L’utilisation intensive des antibiotiques a conduit à l’émergence inquiétante de souches bactériennes multi-résistantes, notamment chez les salmonelles et les colibacilles responsables de maladies infectieuses préoccupantes en santé publique et vétérinaire. Les peptides de défense de l’hôte (HDP) constituent les effecteurs antimicrobiens essentiels de l’immunité innée des animaux. La principale famille d’HDPs chez les oiseaux sont les défensines aviaires, dont deux membres (AvBD2 et AvBD7) isolés de la moelle osseuse du poulet présentent un large spectre antibactérien et constituent ainsi des molécules candidates alternatives aux antibiotiques. Pour démontrer l’intérêt thérapeutique de l’AvBD2 et de l’AvBD7, nous avons (1) prouvé leur efficacité antibactérienne in vitro contre des souches cliniques multirésistantes, (2) montré leur stabilité structurale et fonctionnelle face aux protéases digestives majeures, (3) mis en évidence un nouvel effet antimicrobien dans les macrophages infectés, et finalement (4) prouvé le concept thérapeutique en réduisant la mortalité et la charge bactérienne après injection d’AvBD7 dans un modèle de salmonellose systémique létale chez la souris. / Large-scale use of antibiotics has leaded to the emergence of multi drug resistant bacterial strains, particularly in the genus Salmonella and Escherichia coli responsible for infectious diseases outbreaks. This constitutes a major veterinary and public health concern. Host defense peptides (HDPs) represent major effector molecules of the animal’s innate immune system. In birds, the main family of HDPs is composed of avian defensins whose two members (AvBD2 and AvBD7) isolated from chicken bone marrow exhibit large spectrum antibacterial activity. Thus, they both constitute potential candidate molecules as alternative to antibiotics. To demonstrate the therapeutic interest of AvBD2 and AvBD7, we have (1) proved their antibacterial efficiency in vitro towards clinical and multi drug resistant bacterial strains, (2) shown their functional and structural stability when facing major digestive proteases, (3) identified a novel antibacterial effect in infected macrophages, and finally (4) proved the therapeutic concept by reducing mortality and bacterial load after AvBD7 injection in a murine model of lethal salmonellosis.

Staphylococcus aureus d'origine communautaire (SARM-C) est responsable d'infections sévères comme la pneumonie nécrosante. La leucocidine de Panton-Valentine (PVL), l'Hémolysine-α(Hla) et la protéine A (Spa) sont les facteurs de virulence impliqués dans cette infection. L'analyse bibliographique montre que les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont la principale cible de la PVL et que les α-défensines secrétées par les PNN peuvent neutraliser des toxines bactériennes. De plus, il est montré que des antibiotiques modulent la sécrétion des facteurs de virulence par S. aureus. Dans ce contexte, nous avons étudié l'effet des défensines sur la cytotoxicité de la PVL ainsi que l'effet des antibiotiques seuls et couplés aux défensines sur la production de PVL, Hla et Spa par des SARM-C. Nous montrons pour la première fois que les défensines peuvent diminuer la cytotoxicité de la PVL. Dans la deuxième partie du travail personnel, nous avons observé que l'effet de faibles concentrations d'antibiotique sur les SARM- C dépendait de l'antibiotique et du facteur de virulence. La clindamycine et le linézolide diminuent la PVL, Hla et Spa alors que la tigécycline supprime essentiellement la production de PVL. La daptomycine et la vancomycine n'ont pas d'effet. Nous avons démontré que l'effet des α-défensines couplé aux antibiotiques sur la virulence concerne essentiellement Spa. De façon intéressante, les α-défensines couplé aux antibiotiques ne diminuent pas la production de Spa pour le clone USA300 contrairement aux autres SARM-C, ce qui pourrait expliquer la sévérité de ses infections et son succès épidémique / Community Acquired Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) induce severe diseases such as necrotizing pneumonia. Panton-Valentine Leucocidin (PVL), Hémolysine-α(Hla) and protein A (Spa) are important virulence factors involved in this infection. The literature review shows that polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are the target cells of PVL action in lungs and α-defensins secreted by PMNs have the capability to neutralize bacterial toxins. Moreover, low concentrations of antibiotic can modulate virulence factor production by S. aureus. In this context, the goal of this work was to study the impact of defensins on various cytotoxicity effects induced by PVL on human PMNs and to study the effect of antibiotics combined with defensins on the production of PVL, Hla and Spa by CA-MRSA. We show for the first time that α-defensins can decrease PVL toxicity mainly interacting with pore formation. Secondly, we show that low concentrations of antibiotic s’ effect on CA-MRSA virulence expression depend on the antibiotic and the virulence factor. Clindamycin and linezolid consistently suppress the expression of PVL, Hla and Spa by CA-MRSA, whereas tigecycline specifically suppress PVL expression. Daptomycin and vancomycin have no significant effects at these concentrations. For the first time, we demonstrate that the modulatory effect of α-defensins on virulence, in conjunction with antibiotics, mainly regards Spa production. Interestingly, antibiotics and defensins do not decrease Spa expression in USA300, unlike in other CA-MRSA clones. It could explain the severity of USA300 related infections and the spreading success of this CA-MRSA lineage

Depuis l'émergence récente de l'éco-­immunologie, une question majeure a été soulevée: pourquoi, malgré une évolution des systèmes immunitaires de plus en plus complexes, les hôtes sont encore sensibles aux infections? Plusieurs facteurs expliquent cette variation. Par exemple, produire une réponse immunitaire nécessite des ressources énergétiques, qui peuvent varier selon l'environnement. Une distribution hétérogène des ressources alimentaires causée notamment par l'intensification agricole pourrait avoir des conséquences sur les réponses immunitaires des populations sauvages. D'autre part, cette variation peut être due à des facteurs génétiques. Pendant mon doctorat, j'ai étudié les effets de l'intensification agricole sur une fonction du système immunitaire inné (en opposition à acquis) d'une population sauvage d'Hirondelle bicolore (Tachycineta bicolor), un passereau migrateur qui niche au Sud du Québec au Canada. J'ai aussi étudié les effets de la variation de gènes immunitaires sur la fonction immunitaire innée et les conséquences sur la reproduction de ce passereau. D’abord, j'ai déterminé l'effet de l'intensification agricole sur la capacité bactéricide du plasma contre E. coli chez les adultes d'Hirondelle bicolore. Contre toute attente, l'intensification agricole a eu un effet positif sur la capacité bactéricide contre E. coli. Cela pourrait suggérer une exposition plus forte à des souches de E. coli dans les milieux intensifs, où les individus développeraient une capacité bactéricide plus importante que les individus en milieux non-intensifs. Ensuite, je me suis aussi intéressée aux effets génétiques qui pourraient influencer la capacité bactéricide des individus. Pour cela, j'ai utilisé des gènes de β­-défensine qui codent pour des peptides impliqués dans plusieurs aspects du système immunitaire, dont les réponses immunitaires innées. Les résultats indiquent que certains gènes de β­-défensine influencent la capacité bactéricide des individus. Finalement, j'ai aussi montré une association positive entre la capacité bactéricide des adultes et la proportion d'oisillons ayant survécu jusqu’à l’envol, ce qui suggère l’absence de compromis énergétique entre cette fonction immunitaire innée et l'effort de reproduction. Mes recherches de doctorat soulèvent des questions sur l'importance de la capacité bactéricide et ce qu'elle reflète chez les populations sauvages de passereaux. Mes travaux représentent aussi une première tentative de liaison entre la variation des gènes de β-­défensine et une fonction immunitaire mais aussi avec des traits de succès reproducteurs, et ouvrent la voie à l’étude des effets des gènes de β­-défensine sur les traits liés à l’aptitude phénotypique chez des organismes sauvages.

Les peptides antimicrobiens (PAMs) sont des effecteurs de l'immunité innée et exercent leur activité microbicide sur un spectre de microorganismes. Au niveau de l'intestin, leur sécrétion est directement impliquée dans les processus homéostatiques existant entre un hôte et son microbiote. Ces dernières années, plusieurs études ont démontré une corrélation entre le niveau d'expression des PAMs et la susceptibilité des individus à différentes pathologies. Les PAMs peuvent être exprimés constitutivement ou de manière inductible. Dans les deux cas, les mécanismes de régulation (épi)génétique pour contrôler leur expression sont méconnus.Le but de ces travaux de thèse a été d'étudier la composante (épi)génétique des régulations contrôlant l'expression des gènes codant les PAMs. Utilisant un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines exposées à des molécules inhibitrices de l'activité d'enzymes modifiant la chromatine, et stimulées par la bactérie Escherichia coli, nous avons identifié l'importance du processus d'acétylation dans l'expression des ces gènes. Nous avons montré que l'inhibition des enzymes de la famille des histones déacétylases augmente significativement le niveau d'induction des gènes antimicrobiens comme la béta-défensine-2, sans impacter celui des gènes pro-inflammatoires comme l'interleukine 8. Enfin, nous avons étudié le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette observation, notamment le rôle du facteur de transcription NF- B et celui de l'histone acétyltransférase p300. Ces travaux démontrent l'existence d'un mécanisme (épi)génétique permettant de réguler différentiellement le niveau d'induction des gènes antimicrobiens et pro-inflammatoires. / Antimicrobial peptides (AMPs) are conserved molecules of the innate immune system and actively kill a wide variety of microorganisms. In the intestine AMPs secreted by the epithelium protect against pathogens and support homeostasis with the microbiota. Their importance becomes clear, as their expression has been correlated with susceptibility to infection and a multitude of severe pathologies. Some AMPs are expressed constitutively, while others are inducible. The regulation of inducible AMPs expression is widely undiscovered. The role of chromatin remodeling and histone modifications, as an additional regulatory level to transcription factor activation, in the expression of inducible genes is becoming more and more clear. The aim of this work was to investigate the (epi)genetic mechanisms, which are involved in the regulation of AMPs gene expression in the intestine. By the use of specific inhibitors of chromatin modifying enzymes, in an in vitro model of intestinal epithelial cells challenged with Escherichia coli strains, we discovered the importance of acetylation in the regulation of these genes. Inhibition of histone deacetylase enzymes significantly enhanced the bacteria-induced expression of the beta-defensin-2 and other AMPs, while the expression of the interleukin 8 and other inflammatory genes was not influenced. Furthermore, we detailed the molecular mechanism, especially involvement of the transcription factor NF-κB and the histone acetyltransferase p300 in this observation. This discovery presents a mechanism of (epi)genetic enhancement of AMPs expression, dissociated from the pro-inflammatory response.

Mon travail de thèse porte sur la protéine AhPDF1 de la plante Arabidopsis halleri. AhPDF1 est une défensine de 51 résidus, riche en cystéines qui participe à la défense de la plante en jouant un rôle antifongique. La défensine AhPDF1 possède 8 cystéines impliquées dans ses 4 ponts disulfure, elle présente un repliement en CSαβ. Des travaux récents sur AhPDF1 ont permis d'identifier une nouvelle fonction : la tolérance aux métaux lourds, en particulier la tolérance au zinc. L'objectif général du projet dans lequel s'intègre ma thèse est donc de comprendre, au niveau atomique et en lien avec l'état d'oxydation des cystéines, le mécanisme par lequel les défensines de plantes confèrent la tolérance au zinc. Dans une majeure partie de ma thèse j'ai travaillé à la production de la défensine AhPDF1 d'abord dans Escherichia coli puis dans Pichia pastoris. J'ai ensuite mis au point la synthèse chimique de la protéine AhPDF1 et optimisé l'étape la plus délicate, celle du repliement oxydatif. Après avoir produit la défensine AhPDF1 en quantité et qualité suffisante, j'ai réalisé son étude structurale par RMN. De plus cette structure m'a servi de base pour modéliser, par homologie, toutes les autres défensines actuellement identifiées d'Arabidopsis halleri et Arabidopsis thaliana. Enfin, j'ai appris à maîtriser les conditions qui permettent de conserver la protéine dans un état partiellement réduit et j'ai réalisé les premiers essais de chélation de la défensine avec le zinc.

Mon travail de thèse porte sur la protéine AhPDF1 de la plante Arabidopsis halleri. AhPDF1 est une défensine de 51 résidus, riche en cystéines qui participe à la défense de la plante en jouant un rôle antifongique. La défensine AhPDF1 possède 8 cystéines impliquées dans ses 4 ponts disulfure, elle présente un repliement en CSαβ. Des travaux récents sur AhPDF1 ont permis d’identifier une nouvelle fonction : la tolérance aux métaux lourds, en particulier la tolérance au zinc. L’objectif général du projet dans lequel s’intègre ma thèse est donc de comprendre, au niveau atomique et en lien avec l’état d’oxydation des cystéines, le mécanisme par lequel les défensines de plantes confèrent la tolérance au zinc. Dans une majeure partie de ma thèse j’ai travaillé à la production de la défensine AhPDF1 d’abord dans Escherichia coli puis dans Pichia pastoris. J’ai ensuite mis au point la synthèse chimique de la protéine AhPDF1 et optimisé l’étape la plus délicate, celle du repliement oxydatif. Après avoir produit la défensine AhPDF1 en quantité et qualité suffisante, j’ai réalisé son étude structurale par RMN. De plus cette structure m’a servi de base pour modéliser, par homologie, toutes les autres défensines actuellement identifiées d’Arabidopsis halleri et Arabidopsis thaliana. Enfin, j’ai appris à maîtriser les conditions qui permettent de conserver la protéine dans un état partiellement réduit et j’ai réalisé les premiers essais de chélation de la défensine avec le zinc. / My thesis focuses on the AhPDF1 plant defensin from Arabidopsis halleri. AhPDF1 is a 51-residue, cysteine-rich protein involved in the plant defense, and playing an antifungal role. AhPDF1 defensin has eight cysteins involved in its four disulfide bridges, and presents a folding in CSαβ. Recent work on AhPDF1 allowed to identify a new function : the tolerance to heavy metals, especially zinc tolerance. The overall objective of the project that fits my thesis is to understand, at the atomic level and in relation to the oxidation state of cysteins, the mechanism by which the plant defensins confer zinc tolerance. In a major part of my thesis I worked on the production of AhPDF1 defensin first in Escherichia coli and in Pichia pastoris. Then, I developed the chemical synthesis of AhPDF1 and optimized the most delicate step of the oxidative folding. After producing AhPDF1 defensin in sufficient quantity and quality, I realized its structural study by NMR. Furthermore, this structure was used as starting structure, for modeling by homology all other defensins currently identified from Arabidopsis halleri and Arabidopsis thaliana. Finally, I learnt how to master the conditions that maintain the protein in a partially reduced state in order to achieve the first assay of zinc chelation with defensin.

L'ulcère de Buruli (UB), infection à Mycobacterium ulcerans, troisième mycobactériose mondiale, connait une émergence rapide depuis 1980, essentiellement dans les pays d'Afrique subsaharienne. Jusqu’ici, les connaissances épidémiologiques sur l’UB étaient fondées sur des séries de cas cliniques non confirmés par laboratoire. Nous avons constitué la plus grande cohorte de cas confirmés à ce jour rassemblant plus de 1200 patients traités au CDTUB de Pobè au Bénin entre 2005 et 2011, afin de décrire l'épidémiologie clinique de la maladie et d'explorer l’architecture génétique de la susceptibilité à cette maladie. Les patients atteints d’UB sont des enfants (âge médian au diagnostic de 12 ans), présentant une lésion unique (96%), large (plus de 15 cm, 36%), ulcérative (66%) du membre inférieur (60%). Nous rapportons une présentation clinique atypique de l’UB, dans laquelle les patients présentent exclusivement une ostéomyélite à M. ulcerans. Le sex-ratio varie avec l’âge : les garçons sont majoritaires parmi les enfants (57% de patients masculins chez les moins de 15 ans), et les femmes parmi les adultes (33% de patients masculins). La présentation clinique dépend de l’âge et du sexe. 9% des patients masculins ont présenté une ostéomyélite contre 4% des patients féminins. Un an après la fin du traitement, 22% des patients présentent des séquelles fonctionnelles fixées. Une présentation clinique comportant une lésion oedémateuse, osseuse, de grande taille ou plusieurs lésions est significativement associée avec le développement de séquelles fonctionnelles (OR 7.64, IC95% [5.29-11.31]). Les patients coinfectés par le VIH ont un risque significativement plus élevé de développer un UB sévère (OR 2.77, IC95% [1.32-6.33]). Nous avons exploré l’architecture génétique de la susceptibilité à l’UB dans une perspective mendélienne et une perspective complexe. Le cas le plus sévère de la maladie observé dans ce centre appartient à une famille consanguine dans laquelle la ségrégation du phénotype suggère un défaut génétique mendélien récessif. Une analyse de liaison génétique par cartographie d'homozygotie suggère l’implication du locus des béta-défensines sur le chromosome 8 dans la pathogénèse de l'UB, et mène à l’identification d’une délétion homozygote ségrégeant parfaitement avec la maladie. Dans une perspective complexe, une étude d’association pangénomique a été réalisée après génotypage d’une cohorte de 400 cas et 400 témoins exposés sur plus de 2 millions de SNPs par la puce Illumina Omni2.5 et a permis l’identification de nombreux signaux d’intérêt. L’étude de réplication est en cours. La compréhension de la physiopathologie de l'infection à M. ulcerans est cruciale pour générer de nouvelles pistes thérapeutiques et vaccinales. La dissection du contrôle génétique de l'infection par l'hôte est en ce sens indispensable. / Buruli ulcer (BU), caused by Mycobacterium ulcerans, is the third most frequent mycobacteriosis worldwide. It has been rapidly emerging in sub-Saharan African countries since 1980. Until now, knowledge of BU epidemiology relied on series of non laboratory-confirmed clinical cases. From 2005-2011, we recruited the current largest cohort of laboratory-confirmed cases (more than 1,200 patients) at the Pobe CDTUB, Benin, to describe the clinical epidemiology of the disease and to explore the genetic architecture of human susceptibility to BU. Typically, patients with BU were children (median age at diagnosis 12 years) presenting with a unique (96%) large (≥15 cm, 36%) ulcerative (66%) lesion of the lower limb (60%). Atypical clinical presentation of BU included osteomyelitis with no identifiable present or past BU skin lesions. The sex ratio of BU widely varied with age, with male patients accounting for 57% of patients aged 15 years and younger, but only 33% of those older than 15 years. Clinical presentation of BU was significantly dependent on age and sex. 9% male patients had BU osteomyelitis, whereas only 4% of female patients did. 1 year after treatment, 22% of patients with follow-up information presented with permanent functional sequelae. Presentation with oedema, osteomyelitis, or large (≥15 cm in diameter), or multifocal lesions was significantly associated with occurrence of permanent functional sequelae (OR 7•64, 95% CI 5•29–11•31) and operationally defines severe BU. When coinfected with HIV, patients had a significantly higher risk to develop severe BU (OR 2.77, IC95% [1.32-6.33]). We explored the genetic architecture of susceptibility to BU in both mendelian and complex genetic frameworks. The most severe case of the disease to have been treated at the Pobe CDTUB belonged to a consanguineous family in which the segregation of the phenotype was indicative of a recessive mendelian genetic defect. Genetic linkage analysis by homozygosity mapping suggested the implication of the beta-defensin locus on chromosome 8 in BU pathogenesis and lead to the identification of a homozygous deletion, which co-segregated perfectly with the disease in the family. In a complex genetics approach, we undertook a genome-wide association study, which involved the genotyping of more than 2 million SNPs (Illumina Omni2.5) in a cohort of 400 cases and 400 exposed controls. We identified many signals of interest. The replication study is ongoing. Understanding BU physiopathology is crucial to the development of efficient vaccines and drugs. Dissection of the genetic control of the infection by M. ulcerans by its human host therefore constitutes an indispensable step.