L'hévéa (Hevea brasiliensis) est la seule source de caoutchouc naturel commercialisé à travers le monde. En Afrique et en Asie, la maladie 'Corynespora Leaf Fall' (CLF), causée par le champignon nécrotrophe Corynespora cassiicola, affecte les plantations hévéicoles en provoquant des défoliations massives sur les clones les plus sensibles. L’évaluation précoce de la sensibilité des clones dans les programmes de sélection est un enjeu majeur pour écarter les individus les plus sensibles des programmes de développement et ainsi réduire la pression de la maladie. Une des méthodes d’évaluation envisagée consiste à tester indirectement la sensibilité des clones aux effecteurs fongiques responsables de la virulence (test toxinique). Parmi tous les effecteurs potentiels du champignon identifiés in silico, seule la cassiicoline Cas1 a été purifiée et caractérisée à ce jour. Il s’agit d’une petite glycoprotéine sécrétée qui jouerait un rôle dans les phases précoces de l’infection en induisant la nécrose des tissus. Les souches porteuses du gène Cas1 sont parmi les plus agressives sur les clones d'hévéa testés. Néanmoins, certaines souches de C. cassiicola ne produisant pas de cassiicoline présentent tout de même une agressivité modérée, suggérant l'implication d'autres effecteurs dans l'établissement de la maladie CLF. Les objectifs de cette thèse sont (i) de déterminer si la sensibilité à la cassiicoline Cas1 est un critère de sélection pertinent pour identifier les clones d’hévéa les plus sensibles à la maladie CLF, et (ii) d’identifier chez l’hévéa des facteurs de sensibilité à la cassiicoline Cas1. Nous avons d'abord analysé l’inoculum naturel et montré que les souches porteuses du gène Cas1 représentent un quart de la population de C. cassiicola dans les plantations d’hévéa d’Afrique de l’Ouest, le reste étant majoritairement constitué de souches dépourvues du gène codant la cassiicoline (Type A/Cas0). Nous avons ensuite créé un mutant de délétion du gène Cas1 pour la souche de référence CCP et comparé sa virulence à celle de la souche sauvage. Nous avons ainsi pu montrer que la cassiicoline Cas1 est bien un effecteur de nécrotrophie déterminant pour la virulence de C. cassiicola chez l’hévéa puisque la souche délétée perd toute virulence sur les clones testés. Enfin, nous avons recherché chez l'hévéa des facteurs de sensibilité à la cassiicoline Cas1 à travers deux approches. La technique de "double hybride en levures" nous a permis d'identifier une trentaine de protéines candidates qui pourraient interagir physiquement avec la toxine. Une approche transcriptomique, nous a permis d’identifier les gènes d’hévéa dont l’expression est modifiée suite à l’application de la cassiicoline purifiée, en comparant un clone sensible (PB260) et un clone tolérant (RRIM600). En conclusion, ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'interaction compatible entre C. cassiicola et l'hévéa et ouvrent la voie de la sélection assistée par effecteur. / The rubber tree (Hevea brasiliensis) is the primary commercial source of natural rubber worldwide. In Asia and Africa, H. brasiliensis is affected by the Corynespora leaf fall (CLF) disease, caused by the broad-spectrum necrotrophic fungus Corynespora cassiicola. During severe attacks, massive fall of young leaves can occur in susceptible cultivars. Early evaluation of the susceptibility of rubber clones in breeding programs is required to avoid developing highly susceptible clones that would amplify the disease. An indirect phenotyping procedure envisaged consists in testing the sensitivity to the fungal toxins (or effectors) rather than the susceptibility to the fungus itself (toxin test). Among all putative effectors identified in silico, only cassiicolin Cas1 has been purified and characterized to date. This small secreted glycoprotein was for long suspected to play a role in the early phase of infection by inducing tissue necrosis. Strains carrying the Cas1 gene are the most aggressive on tested rubber clones. However, strains without cassiicolin gene (called Cas0) still show moderate aggressiveness, suggesting the existence of effectors other than cassiicolin. The objectives of this study are (i) to determine if susceptibility to cassiicolin Cas1 is a relevant selection criterion to eliminate the rubber clones most susceptible to CLF disease, and (ii) identify molecular factors involved in the sensitivity to Cas1, in rubber tree. We have thus analyzed the typology of a large set of C. cassiicola isolates collected from various rubber plantations in West Africa. Our results show that isolates carrying the cassiicolin isoform Cas1 are widely represented, but that the most represented type (A/Cas0) are isolates without cassiicolin gene. Here we show that deletion of the cassiicolin gene in the isolate CCP resulted in a total loss of virulence. This clearly demonstrated that cassiicolin is indeed a necrotrophic effector required for the virulence of isolate CCP in rubber tree. Finally, we have investigated susceptibility factors to cassiicolin Cas1 on rubber tree with two different approaches. We identified about thirty candidate proteins that could physically interact with the toxin, through the two-hybrid assay. A transcriptomic approach allowed us to identify the rubber genes differentially expressed in response to the purified cassiicolin, comparing a susceptible clone (PB260) and a tolerant clone (RRIM600). In conclusion, we think that the necrotrophic effector Cas1 can be an interesting tool for effector-based selection of tolerant clones for African plantations; however, efforts should also be placed on A/Cas0 isolates, in order to identify potential necrotrophic effector(s) responsible for their virulence. This would enlarge the potential of effector-based selection.

Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de l’ADN hautement mutagène. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanément ou être induits par une variété d’agents. Chez l’humain, les sites AP sont réparés principalement par APE1, une enzyme de réparation de l’ADN qui fait partie de la voie de réparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; c’est une AP endonucléase, 3’-diestérase et un facteur redox impliqué dans l’activation des facteurs de transcription. Récemment, il a été démontré qu’APE1 interagit avec l’enzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit l’activation d’APE1 par réduction. En outre, la délétion du gène GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant l’ADN, induit une augmentation de formation spontanée des sites AP et réduit la prolifération cellulaire. A partir de toutes ces données, il était donc intéressant d’étudier l’effet de la délétion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire d’APE1 et d’identifier la cystéine(s) d’APE1 cible(s) de la réduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montré que la déficience en GAPDH cause un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrêt est probablement dû à l’accumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra réparer son ADN. De plus, nous avons observé des foci nucléaires dans les cellules déficientes en GAPDH qui peuvent représenter des agrégats d’APE1 sous sa forme oxydée ou bien des focis de la protéine inactive au niveau des lésions d’ADN. Nous avons utilisé la mutagénèse dirigée pour créer des mutants (Cys en Ala) des sept cystéines d’APE1 qui ont été cloné dans un vecteur d’expression dans les cellules de mammifères. Nous émettons l’hypothèse qu’au moins un mutant ou plus va être résistant à l’inactivation par oxydation puisque l’alanine ne peut pas s’engager dans la formation des ponts disulfures. Par conséquent, on anticipe que l’expression de ce mutant dans les cellules déficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, libérerait les cellules de l’arrêt en phase G1 et diminuerait la sensibilité aux agents endommageant l’ADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en préservant l’activité d’APE1, joue un nouveau rôle pour maintenir l’intégrité génomique des cellules aussi bien dans les conditions normales qu’en réponse au stress oxydatif. / Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are highly mutagenic DNA lesions occurring either spontaneously or by the action of DNA damaging agents. In human cells, AP sites are processed by the major DNA repair enzyme APE1 through the base excision repair (BER) pathway. APE1 is a multifunctional protein that has AP endonuclease/3’-diesterase activities in addition to its role as a redox factor in activating many transcription factor. Recently, it has been shown that APE1 interacts with the glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an interaction that results in the activation of APE1 by reduction. Interestingly, depletion of GAPDH sensitized the cells to DNA damaging agents and induced an increase in spontaneous AP sites frequency. Moreover, cells knocked-down for GAPDH showed defects in proliferation. Here we set up to investigate the effects of GAPDH knockdown on cell cycle progression, APE1 subcellular localization and to identify the cysteine residue(s) of APE1, target(s) of GAPDH reduction. Our studies showed that GAPDH deficient cells arrested in G1 phase of the cell cycle. The defect in cell cycle progression is most probably due to accumulation of DNA damage which activates checkpoints leading to a delay in the cell cycle to allow DNA repair. Furthermore, in GAPDH deficient cells, APE1 formed nuclear foci-like structures that could represent aggregates of the oxidized form of APE1 or inactive APE1 foci on DNA lesions. Using site-directed mutagenesis, we created seven APE1 cysteine to alanine mutants which were cloned into a mammalian expression vector. We expect that at least one of these mutants is likely to resist the inactivation by oxidation as it cannot engage in disulfide bridge formation. Therefore, the expression of this mutant(s) in GAPDH knockdown cells is expected to restore a normal APE1 cellular distribution, rescue the cell cycle defects, and render the cells less sensitive to DNA damaging agents. In conclusion, our results show a new role of GAPDH in maintaining genomic stability under oxidative stress by maintaining APE1 in its functional state.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la plus fréquente des leucémies de l'adulte, caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B CD5+ anormaux dans le sang, la moelle osseuse, et les organes lymphoïdes secondaires. Les événements oncogéniques à l'origine du développement de la LLC sont peu connus. L'identification de nouveaux gènes dérégulés est importante afin d'améliorer notre compréhension du développement et de l'évolution de la LLC, et de proposer de nouvelles stratégies ciblées. Tout d'abord, nous avons montré que la LLC se développe à partir de progéniteurs hématopoïétiques multipotentes pré-leucémiques portant des mutations somatiques. J'ai également analysé la délétion 14q dans une large série de patients, et nous avons conclu que la del(14q) est associé à la trisomie 12 et à des facteurs pronostiques péjoratifs : IGHV non mutée, mutations NOTCH1, et une survie sans traitement plus courte. Enfin, la partie principale de ma thèse portrait sur la caractérisation du gain du bras court du chromosome 2 (2p). J'ai identifié une région minimale de gain chez les patients LLC/2p+ et démontré que CRM1/XPO1 (Exportin-1) se trouve dans cette région, et muté de façon récurrente dans la LLC. J'ai démontré que le gain 2p provoque la résistance aux traitements RFC, Ibrutinib, R-Idélalisib, et au Selinexor. Nos résultats révèlent également que le Selinexor est inefficace pour induire l'apoptose dans les cellules LLC-B muté pour XPO1. Au total, mon travail préconise l'évaluation du gain 2p et des mutations de XPO1 avant de décider d'un traitement de la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common adulthood leukemia, is characterized by an accumulation of abnormal CD5+ B-lymphocytes in the peripheral blood, bone marrow, and secondary lymphoid organs. The origin and pathogenic mechanisms of CLL are not fully understood. Identifying the deregulation of new genes is important to improve our understanding about CLL development and evolution, and to propose new targeted strategies. First, we have shown that CLL develops from pre-leukemic multipotent hematopoietic progenitors carrying somatic mutations. I have also analyzed the deletion 14q in a large series of patients, and we have concluded that del(14q) was associated with trisomy 12 and with pejorative prognostic factors: unmutated IGHV, NOTCH1 mutations, and a short treatment-free survival. Finally, the main part of my thesis was about the characterization of the short arm of chromosome 2 (2p). I identified a minimal region gained in 2p+/CLL patients and demonstrated that CRM1/XPO1 (Exportin-1) is located in this region, and recurrently mutated in CLL. I demonstrated that 2p gain provokes FCR, Ibrutinib, R-Idelalisib, and Selinexor drug resistance. Our results also reveal that Selinexor is inefficient in inducing apoptosis in CLL B-cells with mutations in XPO1. Altogether, my work advocates for the assessment of the 2p+ and XPO1 mutations before deciding a CLL therapy.

La délétion du chromosome 7q est l'anomalie cytogénétique la plus caractéristique du lymphome de la zone marginale splénique (LZMS). Une étude par hybridation génomique comparative de haute résolution a été conduite sur une série de 27 échantillons de LZMS afin de détecter des micro-remaniements du chromosome 7q. Une région commune de délétion (RCD) de 10,6 Mb a été délimitée sur le chromosome 7q. De plus, une microdélétion somatique du gène AHCYL2 (S-adenosyl-homocystéine hydrolase-like 2) a été détectée au sein de la RCD, définissant la plus petite RCD connue sur le chromosome 7q32 dans le SMZL et l'anomalie la plus fréquente de notre série (10/27, 37%). Bien que le séquençage du gène AHCYL2 n'a pas mis en évidence de mutation somatique, la délétion monoallélique du gène AHCYL2 est corrélée à la sous-expression de transcrits du gène AHCYL2 indiquant une haplo-insuffisance. La fonction précise de AHCYL2 reste inconnue, mais certaines données suggèrent que les protéines de type AHCYL peuvent réguler l'activité de l'enzyme AHCY (Sadénosyl- homocystéine hydrolase) et par conséquent affecter les mécanismes de transméthylation. En outre, nous avons identifié, pour la première fois dans le LZMS, une mutation R882H du gène DNMT3A (1/27, 3,7%) impliqué également dans les processus de méthylation. Ces résultats suggèrent que la dérégulation des voies métaboliques impliquées dans la méthylation peut jouer un rôle crucial dans la pathogenèse du LZMS / The chromosome 7q deletion is the most characteristic alteration in splenic marginal zone lymphoma (SMZL). High-resolution genome-focused approach was performed on 27 SMZL samples to identify submicroscopic genetic alterations on chromosome 7q. A 10.6 Mb-length common deleted region (CDR) of chromosome 7q was precisely delineated and a somatic microdeletion of the S-adenosyl-homocysteine hydrolase-like 2 (AHCYL2) gene was further detected within the CDR, defining the most frequent finding in this series (10/27, 37%) and the smallest CDR on chromosome 7q32. Although the sequencing of AHCYL2 gene did not show any evidence of somatic mutation, the monoallelic AHCYL2 gene deletion was directly correlated with underexpression of AHCYL2 transcripts, indicating a typical pattern of haploinsufficiency. The precise role of AHCYL2 remains unknown, but some data suggest that the AHCY-like proteins may regulate the activity of AHCY (S adenosylhomocysteine hydrolase) and consequently may affect the methylation metabolism. In addition, we report on a DNMT3A-R882H mutation (1/27, 3.7%) for the first time in SMZL. These findings suggest that methylation pathway dysfunction may play a crucial role in the pathogenesis of SMZL

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. / Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo. / MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice. Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5. To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.

Le cartilage est un tissu conjonctif composé d’une seule sorte de cellule nommée chondrocytes. Ce tissu offre une fondation pour la formation des os. Les os longs se développent par l'ossification endochondral. Ce processus implique la coordination entre la prolifération, la différenciation et l'apoptose des chondrocytes, et résulte au remplacement du cartilage par l'os. Des anomalies au niveau du squelette et des défauts liés à l’âge tels que l’arthrose (OA) apparaissent lorsqu’il y a une perturbation dans l’équilibre du processus de développement. À ce jour, les mécanismes exacts contrôlant la fonction et le comportement des chondrocytes pendant la croissance et le développement du cartilage sont inconnus. Le récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est un facteur de transcription impliqué dans l'homéostasie des lipides. Plus récemment, son implication a aussi été suggérée dans l'homéostasie osseuse. Cependant, le rôle de PPARγ in vivo dans la croissance et le développement du cartilage est inconnu. Donc, pour la première fois, cette étude examine le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la croissance et le développement du cartilage. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle au cartilage du gène PPARγ. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Les analyses des souris ayant une délétion au PPARγ aux stades embryonnaire et adulte démontrent une réduction de la croissance des os longs, une diminution des dépôts de calcium dans l’os, de la densité osseuse et de la vascularisation, un délai dans l’ossification primaire et secondaire, une diminution cellulaire, une perte d’organisation colonnaire et une diminution des zones hypertrophiques, une désorganisation des plaques de croissance et des chondrocytes déformés. De plus, la prolifération et la différenciation des chondrocytes sont anormales. Les chondrocytes et les explants isolés du cartilage mutant démontrent une expression réduite du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF)-A et des éléments de production de la matrice extracellulaire. Une augmentation de l’expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP)-13 est aussi observée. Dans les souris âgées ayant une délétion au PPARγ, y est aussi noté des phénotypes qui ressemblent à ceux de l’OA tel que la dégradation du cartilage et l'inflammation de la membrane synoviale, ainsi qu’une augmentation de l’expression de MMP-13 et des néoépitopes générés par les MMPs. Nos résultats démontrent que le PPARγ est nécessaire pour le développement et l’homéostasie du squelette. PPARγ est un régulateur essentiel pour la physiologie du cartilage durant les stades de croissance, de développement et de vieillissement. / Cartilage, a connective tissue composed of chondrocytes, provides an intermediate template on which bones are formed. Long bones develop through endochondral ossification, involving coordination between chondrocyte proliferation, differentiation and apoptosis, resulting in bone replacing cartilage. Disturbances in this balance results in skeletal abnormalities, and age-related defects including osteoarthritis (OA). The exact mechanisms that control chondrocyte function and behaviour during growth and development are unknown. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma, a transcription factor involved in lipid homeostasis, has recently been suggested to be involved in bone homeostasis. However, PPARγ’s role in cartilage growth and development in vivo is unknown. Therefore, for the first time, this study examines PPARγ’s specific in vivo role in cartilage growth and development using cartilage-specific PPARγ knockout (KO) mice. Conditional KO mice were generated using LoxP/Cre system. Histomorphometric analyses of embryonic and adult mutant mice demonstrate reduced long bone growth, calcium deposition, bone density, vascularity, and delayed primary and secondary ossification. Mutant growth plates are disorganized with abnormal chondrocyte shape, proliferation and differentiation, reduced cellularity, loss of columnar organization, and shorter hypertrophic zones. Isolated mutant chondrocytes and cartilage explants show decreased vascular endothelial growth factor (VEGF)-A and extracellular matrix (ECM) production product expression, and increased matrix metalloproteinase (MMP)-13 expression. Aged mutant mice exhibit accelerated OA-like phenotypes, and enhanced cartilage degradation, synovial inflammation, MMP-13 and MMP-generated neoepitope expression. Our data demonstrate that PPARγ is required for normal skeletal development and homeostasis, and is a critical regulator of cartilage health and physiology in early growth and development and aging.

Eph kinases are the largest family of cell surface receptor tyrosine kinases. The ligands of Ephs, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs interact with EFNs and the receptors and ligands transmit signals in both directions, i.e., from Ephs to EFNs and from EFNs to Ephs. Ephs and EFNs are widely involved in various developmental, physiological pathophysiological processes. Our group and others have reported the roles of Ephs/EFNs in the immune system. To further investigate the function of EphBs/EFNBs in T cell development and responses, we generated EFNB1, EFNB2, EphB4 conditional gene knockout (KO) mice and EFNB1/2 double KO mice. In the projects using EFNB1 and EFNB2 knockout mice, we specifically deleted EFNB1 or EFNB2 in T cells. The mice had normal size and cellularity of the thymus and spleen as well as normal T cell subpopulations in these organs. The bone marrow progenitors from KO mice and WT mice repopulated the host lymphoid organs to similar extents. The activation and proliferation of KO T cells was comparable to that of control mice. Naïve KO CD4 cells differentiated into Th1, Th2, Th17 and Treg cells similar to naïve control CD4 cells. In EFNB2 KO mice, we observed a significant relative increase of CD4CD8 double negative thymocytes in the thymus. Flowcytometry analysis revealed that there was a moderate increase in the DN3 subpopulation in the thymus. This suggests that EFNB2 is involved in thymocyte development. Our results indicate that the functions of EFNB1 and EFNB2 in the T cell compartment could be compensated by each other or by other members of the EFN family, and that such redundancy safeguards the pivotal roles of EFNB1 and EFNB2 in T cell development and function. In the project using EFNB1/B2 double knockout (dKO) model, we revealed a novel regulatory function of EFNb1 and EFNb2 in stabilizing IL-7Rα expression on the T cell surface. IL-7 plays important roles in thymocyte development, T cell homeostasis and survival. IL-7Rα undergoes internalization upon IL-7 binding. In the dKO mice, we observed reduced IL-7Rα expression in thymocytes and T cells. Moreover, the IL-7Rα internalization was accelerated in dKO CD4 cells upon IL-7 stimulation. In T cell lymphoma cell line, EL4, over-expression of either EFNB1 or EFNB2 retarded the internalization of IL-7Rα. We further demonstrated compromised IL-7 signaling and homeostatic proliferation of dKO T cells. Mechanism study using fluorescence resonance energy transfer and immunoprecipitation demonstrated that physical interaction of EFNB1 and EFNB2 with IL-7Rα was likely responsible for the retarded IL-7Rα internalization. In the last project, using medullary thymic epithelial cell (mTEC)-specific EphB4 knockout mice, we investigated T cell development and function after EphB4 deletion in mTEC. EphB4 KO mice demonstrated normal thymic weight and cellularity. T cell development and function were not influenced by the EphB4 deletion. Lastly, the KO mice developed normal delayed type hypersensitivity. Overall, our results suggest that comprehensive cross interaction between Eph and EFN family members could compensate function of a given deleted member in the T cell development, and only simultaneous deletion of multiple EFNBs will reveal their true function in the immune system. In fact, such redundancy signifies vital roles of Ephs and EFNs in the immune system. / Kinases Eph est la plus grande famille de tyrosines kinases récepteurs Éphrines (EFN) est un ligand de Ephs. Eph et EFN sont toutes les molécules de surface cellulaire. L’interaction entre Ephs et EFNs permet de transmettre des signaux dans les deux directions (c.-à-d. partir de Ephs à EFNs, et de EFNs à Ephs.) Eph et EFNs sont largement impliqués dans divers processus développementaux, physiologiques et physiopathologiques. Notre groupe et d'autres groupes ont rapporté les rôles de Ephs / EFNs dans le système immunitaire. Pour approfondir la fonction de EphBs / EFNBs dans le développement des lymphocytes T et des réponses immunitaires, nous avons généré des souris EFNB1, EFNB2, et EphB4 knock-out conditionnel (KO) et des souris EFNB1 / 2 doubles KO. Dans les projets qui utilisent EFNB1 et EFNB2 comme souris knock-out, nous avons spécifiquement supprimé EFNB1 ou EFNB2 dans les cellules T. Les souris présentaient une taille normale, la cellularité du thymus et de la rate, ainsi que des sous-populations de cellules T étaient normales dans ces organes. Les progéniteurs de la moelle osseuse de souris KO et les souris WT ont repeuplé les organes lymphoïdes de l’hôte à des degrés similaires. L'activation et la prolifération des cellules KO T étaient comparables à celles des souris témoins. Les cellules CD4 naïves KO différenciées en Th1, Th2, Th17 et Treg étaient similaires aux cellules CD4 naïves de souris contrôle. Chez les souris KO EFNB2, nous avons observé une augmentation relative importante des thymocytes CD4CD8 : les double négatifs dans le thymus. L'analyse par cytométrie en flux a révélé qu'il y avait une augmentation modérée de la sous-population DN3 dans le thymus. Les résultats suggèrent qu’EFNB2 est impliqué dans le développement des thymocytes. Nos résultats indiquent que les fonctions de EFNB1 et EFNB2 dans le compartiment des cellules T pourraient être compensées entre eux ou par d'autres EFNB. La redondance des fonctions suggèrent le contrôle critique d’EFNB1 et EFNB2 dans le développement des cellules T. Dans le projet, en utilisant EFNB1/B2 (modèle double KO) (dKO), nous avons observé une fonction de régulation de EFNB1 et EFNB2. dans la stabilisation de l’expression l'IL-7R α , à la surface des cellules T, IL-7 joue un rôle important dans le développement des thymocytes, l'homéostasie des lymphocytes T , et leur survie. IL-7R α subit une internalisation i contraignante de IL-7. Chez les souris DKO, nous avons observé une perte d’expression de l’ IL-7Rα dans les thymocytes et les cellules T. En outre, l’ internalisation IL-7Rα a été accélérée dans les cellules CD4 dKO, suite à la stimulation IL-7. Dans la lignée cellulaire de lymphome T, EL4, la surexpression de EFNB1 ou EFNB2 retarde l'internalisation de l'IL-7Rα. Nous avons aussi démontré les signalisations compromises de l’ IL-7 et de la prolifération homéostatique des cellules T dKO. Les études du méchanisme qui utilisent la fluorescence de transfert d'énergie par résonance et immunoprécipitation ont montré que l'interaction physique de EFNB1 et EFNB2 avec IL-7R était probablement responsable du retard de l’ internalisation IL-7Rα. Dans le dernier projet, nous avons étudié le développement des cellules T et la fonction des cellules épithéliales médullaires du thymus (mTEC), chez les souris knock-out EphB4. Les souris KO EphB4 ont démontré un poids et une cellularité qui sont normaux. La fonction et le développement de cellules T ne sont pas influencés par la suppression de l’ EphB4. Enfin, les souris KO ont développé une hypersensibilité de type retardée normale. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que l'interaction globale de croisement entre Eph et les membres de la famille EFN pourrir compenser la fonction d'un membre supprimé. Seule la suppression simultanée de plusieurs EFNBs va révéler leur vraie fonction dans le système immunitaire. En fait, une telle redondance montre les rôles vitaux d’Ephs et EFNS dans le système immunitaire.

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des maladies acquises touchant la cellule souche hématopoïétique et qui aboutissent à une hyperproduction de cellules sanguines dont le phénotype dépend du type du NMP. La mutation la plus proéminente des NMP est JAK2V617F. Elle peut être associée à différents NMP sporadiques et familiaux.Une des problématiques, non résolue, des NMP est de comprendre comment une même mutation JAK2V617F peut donner plusieurs maladies. Notre hypothèse est que le phénotype observé pourrait dépendre du nombre de copies de JAK2V617F. Une autre inconnue concerne la cause génétique des formes familiales.Pour ces raisons, nous avons modélisé des NMP sporadiques et un cas familial par les iPS. Cette approche devrait nous permettre d’une part, de comparer les effets de JAK2V617F à l’état hétérozygote et homozygote sur l’hématopoïèse et d’autre part, d’avancer dans la compréhension des effets d’une duplication de 5 gènes que nous avons identifiée, par une approche de génétique, comme un facteur de susceptibilité chez 2 familles.Dans la première partie du travail, concernant la modélisation des NMP sporadiques, nous avons montré que JAK2V617F augmente la prolifération des cellules myéloïdes obtenues à partir des iPS. D’autre part, nous avons pu mettre en évidence une différence marquée dans l’hypersensibilité à la TPO et à l’EPO entre les lignées hétérozygotes et homozygotes pour JAK2V617F permettant d’expliquer le phénotype des PV et des TE. Dans la deuxième partie concernant les NMP familiaux, nous avons pu mettre en évidence un phénotype spécifique attribuable à la seule duplication. Grace à ce modèle, nous allons pouvoir identifier le(s) gène(s) responsable(s) du phénotype. Ce travail apporte la preuve de concept que les iPS sont un bon outil pour modéliser les NMP sporadiques et familiaux et qu’elles peuvent servir comme outils de criblage de petites molécules développées à des fins thérapeutiques. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal hematologic diseases which lead to an overproduction of blood cells. The affected myeloid lineage depends on the type of MPN. JAK2V617F is the most predominant mutation in MPN and can be associated with various sporadic and familial cases.One main issue to address in MPN is to understand how a single mutation JAK2V617F can give rise to several diseases. Our hypothesis is that this phenotypic heterogeneity might be due to the JAK2V617F gene dosage. Another goal is to identify the genetic cause of familial MPN.For these reasons, we modeled sporadic and familial MPN cases with iPS technology. This approach allowed us i) to compare the impact of heterozygous and homozygous JAK2V617F mutation on hematopoiesis and ii) to get insight into the effects of a 5 genes duplication that we identified as a susceptibility locus uncovered by a genetic approach in 2 families.In the first part of the work concerning sporadic MPN modeling, we showed that JAK2V617F increases iPS myeloid potential. Furthermore, we showed a marked difference in the TPO and EPO hypersensitivity between heterozygous and homozygous JAK2V617F iPS cell lines that could be linked to the difference between PV and ET. In the second part of the work, we demonstrated a specific phenotype due to the sole duplication. This model will allow us to identify the gene(s) responsible of the phenotype. This study brings the proof of concept that iPS can be used for sporadic and familial MPN modeling and drug screening.

Les entérovirus du groupe B (EV-B) sont une cause majeure de myocardite aiguë, précurseur de la myocardite chronique et de la cardiomyopathie dilatée (CMD) chez l’homme. Les mécanismes moléculaires viraux impliqués dans la progression de la myocardite aiguë vers la phase chronique et la CMD restent inconnus. En utilisant une approche NGS, nous avons détecté des populations persistantes majoritaires d’EV-B tronquées en extrémité 5’, associées à des formes complètes mineures dans des cas de CMD. Afin évaluer leur impact sur la fonctionnalité des cardiomyocytes, nous avons transfecté dans des cardiomyocytes primaires (HCM) des ARN viraux clonés et identiques à ceux détectés dans les cas de CMD. Les formes EV-B majoritaires tronquées en extrémité 5’, seules ou associées à des populations complètes « auxiliaires » pourraient altérer les fonctions des HCM par des activités de la P2A virale. L'existence de mécanismes de recombinaison génomique entre les populations virales persistantes tronquées et complètes a été étudiée par un test de recombinaison d’ARN EV-B défectifs transfectés dans des HCM. Cette approche in vitro a produit majoritairement des recombinants non-homologues caractérisés par des échanges génétiques dans la région 5’NC (spacer1/2). Nos résultats indiquent l’existence d’événements de recombinaison génomique en région 5’ entre les populations d’EV-B tronquées et complètes qui pourraient contribuer au développement de la CMD. Une meilleure compréhension des mécanismes de persistance virale permettra le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre les infections chroniques par les EV-B. / Group-B Enteroviruses (EV-B) are a common cause of human acute myocarditis, a disease that is a precursor of chronic myocarditis and dilated cardiomyopathy (DCM). However, the viral molecular mechanisms involved in the progression of acute to chronic myocarditis and subsequently to DCM remain unknown. Using NGS approach, we detected persistent major EV-B populations characterized by 5’ terminal genomic deletions ranging from 17 to 50 nucleotides associated with minor complete viral forms in explanted hearts of DCM cases. To assess their impact on cardiomyocyte functions, we transfected viral RNA clones mimicking the viral genomes found in patients’ tissues into primary human cardiomyocytes (HCM). Our findings demonstrated that the major persistent 5’ deleted viral forms alone or associated with full-length populations of helper RNAs could impair cardiomyocyte functions by viral 2Apro activities in EV-DCM cases. To assess the existence of genomic recombination mechanisms between persistent deleted and full-length viral helper populations, we used a recombination assay based on the rescue of non-replicative EV-B RNAs transfected in HCM. This in vitro approach produced major (75%) non-homologous recombinants that nucleotides sequencing characterized modular exchanges into the spacers 1 & 2 of the 5’NC region. Our findings indicate the existence of genomic recombination events through which, 5’ deleted and complete collaborative EV-B populations could significantly contribute to the pathogenesis of unexplained DCM cases. A better understanding of these viral persistence mechanisms will stimulate new therapeutic strategies research for chronic infections caused by EV-B.