objet de nombreuses études sur la cause ou la conséquence de différentes pathologies humaines telles que le cancer. Récemment, les Granules de Stress (GS) ont été trouvées à agir comme un nouveau mécanisme post-transcriptionnel, qui permet à la cellule de survivre en conditions de stress. Résultats: Notre étude démontre pour la première fois, la formation de GS dans les cellules cancéreuses traitées avec un agent chimiothérapeutique. De cela, nous avons élucidé un sentier spécifique de formation des GS en réponse au Bortézomib (Bz). Nous avons montré que cet inhibiteur de protéasome réduit l’initiation de la traduction via la phosphorylation du facteur de l’initiation de la traduction (eIF2). Cette phosphorylation d’eIF2 se produit via l’activation de la kinase de stress HRI (Heme-Regulated kinase). La suppression de la voie de phosphorylation d’eIF2-GS via la déplétion de HRI favorise une mort cellulaire accrue chez les cellules cancéreuses traitées au Bz. Ces données révèlent donc un rôle important pour HRI dans la résistance des cellules cancéreuses face au Bz, en partie par l’entremise de sa capacité à réguler la formation de GS. Pour faire suite à cette étude, nous décrivons que le facteur anti-apoptotique p21 est séquestré à l’intérieur des GS qui sont induites par le Bz. L’emprisonnement de l’ARNm p21, hautement instable, à l’intérieur des GS permet à cet ARNm d’être protégé, stabilisé et donc accumulé. Nous démontrons que la protéine de liaison à l’ARN, CUGBP1, est responsable de la localisation de l’ARNm p21 à l’intérieur des GS en réponse au Bz. Après un traitement prolongé de Bz, les GS sont désassemblées et ainsi relâchent une grande quantité d’ARNm p21 qui devient alors disponible pour être traduite. Cette traduction massive de p21 apporte alors un élan anti-apoptotique à la cellule cancéreuse ce qui lui permet de survivre au traitement chimiothérapeutique de Bz. Conclusions et perspectives: En somme, ces études décrivent une nouvelle voie spécifique de survie cellulaire qui implique un rôle potentiel pour les GS dans le cancer et qui pourrait être ciblée en thérapie. En perspective, des tumeurs xénogreffes chez la souris seront utilisées pour tester si (i) la suppression des GS via l’inactivation de HRI, et (ii) l’inactivation de la voie CUGBP1-p21, qui est régulée par les GS, sensibiliseraient les tumeurs au Bz, validant ainsi notre modèle in vivo. Ces études apporteraient des preuves de concept pour le développement de nouvelles stratégies ciblant les voies associées au GS et qui pourraient être utilisées en thérapie combinatoire pour diminuer le risque de résistance face au traitement de Bz. / Rationale: Post-transcriptional mechanisms play an important role in the regulation of gene expression. Gene expression is crucial for the proper development of the cell but also for its survival. The alteration of post-transcriptional mechanisms is now the subject of numerous studies on the cause, or on the consequence, of various human diseases such as cancer. Recently, Stress Granules (SG) have been found to act as a new post-transcriptional mechanism, which allows the cell to survive in stress conditions. Results: Our study demonstrates for the first time, the formation of SGs in cancerous cells, in response to a chemotherapeutic agent. From this we have elucidated a specific pathway of SG formation in response to Bortezomib (Bz). We demonstrate herein that this proteasome inhibitor reduces translation initiation via the phosphorylation of the initiation factor (eIF2). This phosphorylation of eIF2 is controlled through the activation of the heme-regulated kinase (HRI). The alteration of the pathway phospho-eIf2-SG, through depletion of HRI, causes massive cellular death in Bz treated cancerous cells. These data thus reveal a crucial role for HRI in the resistance of cancerous cells against Bz, in part via its capacity to regulate SG formation. Furthermore, we describe the anti-apoptotic factor p21 to be trapped inside Bz-SGs. This sheltering of the highly unstable p21 mRNA allows this one to be protected from degradation, which can be stabilized and accumulated. We also demonstrate, herein, that the RNA-binding protein CUGBP1 acts as a factor responsible for the localization of the p21 mRNA inside Bz-SGs. After prolonged treatment of Bz, SGs disassemble and release a high dose of p21 mRNA that becomes available for translation. This massive translation of anti-apoptotic p21 gives a boost to the cell that allows it to survive the stress. Perspectives and Conclusion: In sum, our studies describe a new specific pathway of cell survival that implies a potential role for SGs in cancer, which could be targeted in therapy. In perspective, xenograft tumors in mice will be used to test if (i) the inhibition of SG formation via the inactivation of HRI, and (ii) the inactivation of the CUGBP1-p21 pathway that is regulated by SGs, can both sensitize tumors to Bz treatment thus validating our model in vivo. These studies will provide us with a proof of principle for the development of new strategies targeting SG-associated pathways. Combinatorial therapies implicating the termination of such pathways could be developped in order to reduce the risk of recurrence against Bz.

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par de vagues oscillantes de cyclines et des kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces kinases sont régulées positivement par l’association des sous-unités cyclines régulatrices et négativement en se liant aux inhibiteurs de Cdk. Parmi ces derniers, p27 inhibe tous les complexes cycline-Cdk quelle que soit la phase cellulaire et agit en tant que régulateur négatif principal de la prolifération cellulaire dans une variété de cellules et de tissus. Intrinsèquement, p27 phosphorylé est ubiquitiné et dégradé par le complexe SCFSkp2-Cks1. Des études génétiques de la souris, ainsi que des examens cliniques chez l’homme, ont montré que p27 est un important suppresseur de tumeur. Le gène est rarement muté. Cependant, p27 est fréquemment réprimé dans les cancers humains en raison d’une augmentation de l’expression de Skp2 et de Cks1 dans le noyau, ce qui est généralement associée à un mauvais pronostic. La localisation subcellulaire de Cks1 est donc d'une importance primordiale dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats récents de notre laboratoire ont montré une interaction entre Cks1 et les protéines de transport nucléaire importine α1 et β3. Aussi, l’analyse de la séquence primaire de Cks1 a également révélé un signal de localisation nucléaire classique (NLS) à son extrémité C-terminale. Des mutations ont été effectuées sur le NLS suspect pour déterminer si oui ou non l'import nucléaire de Cks1 était contrôlé par cette séquence. Un inhibiteur synthétique de l’importine β a également été utilisé pour étudier l’import de Cks1 dans le noyau. Les résultats indiquent que l’extrémité C-terminale de Cks1 est en effet un NLS puisque les mutations de Cks1 et l'inhibition de l’importine β conduisent, tous deux, à l'accumulation de Cks1 dans le cytoplasme. Ces résultats ont été utiles pour mieux comprendre le mécanisme régulant la localisation de Cks1. Toutefois, des travaux futurs sont nécessaires pour mieux comprendre l'impact de la séquestration cytoplasmique de Cks1 sur le cancer et ainsi espérer aboutir à l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques impliqués dans la prolifération cellulaire. / Progression through the cell cycle is controlled by oscillating waves of cyclins and cyclin-dependent kinases (Cdk). These kinases are regulated positively by association with cyclin regulatory subunits and negatively by binding of Cdk inhibitors. Among the latter, p27 inhibits all cyclin-Cdk complexes regardless of the cell cycle phase and acts as a primary negative regulator of cell proliferation in a variety of cell types and tissues. Intrinsically, phosphorylated p27 is ubiquitinated and degraded by the SCFSkp2-Cks1 complex. Mouse genetic studies and human clinical investigations have shown p27 as an important tumor suppressor, which gene is rarely mutated. However, p27 is frequently downregulated in human cancers due to an increased expression of nuclear Cks1 and this is usually associated with a poor prognosis. The subcellular localization of Cks1 is thus of primordial importance in the control of cell proliferation. Recent results from our laboratory have shown an interaction between Cks1 and nuclear transport proteins α1 and β3 importin. Analysis of the primary sequence of Cks1 also revealed a classic nuclear localization signal (NLS) at its C-terminal. Mutations have been done on the suspected NLS to determine whether or not Cks1’s nuclear import is regulated by this motif. A synthetic inhibitor of β importin has also been used to study the mechanism of Cks1 import. Results indicated that the C-terminal end of Cks1 is indeed a NLS since mutations of Cks1 and inhibition of β importin both lead to accumulation of Cks1 in the cytoplasm. These outcomes were helpful to better understand the mechanism regulating Cks1 localization. However, future works are required to further understand the impact of cytoplasmic sequestration of Cks1 on cancer and hopefully lead to the identification of novel pharmacological targets involved in cell proliferation.

Un dérèglement du cycle cellulaire peut causer le cancer. Lors de la cytocinèse un anneau contractile d’actine et de myosine se forme, se contracte, et donne un anneau du midbody qui mène à l’abscision. Le processus de cytocinèse est sous le contrôle de protéines telles que la GTPase Rho qui active la cytocinèse et les cyclines-Cdks qui l'inhibent. La Drosophile possède 3 cyclines mitotiques CycA/ CycB/ CycB3 qui sont successivement dégradées en fin de mitose et permettent l'initiation de la cytocinèse. La dernière étape d’abscission est un phénomène qui reste encore peu connu. Les protéines Vps4 et CHMP4C liées à ANCHR vont, sous la dépendance de la kinase Aurora B, promouvoir l’abscision mais, suite à quelques études récentes, il semble y avoir une implication de la cycline B. Ici, le but était de tester l’implication de cette cycline dans les processus de cytocinèse et d’abscision, elle a été menée par microscopie à haute résolution en temps réel avec des cellules S2 de l’organisme Drosophila melanogaster par le suivi de protéines recombinantes fluorescentes. L’étude a été divisée en deux axes : gain et perte de fonction par l’intermédiaire respectivement de la protéine Cycline B recombinante stable, non dégradable (CycBstable-GFP) et l’inhibition par l’utilisation d’ARN double brin (ARNdb) sur l’endogène. La CycBstable-GFP a perturbé la cytocinèse en induisant plusieurs anneaux contractiles et midbodies. En revanche la réduction de l’expression de CycB n'a pas eu d’effet observable, et elle ne semble pas avoir d’action sur l’abscission malgré le recrutement de CycB-GFP au midbody tardif. En revanche la protéine Cdk1 semble avoir un rôle dans l'abscision puisque sa réduction d’expression a induit un délai. Elle a donc une implication potentielle sur la cytocinèse. / Dysregulation of the cell cycle can cause cancer. During cytokinesis a contractile ring of actin and myosin forms, contracts and gives rise to a midbody ring which controls abscission. The process of cytokinesis is controlled by proteins such as the Rho GTPase, which activates cytokinesis and cyclin-Cdks that inhibit cytokinesis. Drosophila has 3 mitotic cyclins CycA, CycB and CycB3, which are successively degraded at the end of mitosis to allow the initiation of cytokinesis. The last step of abscission is a phenomenon that is still obscure. The ESCRTIII components VPS4 and CHMP4C protein linked to ANCHR will, in an Aurora B kinasedependent manner, promote abscission with recent studies implicating Cyclin B at this stage. Here, the aim was to test the role of cyclin B in cytokinesis and abscission, using real-time, high resolution microscopy of Drosophila melanogaster S2 cells expressing recombinant fluorescent proteins. This study was divided into two parts: gain and loss of function studies respectively using stable non-degradable cyclin B (CycBstable-GFP) and inhibition by using CycB double-stranded RNA (dsRNA). The CycBstable-GFP perturbed cytokinesis by inducing multiple contractile rings and midbodies. However CycB depletion had no detectable effect on the progression of cytokinesis nor on abscission despite the recruitment of CycB-GFP to the late midbody. In contrast, the protein Cdk1 seemed to play a role in abscission, since its depletion induced a delay. It therefore has potential implications for cytokinesis.

La toxoplasmose, déterminée par le parasite Toxoplasma gondii, est l'une des infections les plus répandues au monde, en raison de la persistance à vie sous forme latente de ce parasite au sein de ces hôtes. Ce parasite fait partie des Apicomplexa et détourne les voies de signalisation de l'hôte par des mécanismes épigénétiques qui convergent vers des protéines nucléaires clés. Nous rapportons ici une nouvelle stratégie de persistance parasitaire impliquant la protéine de rhoptries ROP16 de T. gondii, sécrétée précocement lors de l'invasion, qui cible le facteur de transcription UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING fingers domain 1) et induit un arrêt du cycle de la cellule-hôte. Ceci est induit par l'activité de la DNMT et le remodelage de la chromatine au niveau du promoteur du gène de la cycline B1 par le recrutement d’UHRF1 phosphorylé associé à un complexe protéique multienzymatique répressif. Cela conduit à la désacétylation et à la méthylation de l'histone H3 entourant le promoteur de la cycline B1 pour réduire de manière épigénétique son activité transcriptionnelle. De plus, l'infection par T. gondii provoque une hyper-méthylation de l'ADN dans la cellule hôte par la régulation positive des DNMTs. ROP16 est déjà connue pour activer et phosphoryler des facteurs de transcription de l'immunité protectrice tels que STAT 3/6/5 et le suppresseur tumoral p53 impliqué dans la progression du cycle cellulaire. De plus, ROP16 module ces voies de signalisation de l'hôte de manière souche-dépendante. Comme dans le cas de STAT3, les effets de ROP16 sur UHRF1 dépendent du polymorphisme d'un seul acide aminé du domaine kinase de ROP16. Ce travail montre que Toxoplasma module un nouvel initiateur épigénétique, UHRF1, via un événement précoce initié par la kinase parasitaire ROP16. / Toxoplasmosis, caused by the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, is one of the most common infections in the world due to the lifelong persistence of this parasite in a latent stage in its hosts. T. gondii hijacks host signaling pathways through epigenetic mechanisms which converge on key nuclear proteins. Here we report a new parasite persistence strategy involving Toxoplasma rhoptry protein ROP16 secreted early during invasion, which targets the transcription factor UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING fingers domain 1), and leads to host cell cycle arrest. This is mediated by DNMT activity and chromatin remodeling at the cyclin B1 gene promoter through recruitment of phosphorylated UHRF1 associated with a repressive multienzymatic protein complex. This leads to deacetylation and methylation of histone H3 surrounding the cyclin B1 gene promoter to epigenetically silence its transcriptional activity. Moreover, T. gondii infection causes DNA hypermethylation in its host cell, by upregulation of DNMTs. ROP16 is already known to activate and phosphorylate protective immunity transcription factors such as STAT 3/6/5 and the tumor suppressor p53 involved in cell cycle progression. Moreover, ROP16 modulates host signaling pathways in a strain-dependent manner. Like in the case of STAT3, the strain-dependent effects of ROP16 on UHRF1 can be attributed to a single amino-acid polymorphism in ROP16. This study demonstrates that Toxoplasma hijacks a new epigenetic initiator, UHRF1, through an early event initiated by the ROP16 parasite kinase.

BMI1 est une protéine appartenant à la famille des polycombs impliquée dans la régulation épigénétique de la transcription. Il a été montré que cette protéine est essentielle à la régulation de la prolifération, de la sénescence et du métabolisme ainsi qu’à l’auto-Renouvellement des cellules souches hématopoïétiques et cancéreuses. Ce répresseur transcriptionnel au fort potentiel oncogénique est retrouvé surexprimé dans de nombreux types de cancer ; dans le cas de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) le niveau d’expression de BMI1 augmente avec l’aggravation de la pathologie. Cependant, les voies de signalisation impliquées dans sa surexpression et le rôle qu’il joue au sein de cette maladie demeurent méconnus. En réprimant l’expression de BMI1 par ARN interférence nous avons pu mettre en évidence que ce polycomb était essentiel à la prolifération cellulaire ainsi qu’au potentiel clonogénique des cellules de LMC. Nous avons également démontré pour la première fois que BMI1 soutenait la croissance tumorale à travers la répression d’un processus autophagique délétère pour la cellule cancéreuse. Une approche transcriptomique nous a permis d’identifier la cible transcriptionnelle impliquée dans ce processus, la Cycline G2. Nous avons, pour finir, trouvé une molécule, via une approche bioinformatique, capable de réinduire l’expression de la Cycline G2 dans les cellules de LMC, l’alexidine dihydrochloride. Cette molécule induit une forte autophagie dans les cellules cancéreuses ainsi que de l’apoptose. Elle s’est également montrée capable de resensibiliser à l’imatinib (un inhibiteur de BCR-ABL) une lignée pourtant résistante. / The polycomb protein Bmi1 is a major epigenetic regulator. It has been shown that this protein is essential for the regulation of cell proliferation, senescence and metabolism but also self-Renewal of hematopoïetic and cancer stem cells. This transcriptional repressor, with a strong oncogenic potential, is overexpressed in many types of cancer. In case of Chronic Myeloid Leukemia (CML) the expression level of BMI1 is associated with worsening prognosis. However, the signaling pathways involved in its overexpression and its role in this disease remains unclear. By using RNAi to repress BMI1 expression we highlighted that this polycomb was essential for proliferation and clonogenicity of CML cells. We also demonstrated, for the first time, that BMI1 supported tumor growth through repression of deleterious cancer cell autophagy. A transcriptomic approach allowed us to identify a transcriptional target involved in this process: the Cyclin G2. Through a bioinformatic approach, we finally found a molecule capable of expression re-Induction of Cyclin G2 in CML cells : alexidine dihydrochloride. This molecule induced a high level of autophagy as well as apopotosis in cancer cells. It had also been able to re-Sensitize to imatinib a resistant cell line. In conclusion, our results revealed a new role for the polycomb BMI1 in supporting the CML pathology. Moreover, our work allowed the identification of two new approaches for therapeutically targeting this oncogene functions.

L'objectif de cette thèse visait à améliorer la compréhension des mécanismes présidant à<br />l'activation du moteur moléculaire assurant l'entrée en division des cellules eucaryotes : le<br />MPF (M-Phase promoting Factor). Pour cela, le modèle d'étude sélectionné a été les divisions<br />méiotiques de l'ovocyte de Xénope. Les ovocytes de Xénope sont naturellement bloqués en<br />prophase de méiose I. En réponse à la progestérone, ils reprennent la méiose et se bloquent à<br />nouveau en métaphase II en attente de la fécondation. Ce processus, appelé maturation<br />méiotique, est sous le contrôle du complexe Cdc2-Cycline B, facteur universel de division des<br />cellules eucaryotes. Nous nous sommes intéressés à l'étude des mécanismes régulant l'activité<br />de la kinase Cdc2 au cours de la maturation méiotique. Dans un premier temps, nous avons<br />étudié la régulation de Myt1, une kinase de la famille Wee1. Ces kinases catalysent une<br />phosphorylation inhibitrice sur la protéine Cdc2 et sont donc responsables du maintien du<br />MPF sous une forme inactive pendant la phase G2 du cycle cellulaire. L'activation du MPF<br />repose sur la conversion du stock de pré-MPF inactif en stock de MPF actif, suite à la<br />déphosphorylation activatrice de Cdc2 par la phosphatase Cdc25, et à l'inhibition de Myt1.<br />Nous avons montré que l'activité de Cdc2 était nécessaire à l'inhibition de Myt1 et que deux<br />kinases, p90Rsk et Plx1, sont recrutées l'une ou l'autre pour contribuer à cette inhibition.<br />Dans un deuxième temps, nous sommes intéressés à l'implication de la protéine H-Ras lors de<br />la reprise de la méiose. Nous avons montré que dans l'ovocyte de Xénope, l'injection de HRas<br />induit la reprise de la méiose par le recrutement d'une PI3 kinase particulière. Cette voie,<br />bien que présente et activable dans l'ovocyte, n'est pas recrutée in vivo par la progestérone en<br />conditions normales. L'ovocyte est donc équipé de plusieurs voies de signalisation<br />fonctionnellement redondantes, susceptibles de conduire à l'activation du MPF, qui peuvent<br />être recrutées dans des conditions pathologiques pour assurer la reprise de la méiose quand les<br />effecteurs normaux ne sont pas disponibles.

L'agressivité des cancers est souvent liée au pouvoir métastatique des cellules tumorales et la dissémination de ces dernières peut survenir suite à un phénomène appelé la transition épithéliomésenchymateuse. Une analyse de l'expression de la Cycline A2 conduite sur des échantillons humains de tumeurs primaires colorectales et de leurs métastases correspondantes révèle que cette protéine est moins abondante dans ces dernières. Le travail décrit dans cette thèse a permis de relier la Cycline A2 au remodelage du cytosquelette d'Actine dans les fibroblastes. Cette régulation requiert la localisation cytoplasmique de la molécule ainsi que son domaine N-terminal qui ne lie pas les CDKs. Nos expériences suggèrent que cette nouvelle activité est la conséquence d'une liaison directe entre la GTPase RhoA et la Cycline A2. La présence de cette dernière augmente l'activation de RhoA par sa GEF in vitro. L'utilisation de cellules épithéliales mammaires normales a permis l'identification d'un autre partenaire, RhoC. Dans ce contexte cellulaire, l'invalidation de la Cycline A2 diminue l'activation de RhoA et, renforce celle de RhoC ce qui conduit à une augmentation de l'invasion cellulaire en matrice de collagène. Ces cellules acquièrent aussi des propriétés mésenchymateuses caractéristiques de l'EMT, et ce phénotype est exacerbé par la présence de RasV12. Ce travail établit donc l'existence de nouvelles fonctions pour la Cycline A2 qui viennent compléter le tableau de régulation de la motilité par les protéines du cycle cellulaire et contribuent à une meilleure compréhension de son rôle dans le cancer. / Cancer aggressiveness is often associated with metastases occurrence and their dissemination can arise following an epithelial to mesenchymal transition (EMT). Cyclin A2 expression is lower in metastases relative to primary colon adenocarcinoma of matched human tumors. This manuscript describes new links between Cyclin A2 and Actin cytoskeleton remodeling in fibroblasts. This regulation requires a cytoplasmic localization of the protein and its N-terminal domain, which is unable to bind CDKs. This new Cyclin A2 activity appears to be mediated by its binding to RhoA. Accordingly, the activity of its GEF is potentiated when Cyclin A2 is present, in vitro. Furthermore, we used a normal mammary epithelial cell line and identified another Cyclin A2 partner, RhoC. Cyclin A2 depletion in this context leads to a reciprocal RhoGTPase activation where RhoA activation is impaired and that of RhoC is increased. Moreover, cell invasiveness is increased in a collagen matrix following Cyclin A2 knockdown in these cells. In addition, the epithelial cells acquire mesenchymal properties, which are exarcerbated by the expression of RasV12 and are characteristic of an EMT. Our work completes the network involving cell cycle proteins in motility. These novel functions of Cyclin A2 will hopefully help to understand the impact of its deregulation in cancer.

Chez les eucaryotes supérieurs, la progression ordonnée du cycle cellulaire est régie par une dizaine de kinases Cdk-cyclines. Les altérations génétiques ou épigénétiques impliquant des oncogènes ou des gènes codant pour des suppresseurs de tumeurs sont souvent associées à l'expression ou l'activation aberrante des Cdks, favorisant ainsi la prolifération cellulaire incontrôlée et notamment le développement de cancers. Malgré la pertinence oncogénique et thérapeutique de ces protéines, leur détection est restée jusqu'à présent limitée à des méthodes indirectes et invasives. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer un biosenseur peptidique fluorescent permettant de reconnaître spécifiquement les Cdk-cyclines. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, le biosenseur a été délivré efficacement dans les cellules. La mise au point d'une quantification ratiométrique du signal a par ailleurs permis d'évaluer l'abondance relative des Cdk-cyclines endogènes. Deux variants plus spécifiques de certains complexes ont pu être développés. Enfin, d'autres versions du biosenseur ont quant à elles permis d'évaluer sa biodistribution in vivo et de mettre au point un essai cellulaire en vue d'un criblage de petites molécules ayant un effet sur l'abondance relative des Cdk-cyclines. / Cdk-cyclins represent key regulators of cell cycle progression among superior eukaryotes. Genetic and epigenetic alterations involving oncogenes or tumor suppressor genes are often associated with aberrant expression or activation of Cdks, leading to the sustained proliferation of cells and by the way to the development of cancers. Despite the oncogenic and therapeutic relevance of these proteins, their detection has so far remained limited to indirect and invasive methods. My Ph.D. thesis work aimed in this context at developing peptidic fluorescent biosensors that specifically recognize Cdk-cyclins. Combined to cell-penetrating peptides, the biosensor was efficiently delivered into cells. Following the development of the signal ratiometric quantification, the relative abundance of endogenous Cdk-cyclins was directly evaluated in living cells. Two other variants, that are more specific towards specific Cdk-cyclin complexes, were also designed. Finally, the development of novel versions of the biosensor allowed us to evaluate its biodistribution in vivo and to set up a cell-based assay to screen small molecules having an effect on Cdk-cyclin relative abundance.

La protéine cIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein-1) de la famille des IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) est une E3 ubiquitine ligase qui présente des propriétés oncogéniques. Notre équipe s’intéresse aux processus permettant la différenciation des monocytes en macrophages. Au cours de la différenciation de nombreux modèles cellulaires (macrophages, cellules dendritiques, cellules épithéliales du colon, cellules souches hématopoïetiques, cardiomyocytes), cIAP1 sort du noyau pour se relocaliser dans le cytoplasme. La plupart des fonctions connues de cIAP1 sont liées à sa localisation cytoplasmique où elle est un régulateur important des voies de signalisation des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Lors de la différenciation macrophagique, nous avons montré que cIAP1, une fois dans le cytoplasme, induit la dégradation de TRAF-2, un adaptateur moléculaire impliqué dans la transduction du signal des voies des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Cette dégradation bloque la voie canonique de NF-κB et est essentielle à la différenciation terminale des monocytes en macrophages qui nécessite une activation transitoire de cette voie de signalisation. Cependant, cIAP1 est principalement exprimée dans le noyau de différents types cellulaires ce qui n’est pas en accord avec son rôle dans la signalisation cellulaire. Mon objectif a donc consisté à identifier les fonctions nucléaires de cIAP1 dans des cellules prolifératives ou lors de la différenciation macrophagique. Mon travail de thèse a permis d’identifier un rôle de cIAP1 dans la prolifération cellulaire. cIAP1 interagit avec le facteur de transcription E2F1 et favorise son recrutement sur les promoteurs des Cycline E et A impliquées dans les transitions G1/S et G2 du cycle cellulaire, ce qui augmente l’expression des transcrits et des protéines de ces deux cibles. Il semblerait que par cette activité, cIAP1 régule la prolifération des cellules et soit important dans l’équilibre entre la prolifération et la différenciation, deux mécanismes cellulaires étroitement liés. / The inhibitor of apoptosis protein cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) from the IAP family (Inhibitor of Apoptosis Protein) is an E3 ubiquitin ligase that displays oncogenic properties. Our team is interested in the mecanisms that allow macrophagic differentiation from monocytes. cIAP1 is relocalised from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation of many kind of cellular models (macrophages, dendritic cells, colon epithelial cells, hematopoietic stem cells, cardiomyocytes). The well-known functions of cIAP1 are associated with its cytoplasmic localisation, where it regulates the TNFα receptors and NF-κB signalling pathways. During macrophage differentiation, we show that cIAP1, once it is in cytoplasm, induces TRAF-2 degradation, a molecular adaptator of the TNFα receptors family and NF-κB signalling pathways. This degradation blocks the canonical pathway of NF-κB and is essential for the terminal differentiation into macrophages that needs a transitory activation of this pathway. However, cIAP1 is mainly expressed in the nucleus on many cell types which is not in accordance with its cell signalling activity. My objective was to investigate the nuclear function of cIAP1 in proliferative cells or during macrophage differentiation. My work identifies a function of cIAP1 in proliferation regulation. cIAP1 interacts with E2F1 transcription factor and favors its recruitment on Cyclins E and A promoters, both involved in G1/S and G2 phases of the cell cycle, which leads to high level of transcript and protein expression of these two targets. It seems that cIAP1 regulates the cellular proliferation and is important for the balance between proliferation and differentiation, two mechanisms tightly connected in cells.