Les inhibiteurs de BRAFV600-, dont le vemurafenib, sont efficaces contre les tumeurs présentant cette mutation activatrice de la voie des MAPK, ce qui est le cas d’un mélanome sur deux. Mais la plupart des malades traités rechutent dans l’année, et développent des tumeurs paradoxales secondaires.Divers mécanismes de résistance aux inhibiteurs de BRAF ont été décrits, cette résistance passant soit par réactivation de la voie des MAPK, soit par activation de la voie parallèle Akt/mTor, soit par anomalie de régulation de l’apoptose. Dans le cadre de cette thèse, nous avons mis en évidence une nouvelle cible thérapeutique: l’initiation de la traduction cap-dépendante. L’augmentation de la traduction de certains ARNm en protéines est une étape capitale de l’expression des gènes dans les processus oncogènes. Une étape limitante de cette traduction est son initiation. La protéine eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) se lie à la coiffe m7GTP des ARNm et régule la synthèse protéique en fonction de ses partenaires 4EBP1 et eIF4G. Quand eIF4E est assemblé à eIF4G et eIF4A, on parle du complexe « eIF4F », situé au point de convergence de la voie des MAPK et de la voie Akt/mTor via 4EBP1. Ce complexe est nécessaire à la traduction des protéines de survie et de prolifération cellulaire ayant une structure secondaire complexe en 5’UTR. Pour déterminer le statut d’activation du complexe eIF4F dans des lignées cellulaires, nous avons réalisé une immunoprécipitation des protéines liées au cap (« cap-binding assay »). Nous avons observé que le vemurafenib entraînait une diminution d’eIF4G fixé à eIF4E dans les cellules sensibles mais aucune modification dans les lignées résistantes. Parallèlement, la fixation de 4EBP1 à eIF4E augmente sous vemurafenib pour les lignées sensibles. Pour confirmer ces résultats, nous avons utilisé la technique de « Proximity Ligation Assay » (PLA), qui nous a permis de visualiser les complexes eIF4E-eIF4G et eIF4E-4EBP1 sous forme de points fluorescents observables en microscopie. Le nombre de complexes eIF4E-eF4G était bien diminué dans les cellules sensibles sous vemurafenib ce qui n’était pas le cas dans les cellules résistantes. Parallèlement, le nombre d’interactions eIF4E-4EBP1 augmentait dans les cellules sensibles et restait stable dans les cellules résistantes. De même, dans les tumeurs de patients, le rapport des complexes eIF4E-eIF4G sur eIF4E-4EBP1 diminuait dans les métastases en réponse au vemurafenib puis réaugmentait lors des récidives tumorales. De plus, nous avons testé des composés ciblant la traduction cap-dépendante et plus particulièrement eIF4A : les flavaglines. Nous avons montré que leur capacité à cibler l’initiation de la traduction était corrélée à l’inhibition de la prolifération des lignées cellulaires résistantes. Enfin, nous avons testé l’une d’elles in vivo. Les résultats montrent un effet synergique de cette drogue combinée au vemurafenib et une inhibition de la croissance tumorale.Concernant l’autre inconvénient majeur des anti-BRAF, l’induction fréquente de tumeurs secondaires, nous avons visualisé, aussi par PLA, les dimères BRAF-CRAF pour la première fois dans une série de tumeurs paradoxales de patients, cutanées et extra-cutanées. Ces dimères sont significativement plus nombreux dans les tumeurs cutanées apparaissant sous anti-BRAF que dans une série tumeurs contrôles de même type.En conclusion, nous avons identifié un nouveau biomarqueur de résistance aux anti-BRAF, visualisable par PLA. Pour optimiser la réponse tumorale à ces thérapies ciblées, qui constituent le traitement de choix des mélanomes métastatiques mutés, nous proposons d’y associer un inhibiteur de l’initiation de la traduction. Nous avons en parallèle mis au point le PLA BRAF-CRAF dans les tumeurs paradoxales induites par les anti-BRAF, et nous avons identifié des sous-populations plus à risque de développer ce type de tumeurs. / BRAFV600- inhibitors, including vemurafenib, are efficient against tumors harboring this MAPK pathway activating mutation, which is the case of ~50% of melanomas. But most of the patients under treatment progress within a year, and develop paradoxical secondary tumors. Most resistance mechanisms to drugs that target the BRAF and/or MEK kinases in cancer rely on reactivation of the RAS-RAF-MEK-ERK signal transduction pathway (ERK-dependent), on activation of the alternative PI3K-AKT-mTOR pathway (ERK-independent) or on modulation of the caspase-dependent apoptotic cascade. All three pathways converge to regulate the formation of the eIF4F translation initiation complex that binds to the 7-methyl-guanine cap at the 5’ end of mRNAs, thereby modulating mRNA translation of specific mRNAs. We show here that persistent formation of the eIF4F complex, comprising the eIF4E cap binding protein, the eIF4G scaffolding protein and the eIF4A RNA helicase, is associated with resistance to anti-BRAF, anti-MEK and to anti-BRAF + anti-MEK combinations in BRAFV600- mutant melanoma, colon and thyroid cell lines. Unresponsiveness to treatment and maintenance of eIF4F complex formation is associated with either reactivation of MAPK signaling or absence of ERK-independent decreased phosphorylation of the inhibitory eiF4E binding protein 4EBP1 or increased pro-apoptotic Bcl-2 modifying factor (BMF)-dependent degradation of eIF4G. Development of an in situ method shows by proximity ligation assay (PLA) that the formation of the eIF4F complex is decreased in tumors responding to anti-BRAF therapy and increased in resistant metastases. Strikingly, inhibiting the eIF4F complex, either by blocking the eIF4E-eIF4G interaction or by targeting eIF4A with small compounds is synergistic with BRAFV600- inhibition. The other main problem arising during anti-BRAF treatment is the frequent induction of secondary cutaneous and extra-cutaneous tumors, through the formation of BRAF-CRAF dimers that we visualized in vivo for the first time. In conclusion, we have identified by PLA a novel biomarker of resistance against BRAF inhibitors, which is also a promising therapeutic target. Combinations of drugs targeting BRAF (and/or MEK) and eIF4F may overcome most of the resistance mechanisms arising in BRAFV600- cancers. In parallel, we established a BRAF-CRAF PLA method in paradoxical secondary tumors induced by BRAF inhibitors, leading to the identification of several subpopulations more at risk of developing this type of tumors.

Les méthodes de la chimie quantique sont aujourd'hui des outils importants pour étudier la structure électronique des molécules et pour calculer les énergies totales associées. Les méthodes de la chimie quantique sont souvent utilisées pour interpréter toutes sortes d'expériences spectroscopiques. Ces méthodes servent également pour étudier les mécanismes chimiques des réactions chimiques. Un cas particulier est celui de la photochimie. Actuellement grâce à l'élaboration des méthodologies théoriques, l'analyse théorique de l'état fondamental et des états excités a évolué jusqu'au point qu'il fournit des solutions aidant à mieux comprendre ou même prédire les processus photochimiques. Parmi tous les méthodes de la chimie quantique, la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT, pour l'anglais density functional theory) a émergé comme une méthode de choix pour le calcul de l'état fondamental des grandes molécules. En particulier, grâce à son applicabilité et son exactitude, la DFT a pu servir dans l'étude de problèmes d'intérêt pratique. Pour les états excités, la DFT dépendante du temps (TDDFT, pour l'anglais time-dependent density functional theory) est actuellement une des approches les plus populaires. La TDDFT permet le calcul des propriétés de l'état excité des systèmes moléculaires telles que, par exemple, les énergies d'excitation, les forces oscillatrices et les géométries des états excités. Cependant les méthodes informatiques standards ont des inconvénients inhérents qui parfois limitent sérieusement leur utilité. C'est ça le sujet de cette thèse : évaluer l'implémentation, l'applicabilité et la validité de la TDDFT en utilisant différentes approximations et dans différentes situations.

Le but de cette thèse est la compréhension de pourquoi certains complexes de ruthénium sont soit pasluminescents soit avec un temps de vie très courte de l'état excité. Des calculs de type théorie de lafonctionnelle de la densité (DFT) ou DFT dépendante du temps (TD-DFT) étaient effectués pour cinqcomplexes existants et aussi pour un complexe hypothétique. Selon la théorie de champs de ligand (LFT),la plus proche sont les énergies des états de type transfert de charge métal-ligand (MLCT) à un état de typemétal centré (MC), alors le plus facile est-ce à peupler l'état MC ainsi menant à une dèsexcitation nonradiative de l'état MLCT. Les calculs DFT/TD-DFT s'avéraient suffisants pour reproduire les géométrieset spectres d'absorption expérimentales. Ceci, ensemble avec la technique de densité d'états partielle,permettaient une validation de l'idée fondamentale issue du modèle LFT en confrontant les résultats denos calculs avec les temps de vie mesurés.

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil important pour l’investigation qualitative et quantitative de la physiologie du cerveau. L’investigation de l’activité neuronale à l’aide de cette modalité est possible grâce à la détection de changements hémodynamiques qui surviennent de manière concomitante aux activités de signalisation des neurones, tels l’augmentation régionale du débit sanguin cérébral (CBF) ou encore la variation de la concentration de désoxyhémoglobine dans les vaisseaux veineux. Pour étudier la formation de contrastes fonctionnels qui découlent de ces phénomènes, deux séquences de pulses ont été développées en vue d’expériences en IRM fonctionnelle (IRMf) visant l’imagerie du signal oxygéno-dépendant BOLD ainsi que de la perfusion. Le premier objectif de cette thèse fut le développement d’une séquence de type écho-planar (EPI) permettant l’acquisition entrelacée d’images en mode échos de gradient (GRE-EPI) ainsi qu’en mode échos de spins (SE-EPI) pour l’évaluation de la performance de ces deux méthodes d’imagerie au cours d’une expérience en IRMf BOLD impliquant l’utilisation d’un stimulus visuel chez 4 sujets adultes sains. Le deuxième objectif principal de cette thèse fut le développement d’une séquence de marquage de spins artériels employant un module de marquage fonctionnant en mode pseudo-continu (pCASL) pour la quantification du CBF au repos. Cette séquence fut testée chez 3 sujets adultes en bonne santé et sa performance fut comparée à celle d’une séquence similaire développée par un groupe de recherche extérieur. Les résultats de l’expérience portant sur le contraste BOLD indiquent une supériorité de la performance du mode GRE-EPI vis-à-vis celle du mode SE-EPI en termes des valeurs moyennes du pourcentage de l’ampleur d’effet et du score t associés à l’activité neuronale en réponse au stimulus. L’expérience visant la quantification du CBF démontra la capacité de la séquence pCASL développée au cours de ce projet de calculer des valeurs de la perfusion de la matière grise ainsi que du cerveau entier se retrouvant dans une plage de valeurs qui sont physiologiquement acceptables, mais qui demeurent inférieures à celles obtenues par la séquence pCASL développée par le groupe de recherche extérieur. Des expériences futures seront effectuées pour optimiser le fonctionnement des séquences présentées dans ce mémoire en plus de quantifier l’efficacité d’inversion de la séquence pCASL. / Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the qualitative and quantitative investigation of brain physiology. The investigation of neuronal activation using this modality is made possible by the detection of concomitantly-arising hemodynamic changes in the brain’s vasculature, such as localized increases of the cerebral blood flow (CBF) or the variation of the concentration of paramagnetic deoxyhemoglobin in venous vessels. To study the formation of functional contrasts that stem from these changes in MRI, two pulse sequences were developed in this thesis to carry out experiments in blood oxygenation level dependent (BOLD) and perfusion functional MRI (fMRI). The first objective laid out in this work was the development of an echo planar imaging (EPI) sequence permitting the interleaved acquisition of images using gradient-echo EPI and spin-echo EPI to assess the performances of these imaging techniques in a BOLD fMRI experiment involving a visual stimulation paradigm in 4 healthy adult subjects. The second main objective of this thesis was the development of a pseudo-continuous arterial spin labelling (pCASL) sequence for the quantification of cerebral blood flow (CBF) at rest. This sequence was tested on 3 healthy adult subjects and compared to an externally-developed pCASL sequence to assess its performance. The results of the BOLD fMRI experiment indicated that the performance of GRE-EPI was superior to that of SE-EPI in terms of the average percent effect size and t-score associated with stimulus-driven neuronal activation. The CBF quantification experiment demonstrated the ability of the in-house pCASL sequence to compute values of CBF that are within a range of physiologically-acceptable values while remaining inferior to those computed using the externally-developed pCASL sequence. Future experiments will focus on the optimization of the sequences presented in this thesis as well as on the quantification of the pCASL sequence’s labelling efficiency.

Suite à une infection, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn CD8+) spécifiques d’un antigène du pathogène sont activés. Après, cette activation, ces lymphocytes se différencient en lymphocytes T effecteurs CD8+ (LTe CD8+) chargés d’éliminer le pathogène. Une fois que l’infection est résolue, la grande majorité des effecteurs meurent par apoptose et les survivants se différencient en lymphocytes T mémoires CD8+ (LTm CD8+). Ces derniers protègeront l’organisme à long terme contre une réinfection par le même pathogène. Il est ainsi primordial d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement et la maintenance des LTm CD8+. Plusieurs études ont déjà montré que certaines cytokines de la famille γC (IL-2, IL-7, IL-15 et IL-21) influençaient individuellement le développement des LTe et LTm CD8+. Cependant, nous pensons que ces cytokines ont un impact bien plus grand sur l’homéostasie des LTe et LTm CD8+ que la littérature actuelle le laisse entendre. En effet, nous émettons l’hypothèse que ces cytokines de la famille γC agissent en synergie entre elles afin de promouvoir le développement des LTe et LTm CD8+. Pour tester notre hypothèse, nous avons dans un premier temps étudié l’impact combiné des signaux IL-2 et IL-15 sur la génération des LTe et LTm CD8+ dans un modèle d’infection LCMV Armstrong. Ensuite, dans le même modèle expérimental, nous avons étudié l’effet d’une déficience en signaux IL-2, IL-15 et IL-21 sur le développement des LTe et LTm CD8+. Nos résultats montrent que ces trois cytokines collaborent afin de soutenir l’expansion et la différenciation des LTe CD8+. Plus précisément, l’IL-2, l’IL-15 et l’IL-21 sont essentielles pour l’homéostasie d’une population particulière de LTe CD8+ : les Short-Lived Effector Cells (SLECs). Nous avons également mis en évidence que ces trois cytokines sont toutes les trois requises afin de générer un nombre maximum de LTm CD8+. De plus, la différenciation et le maintien de la population effecteur mémoire (TEM) sont particulièrement réduites en l’absence des signaux combinés de l’IL-2, l’IL-15 et l’IL-21. Nos résultats mettent pour la première fois en lumière les rôles redondants et synergiques de trois cytokines dépendantes de la chaine γc dans le développement et la maintenance des LTe et LTm CD8+. / Over the course of an infection, antigenic signals trigger a specific CD8+ T cells (LTn CD8+) response. Upon antigen recognition, LTn CD8+ are activated and undergo a massive proliferation wave. This leads them to differentiate into effector cells (LTe CD8+) in charge of pathogen elimination. While most effector T cells die after the infection is resolved, a small part of this population persists and differentiates into memory T cells (LTm CD8+). These cells provide long term protection to the organism against the initial infectious agent. It is thus crucial to have a better understanding of all mechanisms governing the development and the maintenance of LTm CD8+. Several studies have already shown that some members of the "C-dependent cytokines family (IL-2, IL-7, IL-15 and IL-21) individually regulate LTe and LTm CD8+ development. However, we believe that these cytokines have a far greater impact on the homeostasis of LTe and LTm CD8+ than the current literature suggests. Indeed, we hypothesized that "C-dependant cytokines act in synergy to promote the development of LTe and LTm CD8+. To assess their effect, we first studied the combined impact of IL-2 and IL-15 signals on the generation of LTe and LTm CD8+ during an LCMV Armstrong infection in mice. In this same experimental model, we also studied the effect of a deficiency in IL-2, IL-15 and IL-21 signals on the development of LTe and LTm CD8+. Our results show that these three cytokines cooperate to support the expansion and differentiation of LTe CD8+. More accurately, IL-2, IL-15 and IL-21 are essential for the homeostasis of a particular LTe CD8+ subset : Short- Lived Effector Cells (SLECs). We also demonstrated that all three cytokines are required to generate a maximal number of LTm CD8+. In addition, differentiation and maintenance of the memory effector population (TEM) are substantially reduced in the combined absence of IL-2, IL-15 and IL-21 signals. These results are the first to our knowledge to highlight redundant and synergistic functions of three "C-dependent cytokines as promoters of the development and maintenance of LTe and LTm CD8+.

Le but de cette thèse est la compréhension de pourquoi certains complexes de ruthénium sont soit pasluminescents soit avec un temps de vie très courte de l’état excité. Des calculs de type théorie de lafonctionnelle de la densité (DFT) ou DFT dépendante du temps (TD-DFT) étaient effectués pour cinqcomplexes existants et aussi pour un complexe hypothétique. Selon la théorie de champs de ligand (LFT),la plus proche sont les énergies des états de type transfert de charge métal-ligand (MLCT) à un état de typemétal centré (MC), alors le plus facile est-ce à peupler l’état MC ainsi menant à une dèsexcitation nonradiative de l’état MLCT. Les calculs DFT/TD-DFT s’avéraient suffisants pour reproduire les géométrieset spectres d’absorption expérimentales. Ceci, ensemble avec la technique de densité d’états partielle,permettaient une validation de l’idée fondamentale issue du modèle LFT en confrontant les résultats denos calculs avec les temps de vie mesurés. / Density-functional theory (DFT) and time-dependent DFT (TD-DFT) were carried out for 5 rutheniumcomplexes and one hypothetical one. The goal was to understand the lack of luminescence or very shortexcited state lifetimes at room temperature in some of them. According to ligand-field theory (LFT), thecloser the energies of the metal-to-ligand charge transfer (MLCT ) and the metal-centred (MC) states,the easier it is to populate the MC state, leading to radiationless disactivation of the luminescent MLCT.DFT/TD-DFT calculations proved adequate in reproducing experimental geometries and absorption spectra.Verification of LFT explanation was done by use of partial density of states whose results agreedreasonably well with the usual hypothesis.

Des modèles spécifiques de gravitation quantique suggèrent l’existence d’une Violation de l’Invariance de Lorentz (LIV en anglais) à l’échelle de Planck. Une des signatures de cette violation est la modification de la propagation des photons dans le vide, induisant des décalages temporels dépendant de l’énergie des photons observés sur Terre. De tels décalages dans le temps d’arrivée de rayons γ sont recherchés avec l’expérience H.E.S.S. (High Energy Stereoscopic System), grâce aux émissions de très hautes énergies en provenance de sources lointaines telles que les blazars. Néanmoins, l’origine du décalage temporel doit être comprise en détails. En effet, un décalage intrinsèque à la source pourrait venir biaiser les contraintes sur les modèles de gravitation quantique. Cette thèse propose dans un premier temps de s’intéresser à la modélisation temporelle des éruptions de blazars, pour étudier les possibles décalages intrinsèques liés aux processus d’émissions de ces éruptions. Grâce à l’élaboration d’un modèle simple, cette étude met en relief les différentes caractéristiques de ces décalages intrinsèques sur les scénarios d’éruptions de blazar afin d’essayer de les distinguer des décalages potentiellement dus à un effet de LIV et aussi de proposer de nouvelles contraintes basées sur ces décalages temporels. Dans un deuxième temps, la méthode de recherche de décalages temporels dépendant de l’énergie avec H.E.S.S. est présentée ainsi qu’une application sur l’éruption du blazar Markarian 501 ayant eu lieu en juillet 2014. Cette analyse a permis d’établir la meilleure limite obtenue sur le terme quadratique de la signature de la LIV avec l’utilisation d’éruption de blazars. / Specific models of quantum gravity suggest the existence of a Lorentz Invariance Violation (LIV) at the Planck scale. One signature of that violation is a modification the propagation of photons in vacuum which induces energy dependent delays in the arrival time of photons on Earth. The H.E.S.S. (High Energy Stereoscopic System) experiment can search for such delays in the arrival time of gamma rays, thanks to the very high energy emission coming from distant blazars. However, the time delay origin have to be fully understood. Indeed, an intrinsic time delay coming from the source can bias the constraints made on quantum gravity models. In the first part of this thesis, a time dependent blazar flare model is considered to search for the presence of intrinsic time delays related to the emission mechanisms of flares. With the elaboration of a simple scenario, this study highlights the different characteristics of intrinsic time delays in order to investigate how to disentangle them from delays due to LIV as well as to provide new constraints on blazar modeling. In the second part of this thesis, the method used to search for LIV signatures in blazar light curves at very high energy is presented as well as an application to the flare of Markarian 501 which occurred in July 2014. This analysis provides in particular the best upper limit on the quadratic term of LIV signature.