Ce travail de thèse est une contribution à la compréhension de l’encrassement des échangeurs de chaleur à plaques (ECP) lors du traitement thermique de solutions de protéines du lactosérum. Ce travail vise principalement à établir les liens existants entre la composition des différentes solutions de lactosérum (teneurs en β-lactoglobuline (β-lg) et en calcium), leurs comportements en dénaturation et leurs aptitudes à encrasser les surfaces chaudes de l’ECP. Cette étude a montré l’influence de la teneur en calcium et du ratio molaire calcium/protéine sur les mécanismes de dénaturation thermique de la β-lg, les distributions des masses de dépôt protéique, la dynamique de formation de dépôt et la structure des premières couches de dépôt en surface. Par ailleurs, la détermination des constantes cinétiques de dénaturation chaude de la β-lg et la connaissance de l’histoire thermique du produit ont permis de simuler les profils de concentrations des différentes espèces de β-lg (native, dépliée et agrégée) le long de l’ECP et d’étudier la corrélation entre la masse de dépôt sec et les quantités de β-lg dénaturées dans l’ECP. Ainsi, cette simulation a pu mettre en évidence le faible rôle des agrégats dans les mécanismes d’encrassement et à la fois l’influence de l’espèce dépliée et de la teneur en calcium dans la distribution du dépôt protéique. Enfin, une corrélation originale entre la distribution de la masse de dépôt sec dans chaque canal de l’ECP et les paramètres cinétiques de dénaturation a été établie pour chaque solution protéique modèle étudiée, montrant ainsi l’impérieuse nécessité des approches de génie de la réaction chimique pour prédire l’encrassement protéique. / This Ph.D. work is a contribution for understanding the fouling in plate heat exchangers (PHE) during the heat treatment of whey protein solutions. This work aims at establishing the relationship between the composition of the different whey protein solutions (β-lactoglobulin content (β-lg) and calcium), their denaturation behaviour and their ability to foul the hot surfaces of the PHE.This study showed the strong impact of the calcium content and the calcium/protein molar ratio on the β-lg thermal denaturation mechanisms, the distributions of the deposit fouling, deposit formation dynamics and the structure of the first deposit layers.The determination of the β-lg denaturation kinetic constants and the knowledge of the thermal profile allowed to simulate the concentration profiles of the different β-lg species (native, unfolded and aggregated) along the PHE and to study the correlation between the dry deposit mass of and the amount of denatured β-lg in the PHE. This simulation highlighted the negligible role of the aggregates in the fouling mechanisms and both the influence of the unfolded species and the calcium content on the distribution of protein deposition. Finally, a new correlation between the distribution of dry deposit masses in each channel of the PHE and the denaturation kinetic parameters was determined for each studied protein solution, showing thus that chemical reaction engineering approaches are requested for predicting proteinaceous fouling.

Nous avons étudié le couplage dépliement-transport de la Maltose Binding Protein (MBP ou MalE), une protéine périplasmique d'E. Coli et d'un mutant instable, le MalE219, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant, le chlorure de guanidium (GdnHCl) à l'échelle de la molécule unique. La technique utilisée est basée sur la détection électrique du transport de macromolécules à travers un nanopore protéique (l'Aérolysine d'Aeromonas Hydrophila) inséré dans une bicouche lipidique plane. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une précédente étude réalisée à travers un autre nanopore protéique, l'alpha-hémolysine du Staphylocoque doré, de géométrie et de charge nette différente. Nous avons montré l'existence de temps courts et longs de blocage du courant associés à des protéines dépliées ou partiellement repliées. La fréquence des blocages du courant permet d'obtenir la fraction de protéine dépliée passant à travers le pore en fonction de la concentration en GdnHCl. Les courbes de dénaturation obtenues avec les deux pores montrent un comportement sigmoïdale très similaire. Le type de pore n'influence donc pas la dénaturation des protéines, mais uniquement leur dynamique de transport. En revanche, la courbe de dénaturation du mutant instable présente un déplacement vers les concentrations plus faibles en GdnHCl. Il a été montré également que la présence du maltose comme ligand sur le MalE219 stabilise nettement sa structure. Pour La MBP, les temps de blocages longs diminuent avec l'augmentation de la concentration de GdnHCl montrant une dynamique de transition vitreuse . Cette technique est appropriée à l'étude du dépliement et des changements de conformation de protéines, mais ne permet pas d'obtenir des informations structurales sur les états intermédiaires de repliement. Ainsi, la spectroscopie RMN a été utilisée pour tenter de caractériser ces états intermédiaires de repliement, notamment par la méthode d'échange proton-deutérium. Elle consiste à suivre les cinétiques d'échange des résidus de la protéine sur des spectres 2D 1H-15N HSQC à différentes concentrations de GdnHCl.Ainsi 180 résidus sur les 370 que compte la MBP ont été suivis lors de la dénaturation en présence de GdnHCl. Les deux hélices en C-terminal sont très accessibles au solvant et se dénaturent facilement. La MBP est composée de deux domaines globulaires, le domaine N-ter et le domaine C-ter. Les éléments de structures secondaires situés dans la zone intermédiaire entre les deux domaines (principalement des brins β) sont particulièrement affectés par l'agent dénaturant. D'autres structures secondaires dans les domaines globulaires sont très protégées et plutôt stables. Il est donc proposé que les protéines partiellement dépliées s'insèrent dans le pore par l'extrémité C-terminal et que des parties de structuration tertiaire restent stable entraînant le blocage du pore. / We study the unfolding-transport mechanism of the Maltose Binding Protein (MBP or MalE), a periplasm protein of E. Coli and a destabilised variant, the MalE219, as the function of the concentration of denaturing agent, Guanidine Hydrochloride(GdnHCl) at the single molecule level. The technique is based on the electrical detection of the macromolecule transport through a nanometer-scale channel, Aerolysin channel, inserted into a planar lipid bilayer. Results obtained were compared to previous data with another channel, the alpha-Hemolysin. Both channels have different geometry and net charge.We show that we can distinguish unfolded states from partially folded ones with aerolysin pore.Unfolded proteins induce short current blockades, their duration is constant as a function of the concentration of denaturing agent. Partially folded proteins exhibit long blockades whose life times decrease as the concentration of GdnHCl increase, this indicates a possible glassy dynamics.The frequency of the short current blockades increases as the concentration of denaturing agent increases, following a sigmoidal denaturation curve.The unfolding curve of native MBP with Aerolysin pore is similar to the one previously measured with Hemolysin channel. The denaturation curve of the destabilized variant obtained with Aerolysin is shifted towards lower value of GdnHCl concentration in agreement with bulk measurements. We show also that the addition of maltose stabilizes the structure of MalE219. This nanopore recording technique is also suitable for the study of unfolding and conformation changes of proteins.In order to obtain structural informations that nanopore recording cannot provides, the structure of MBP along its denaturation curve was studied by NMR spectroscopy. The Hydrogen-exchange method known to be sensitive to folding intermediates was specially used. It consists in tracking hydrogen-deuterium exchange rates for amino on the 2D 1H-15N HSQC spectra.Thus, 180 residus of 370 for MBP was followed during denaturation in the presence of GdnHCl. The two last helices in C-terminal of MBP are accessible to the solvent and are denaturated easily. MBP is a two domains protein, N-ter domain and C-ter domain. It was found out that the C- and D-domain of MBP (mainly alpha-helices) could be relatively stable in presence of denaturing agent and that beta strands which make the link between the two domains would be affected by the denaturing agent. It was proposed that partially unfolded proteins enter the pore by the C-terminal end and that stable tertiary structure still present block the pore.

Les protéines sont des molécules flexibles, qui accomplissent une variété de tâches cellulaires à travers des mouvements mécaniques et des changements conformationnels encodés dans leur structure tridimensionnelle. Parmi les approches théoriques qui contribuent à une meilleure compréhension de la relation entre structure, mécanique, dynamique et fonction des protéines, les modèles gros-grains sont un outil très puissant. Ils permettent d’intégrer des informations structurales et dynamiques à un coût computationnel réduit, car le traitement explicite des degrés de liberté moins importants est supprimé. Dans le cadre de cette thèse, des études comparatives rapides de la flexibilité et de la mécanique des protéines ont été menées en se servant du simple modèle gros-grains de Réseau Élastique. La dépendance des résultats de la conformation de départ, ainsi que une liberté dynamique de la chaine principale plutôt limitée, imposée par l’approximation harmonique, nous ont motivé à développer une nouvelle approche, permettant une exploration plus extensive de l’espace conformationnel. Les efforts ont conduit à PaLaCe, modèle gros-grains qui permet des changements majeurs de la structure secondaire, tout en gardant la spécificité de la séquence des acides aminés grâce à une représentation à basse résolution. En utilisant PaLaCe nous avons simulé deux processus impliquant la plasticité protéique: le dépliement du domaine I27 de la protéine musculaire titine et la dynamique à l’équilibre autour de la structure native de deux enzymes homologues adaptées à des températures différentes. Les résultats obtenus concordent avec les données expérimentales et les résultats issus de modèles tout-atom déjà publiés. PaLaCe s’avère donc être un modèle fiable, avec des temps de calcul restreints par rapport aux modèles tout-atome, tout en conservant un bon niveau de détail. Il offre ainsi la possibilité d’effectuer une recherche systématique sur les liens entre mécanique, dynamique et fonction des protéines / Proteins are flexible molecules, which accomplish a variety of cellular tasks through mechanical motions and conformational fluctuations encoded in their three-dimensional structure. Amongst the theoretical approaches contributing to a better understanding of the relationship between protein structure, mechanics, dynamics and function, coarse-grain models are a powerful tool. They can be used to integrate structural and dynamic information over broad time and size scales at a low computational cost, achieved by averaging out the less important degrees of freedom. In this work, fast comparative studies of protein flexibility and mechanics have been performed with the simple coarse-grain Elastic Network Model. However, the dependency of the results on the starting conformation, and the rather constrained backbone dynamics imposed by the harmonic approximation, motivated the development of a new approach, for a more extensive exploration of conformational space. These efforts led to the PaLaCe model, designed to allow significant changes in secondary structure, while maintaining residue specificity despite a lower-level resolution. Using PaLaCe, we were able to reproduce two processes involving protein plasticity: the mechanical unfolding of the I27 domain of the giant muscle protein titin and the near-native dynamics of two homologous enzymes adapted to work at different temperatures. Agreement with experimental data and results from published atomistic models demonstrate that PaLaCe is a reliable, sufficiently accurate, but computationally inexpensive approach. It therefore opens the doors for a systematic investigation of the link between protein dynamics/mechanics and function

Les modèles déformables fournissent un cadre flexible pour traiter divers problèmes de reconstruction de forme en traitement d'images. Ils ont été proposés initialement pour la segmentation d'images, mais ils se sont aussi révélés adaptés dans de nombreux autres contextes en vision par ordinateur et en imagerie médicale, notamment le suivi de régions, la stéréovision, le "shape from shading" et la reconstruction à partir d'un nuage de points. Les éléments clés de cette méthodologie sont l'élaboration d'une fonctionnelle d'énergie, le choix d'une procédure de minimisation et d'une représentation géométrique. Dans cette thèse, nous abordons ces trois éléments, avec pour but d'élargir le champ d'application des modèles déformables et d'accroître leur performance. En ce qui concerne la représentation géométrique, nous venons à bout de la perte de la correspondance ponctuelle et de l'impossibilité de contrôler les changements de topologie avec la méthode des ensembles de niveau. Nous proposons deux applications associées dans le domaine de l'imagerie médicale: la génération de représentations dépliées du cortex cérébral avec préservation de l'aire, et la segmentation de plusieurs tissus de la tête à partir d'images par résonance magnétique anatomiques. En ce qui concerne la procédure de minimisation, nous montrons que la robustesse aux minima locaux peut être améliorée en remplaçant une descente de gradient traditionnelle par un flot de minimisation spatialement cohérent. Enfin, en ce qui concerne l'élaboration de la fonctionnelle d'énergie, nous proposons une nouvelle modélisation de la stéréovision multi-caméras et de l'estimation du mouvement tridimensionnel non-rigide, fondée sur un critère de mise en correspondance global et basé image.

Ce travail de thèse ce concentre sur l’étude des protéines par l’usage de haute pression. Les articles présentés ici sont précéder d’une introduction présentant les différents modèles physiques utilisés pour décrire le repliement des protéines, une introduction posant les bases de la thermodynamique, ainsi que l’origine de la stabilité thermodynamique des protéines dans leur état plies. Il y a trois sujets principaux aborder dans ce mémoire. Le premier est l’étude de la coopérativité du repliement et du paysage de repliement de la protéine à répétition PP32 (Anp32a) a travers l’utilisation de la pression a différentes températures. La seconde étude concerne l’investigation de l’origine de l’expansivité thermique des protéines pliées grâce à l’utilisation de RMN haute pression et de la protéine très bien caractérisée Staphylococcal Nuclease (SNase) et de certaine de ses mutantes. Finalement, un dernier article sur la stabilité sous pression de la variant TC5b de la mini protéine model tryptophan-cage grâce une combinaison de RMN et de simulations moléculaires tout-atomes en « replica exchange ». / This thesis work focuses on the study of protein though the use of high pressure. There are three main points subject that are being inquired here. The first is the study of cooperativity and folding landscape of a repeat protein (Anp32a) though the use high pressure denaturation at different temperatures. The second concerns the investigation of the determinant of thermal expansivity in the folded state of protein using high pressure NMR, and the well characterized Staphylococcal Nuclease (SNase) and some of its mutants. Finally, a last article on the pressure stability of the model mini protein Tryptophan cage variant Tc5b by a combination of high pressure NMR and full atomic replica exchange simulations.

L’albumine sérique humaine (HSA) est une protéine connue pour ses propriétés de transport exceptionnelles et son contenu élevé en ponts disulfure. L’étude de sa dynamique conformationnelle représente un défi important dans la compréhension de ses fonctions physiologiques. Le but de notre travail a été d’étudier cette dynamique conformationnelle et de comprendre le rôle des ponts disulfure dans le maintien de la structure native de la protéine. Notre analyse est basée sur des simulations de dynamique moléculaire couplées à des analyses par composantes principales. Outre la validation de la méthode de simulation les résultats fournissent de nouveaux éclairages sur les principaux effets de la réduction des ponts disulfure dans les albumines sériques. Les processus de dépliement/repliement protéique ont été détaillés. La prédiction de la structure réduite d’équilibre a également fait l’objet d’une attention particulière. Une étude détaillée de la dynamique conformationnelle globale de la protéine ainsi que celle des deux sites principaux de complexation a été effectuée. D’éventuels effets allostériques entre ces deux sites ont été recherchés. Les résultats théoriques obtenus ont été discutés avec les données expérimentales disponibles / Human serum albumin (HSA) is a protein known for its exceptional transport properties and its high content of disulfide bridges. The study of the conformational dynamics represents a major challenge in the comprehension of its physiological functions. The aim of our work was to study the conformational dynamics and to understand the roleof disulfide bonds in the stability of the native protein structure. Our analysis is based on simulations of molecular dynamics coupled with principal component analysis. Beyond the validation of the simulation method, the results provide new insights on the main effects of the disulfide bonds reduction in serum albumins. Protein unfolding/refolding processes were detailed. A special attention is paid to the prediction of the reduced structure at the equilibrium. A detailed study of the global protein conformational dynamics as well as the two main binding sites were performed. Possible allosteric effects between these two sites were researched. The theoretical results have been discussed with the available experimental data