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The CHR site: definition and genome-wide identification of a cell cycle transcriptional element

Müller, Gerd A., Wintsche, Axel, Stangner, Konstanze, Prohaska, Sonja J., Stadler, Peter F., Engeland, Kurt January 2014 (has links)
The cell cycle genes homology region (CHR) has been identified as a DNA element with an important role in transcriptional regulation of late cell cycle genes. It has been shown that such genes are controlled by DREAM, MMB and FOXM1-MuvB and that these protein complexes can contact DNA via CHR sites. However, it has not been elucidated which sequence variations of the canonical CHR are functional and how frequent CHR-based regulation is utilized in mammalian genomes. Here, we define the spectrum of functional CHR elements. As the basis for a computational meta-analysis, we identify new CHR sequences and compile phylogenetic motif conservation as well as genome-wide protein-DNA binding and gene expression data. We identify CHR elements in most late cell cycle genes binding DREAM, MMB, or FOXM1-MuvB. In contrast, Myb- and forkhead-binding sites are underrepresented in both early and late cell cycle genes. Our findings support a general mechanism: sequential binding of DREAM, MMB and FOXM1-MuvB complexes to late cell cycle genes requires CHR elements. Taken together, we define the group of CHR-regulated genes in mammalian genomes and provide evidence that the CHR is the central promoter element in transcriptional regulation of late cell cycle genes by DREAM, MMB and FOXM1-MuvB.
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Human Adaptation in the Light of Ancient and Modern Genomes

Key, Felix-Michael 22 April 2016 (has links)
Modern humans originated in Africa around 200,000 years ago and today have settled in nearly every corner of earth. During migrations humans became exposed to new pathogens, food sources and have encountered vastly different environments. Natural selection likely contributed to the survival under such diverse conditions by promoting the raise in frequency of advantageous alleles. Thereby natural selection leaves genetic footprints that we can identify. The thesis at hand is about understanding how natural selection has shaped different human populations by analyzing these genetic footprints. In the first study, I infer the evolutionary history of an insertion-substitution variant using present-day human genomic data. This variant is interesting because the ancestral allele encodes a previously unannotated open-reading frame for a gene with antiviral ac- tivity (IFNL4 ), while the derived allele truncates this open-reading frame and is strongly associated with improved clearance of Hepatitis C, a major health care problem. Using an approximate bayesian computation approach I infer a complex evolutionary history, where the derived, truncating allele evolved under weak positive selection in Africa, with selection strength increasing in non-African populations, especially in East Asian popu- lations where the truncating allele is nearly fixed today. Hence, the changes in selection and resulting population differences in allele frequency contribute to the variation in Hep- atitis C clearance observed across human populations today. In the second study, I use ancient human genomes to estimate genome-wide allele frequencies in the past to understand present-day population differentiation. I develop a new statistic and incorporate the genome of Ust’-Ishim, a modern human that lived 45,000 year ago in Siberia, to study to what extent natural selection and drift have contributed to human population differentiation. The results suggest that European populations carry high frequency alleles in protein-coding (genic) regions that evolved under strong, recent positive selection. Further, the genic alleles that rose in frequency recently in Europeans were already present in ancient hunter-gatherers more often than in ancient farmers. This suggests that during the colonization of Europe local, positive selection changed the frequency of advantageous alleles in hunter-gatherer populations prior to the influx of farming individuals and those alleles remained beneficial also in the later admixed populations.
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The evolutionary history of the mammalian synaptonemal complex / Die Evolutionsgeschichte des Synaptonemalkomplexes der Maus

Fraune, Johanna January 2014 (has links) (PDF)
Der Synaptonemalkomplex (SC) ist eine hochkonservierte Proteinstruktur. Er weist eine dreiteili-ge, leiterähnliche Organisation auf und ist für die stabile Paarung der homologen Chromosomen während der Prophase der ersten meiotischen Teilung verantwortlich, die auch als Synpase be-zeichnet wird. Fehler während der Synpase führen zu Aneuploidie oder Apoptose der sich entwi-ckelnden Keimzellen. Seit 1956 ist der SC Gegenstand intensiver Forschung. Seine Existenz wurde in zahlreichen Orga-nismen von der Hefe bis zum Menschen beschrieben. Seine Struktur aus zwei parallel verlaufen-den Lateralelementen (LE), die durch eine Vielzahl von sogenannten Transversalfilamenten (TF) verbunden werden und dem Zentralen Element (CE) in der Mitte des SC ist dabei offensichtlich über die Millionen von Jahren der Evolution erhalten geblieben. Einzelne Proteinkomponenten des SC wurden jedoch nur in wenigen Modelorganismen charakterisiert, darunter Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans und Mus mus-culus. Unerwarteter Weise gelang es bei dieser Charakterisierung nicht, eine evolutionäre Ver-wandtschaft, d.h. eine Homologie zwischen den Proteinsequenzen der verschiedenen SCs nach-zuweisen. Diese Tatsache sprach gegen die grundsätzliche Annahme, dass der SC in der Evolution nur einmal entstanden sei. Diese Arbeit hat sich nun der Aufgabe gewidmet, die Diskrepanz zwischen der hochkonservierten Struktur des SC und seiner augenscheinlich nicht-homologen Proteinzusammensetzung zu lösen. Dabei beschränkt sie sich auf die Analyse des Tierreichs. Es ist die erste Studie zur Evolution des SC in Metazoa und demonstriert die Monophylie der Säuger SC Proteinkomponenten im Tierreich. Die Arbeit zeigt, dass mindestens vier von sieben SC Proteinen der Maus spätestens im letzten gemeinsamen Vorfahren der Gewebetiere (Eumetazoa) enstanden sind und auch damals Teil ei-nes ursprünglichen SC waren, wie er heute in dem Nesseltier Hydra zu finden ist. Dieser SC weist die typische Struktur auf und besitzt bereits alle notwendigen Komponenten, um die drei Domä-nen – LE, TF und CE – zu assemblieren. Darüber hinaus ergaben die einzelnen Phylogenien der verschiedenen SC Proteine der Maus, dass der SC eine sehr dynamische Evolutionsgeschichte durchlaufen hat. Zusätzliche Proteine wurden während der Entstehung der Bilateria und der Wir-beltiere in den SC integriert, während andere ursprüngliche Komponenten möglicherweise Gen-Duplikationen erfuhren bzw. besonders in der Linie der Häutungstiere verloren gingen oder sich stark veränderten. Es wird die These aufgestellt, dass die auf den ersten Blick nicht-homologen SC Proteine der Fruchtfliege und des Fadenwurms tatsächlich doch von den ursprünglichen Prote-inenkomponenten abstammen, sich aber aufgrund der rasanten Evolution der Arthropoden und der Nematoden bis zu deren Unkenntlichkeit diversifizierten. Zusätzlich stellt die Arbeit Hydra als alternatives wirbelloses Modellsystem für die Meiose- und SC-Forschung zu den üblichen Modellen D. melanogaster und C. elegans vor. Die kürzlich gewon-nenen Erkenntnisse über den Hydra SC sowie der Einsatz der Standard-Methoden in diesem Orga-nismus werden in dem abschließenden Kapitel zusammengefasst und diskutiert. / The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells. Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction. This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda. The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section.
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Analyse genetischer Stabilität in den Nachkommen bestrahlter Zellen mittels klassischer Chromosomenbänderung und verschiedener Hochdurchsatz-Techniken / Analysis of genetic stability in the clonal descendants of irradiated cells using conventional chromosome banding and various high-throughput methods

Flunkert, Julia January 2018 (has links) (PDF)
Ionisierende Strahlung (IR) ist in der medizinischen Diagnostik und in der Tumortherapie von zentraler Bedeutung, kann aber Genominstabilität und Krebs auslösen. Strahleninduzierte Genominstabilität (RIGI) ist in den klonalen Nachkommen bestrahlter Zellen zu beobachten, die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unverstanden. Zur Erforschung von verzögerten Strahleneffekten wurden primäre embryonale Fibroblastenkulturen mit 2 Gray bestrahlt und für 20 Populationsverdopplungen klonal expandiert. Zellen, die keiner Strahlung ausgesetzt waren, dienten als Kontrolle für normale Alterungsprozesse. Die Klone wurden durch klassische Chromosomenbänderungstechniken analysiert und in Abhängigkeit der Stabilität ihres Genoms in Gruppen eingeteilt. Ein Klon wurde als stabil gewertet, wenn die analysierten Metaphasen keinerlei Auffälligkeiten zeigten, während instabile Klone ein Mosaik aus normalen und abnormalen Metaphasen waren. Die Zellen von zwei Spendern wurden untersucht, um interindividuelle Strahleneffekte zu beurteilen. Nach Bestrahlung hatten mehr als die Hälfte der Klone Metaphasen mit strukturellen Aberrationen und wurden dementsprechend als instabil eingestuft. Drei Klone zeigten zudem numerische Aberrationen, die ausschließlich das Y Chromosom betrafen. Fluoreszenz in situ Hybridisierungen verifizierten diese Beobachtung in weiteren Klonen und deuteten an, dass der Verlust des Y Chromosoms mit RIGI assoziiert ist. Molekulare Karyotypisierungen mit SNP Arrays ergaben, dass IR in den Klonen Veränderungen der Kopienzahl auslöst. Ein Unterschied zwischen chromosomal stabilen und instabilen Klonen konnte jedoch nicht detektiert werden. Chromosomale Regionen, in denen sich bekanntermaßen fragile Stellen befinden, zeigten eine Anhäufung von CNVs. Ein RIGI Effekt konnte für die fragile Stelle 3B, in der sich das Gen FHIT befindet, identifiziert werden. Exom Sequenzierungen von Klonen und der entsprechenden Massenkultur zeigten eine alterungsassoziierte Entstehung von Varianten. Der Effekt wurde durch die Einwirkung von Strahlung erhöht. Auf Ebene von einzelnen Nukleotiden konnten ebenfalls Anhäufungen von Schäden in bestimmten genomischen Bereichen detektiert werden, dieser Effekt ging ohne die typischen RIGI Endpunkte einher. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass strahlenbedingte Veränderungen auf verschiedenen Ebenen (Chromosomen, Genkopienzahl und einzelnen Nukleotiden) beobachtet werden können, welche, unabhängig von RIGI, die Tumorentstehung begünstigen. Speziell Veränderungen im FRA3B Lokus und der Verlust des Y Chromosoms scheinen jedoch über die Destabilisierung des Genoms zur Krebsentstehung beizutragen. / Ionizing radiation is important in medical diagnosis and cancer treatment but can lead to genomic instability and secondary malignancies as a late effect. Radiation induced genomic instability (RIGI) can be observed in the progeny of irradiated cells but the underlying cellular processes remain to be elucidated. To study delayed genetic radiation effects, single cell fibroblast clones from two different male donors were established after a single X ray dose of 2 Gray. Non irradiated cells were used as controls to account for aging related effects. Clones were characterized using chromosome banding analysis. Stable clones were endowed with no karyotype abnormalities in all analysed metaphases after 20 Population doublings, whereas unstable clones showed both normal and abnormal metaphases. Two fibroblast strains were used to detect differences in radiation sensitivity. More than half of the irradiated clones were chromosomally abnormal and thus classified as unstable. Both banding analysis and fluorescence in situ hybridization revealed an increased rate of Y chromosome loss in irradiated clones which might be associated with RIGI. Using SNP Arrays, an increased rate of de novo copy number variations (CNVs) was detected in the progeny of irradiated cells when compared to non irradiated controls. However, a significant difference between chromosomally stable and unstable clones was not found. CNVs clustered in chromosomal regions that are associated with known fragile sites. The fragile site 3B, which encompasses the gene FHIT, was found to be affected by CNVs in unstable clones suggesting a RIGI related effect. Exome sequencing of clones and the respective primary cultures revealed an increased rate of variants during in vitro aging. This effect was further increased by radiation exposure. Analysis of single nucleotides showed a RIGI independent accumulation of damage in specific regions. The results of the present study show that radiation induced changes can manifest as chromosomal abnormalities, copy number variations and DNA sequence mutations promoting tumorigenesis independent from RIGI. However, changes in FRA3B and loss of Y chromosome might trigger cancer through destabilizing the genome.
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Costly signaling with mobile devices: An evolutionary psychological perspective on smartphones / Mobilgeräte als kostspielige Signale: Smartphones aus einer evolutionspsychologischen Perspektive

Hennighausen, Anna Christine January 2016 (has links) (PDF)
In the last decade, mobile device ownership has largely increased. In particular, smartphone ownership is constantly rising (A. Smith, 2015; Statista, 2016a), and there is a real hype for luxury brand smartphones (Griffin, 2015). These observations raise the question of which functions smartphones serve in addition to their original purposes of making and receiving calls, searching for information, and organizing. Beyond these obvious functions, studies suggest that smartphones express fashion, lifestyle, and one’s economic status (e.g., Bødker et al., 2009; Statista, 2016b; Vanden Abeele, Antheunis, & Schouten, 2014). Specifically, individuals seem to purchase and use conspicuous luxury brand smartphones to display and enhance status (D. Kim et al., 2014; Müller-Lietzkow et al., 2014; Suki, 2013). But how does owning a conspicuous, high-status smartphone contribute to status, and which benefits may these status boosts provide to their owners? From an evolutionary perspective, status carries a lot of advantages, particularly for males; high status grants them priority access to resources and correlates with their mating success (van Vugt & Tybur, 2016). In this sense, research suggests that men conspicuously display their cell phones to attract mates and to distinguish themselves from rivals (Lycett & Dunbar, 2000). In a similar vein, evolutionarily informed studies on conspicuous consumption indicate that the purchase and display of conspicuous luxuries (including mobile phones and smartphones) relate to a man’s interest in uncommitted sexual relationships and enhance his desirability as a short-term mate (Hennighausen & Schwab, 2014; Saad, 2013; Sundie et al., 2011). Drawing on these findings, this doctoral dissertation investigated how a man is perceived given that he is an owner of a high-status (vs. nonconspicuous, low-status) smartphone as a romantic partner and male rival. This was done in three experiments. In addition, it was examined how male conspicuous consumption of smartphones interacted with further traits that signal a man’s mate quality, namely facial attractiveness (Studies 1 and 2) and social dominance (Study 3). Study 1 revealed that men and women perceived a male owner of a conspicuous smartphone as a less desirable long-term mate and as more inclined toward short-term mating. Study 2 replicated these results and showed that men and women assigned traits that are associated with short-term mating (e.g., low loyalty, interest in flirts, availability of tangible resources) to a male owner of a conspicuous smartphone and perceived him as a stronger male rival and mate poacher, and less as a friend. The results of Study 2 further suggested that specifically more attractive men might benefit from owning a conspicuous smartphone in a short-term mating context and might be hence considered as stronger male rivals. Study 3 partially replicated the findings of Studies 1 and 2 pertaining to the effects of owning a conspicuous smartphone. Study 3 did not show different effects of conspicuous consumption of smartphones on perceptions of a man dependent on the level of his social dominance. To conclude, the findings of this doctoral dissertation suggest that owning a conspicuous, high-status smartphone might not only serve proximate functions (e.g., making and receiving calls, organization) but also ultimate functions, which relate to mating and reproduction. The results indicate that owning a conspicuous smartphone might yield benefits for men in a short-term rather than in a long-term mating context. Furthermore, more attractive men appear to benefit more from owning a conspicuous smartphone than less attractive men. These findings provide further insights into the motivations that underlie men’s purchases and displays of conspicuous, high-status smartphones from luxury brands that reach beyond the proximate causes frequently described in media and consumer psychological research. By applying an evolutionary perspective, this doctoral dissertation demonstrates the power and utility of this research paradigm for media psychological research and shows how combining a proximate and ultimate perspective adds to a more profound understanding of smartphone phenomena. / In den letzten 10 Jahren ist die Zahl der Personen, die ein Mobilgerät besitzen, stark angestiegen. Insbesondere nimmt die Anzahl der Smartphone-Besitzer stetig zu (A. Smith, 2015; Statista, 2016a). Es ist nahezu ein regelrechter „Smartphone-Hype“ zu beobachten, der sich vor allem um bestimmte Geräte von Luxus-Marken dreht (Griffin, 2015). Diese Beobachtungen lassen die Frage aufkommen, welche Funktionen Smartphones haben, die über ihre eigentlichen Funktionen, wie z.B. Anrufe empfangen und tätigen, Informationssuche und Organisation hinausgehen. Studien zeigen, dass Smartphones zusätzlich zu diesen naheliegenden Funktionen auch Ausdruck von Mode, Lifestyle und Status sein können (z.B. Bødker et al., 2009; Statista, 2016b; Vanden Abeele et al., 2014). Dies scheint besonders auf auffällige Smartphones von Luxus-Marken zu zutreffen: Personen kaufen und nutzen diese Geräte, um ihren sozialen Status zu zeigen und zu steigern (D. Kim et al., 2014; Müller-Lietzkow et al., 2014; Suki, 2013). Wie jedoch kann der Besitz eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones den eigenen Status erhöhen und welche Vorteile bringt dies mit sich? Aus einer evolutionären Perspektive hat Status viele Vorteile, vor allem für Männer. Ein hoher Status gewährt exklusiven Zugang zu Ressourcen und korreliert mit männlichem Paarungserfolg (van Vugt & Tybur, 2016). So zeigen Studien, dass Männer ihre Mobiltelefone auffallend häufig zeigen, um damit ihren finanziellen und sozialen Status zu demonstrieren, mit dem Ziel potenzielle Partnerinnen auf sich aufmerksam zu machen und sich von Konkurrenten abzuheben (Lycett & Dunbar, 2000). Ähnliches legen auch Studien aus dem Bereich der evolutionären Konsumenten-psychologie nahe: Der Kauf und die Zurschaustellung von auffälligen Luxus-Produkten (inkl. Handys und Smartphones) scheint mit dem Interesse eines Mannes an einer kurzfristigen sexuellen Beziehung in Zusammenhang zu stehen und seinen Partnerwert insbesondere in diesem Kontext zu steigern (Hennighausen & Schwab, 2014; Saad, 2013; Sundie et al., 2011). Aufbauend auf diesen Befunden untersuchte die vorliegende Dissertation in drei experimentellen Studien, wie Männer und Frauen einen Mann, der als Besitzer eines ein auffälligen, statusträchtigen (vs. unauffälligen, wenig mit Status assoziierten) Smartphones präsentiert wurde, als potenziellen Partner und gleichgeschlechtlichen Konkurrenten wahrnahmen. Darüber hinaus wurde untersucht, wie männlicher Geltungskonsum von Smartphones mit zwei weiteren Faktoren, die den Partnerwert eines Mannes signalisieren, interagiert. Dazu wurden zusätzlich die Gesichtsattraktivität (Studie 1 und 2) sowie die soziale Dominanz (Studie 3) des Smartphone-Besitzers manipuliert. Studie 1 zeigte, dass Männer und Frauen den Besitzer eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones als einen schlechteren Partner für eine feste Beziehung einschätzten und ihn als interessierter an unverbindlichen sexuellen Beziehungen wahrnahmen im Vergleich zu einem Mann, der als Besitzer eines unauffälligeren, nur wenig mit Status assoziierten Smartphones gezeigt wurde. Studie 2 replizierte diese Befunde und zeigte zudem, dass Männer und Frauen dem Besitzer eines auffälligen Smartphones eher Eigenschaften zuschrieben, die mit einer Kurzzeitpartnerschaft assoziiert sind (z.B. geringe Treue, erhöhte Flirtbereitschaft, schnelle Verfügbarkeit von Ressourcen). Darüber hinaus wurde der Besitzer eines auffälligen Smartphones als ein stärkerer Rivale, als eine größere Bedrohung für eine bestehende Beziehung sowie als ein schlechterer Freund wahrgenommen. Diese Effekte zeigten sich insbesondere dann, wenn der Besitzer des auffälligen Smartphones auch attraktiv war. In Studie 3 konnten die Effekte, die der Besitz eines auffälligen Smartphones auf die Einschätzung eines Mannes als romantischen Partner und gleichgeschlechtlichen Konkurrenten hat, zum Teil repliziert werden. In Studie 3 traten diese Effekte jedoch unabhängig von der sozialen Dominanz des Mannes auf. Insgesamt lassen die Ergebnisse dieser Dissertation vermuten, dass der Besitz eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones einer Luxusmarke nicht nur proximate Funktionen (wie z.B. Anrufe empfangen und tätigen, Organisation), sondern auch ultimate Funktionen erfüllen könnte, die sich auf Paarung und Fortpflanzung erstreckt. Die Ergebnisse deuten an, dass Männer vom Besitz eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones einer Luxusmarke eher im Kontext einer kurzen, unverbindlichen Beziehung als im Kontext einer festen Partnerschaft profitieren könnten. Darüber hinaus scheinen v.a. attraktivere Männer vom Besitz eines auffälligen Smartphones zu profitieren. Diese Befunde tragen zu einem besseren Verständnis bei, weshalb Männer auffällige, status-trächtige Smartphones von Luxusmarken kaufen und diese zur Schau stellen. Dabei gehen die in dieser Dissertation erlangten Befunde über bisherige Erkenntnisse der Medien- und Konsumentenpsychologie hinaus, welche vorranging proximate Ursachen für den Kauf und die Nutzung von Smartphones diskutiert haben. Durch die Anwendung einer evolutionären Perspektive veranschaulicht die vorliegende Arbeit die Leistung und den Nutzens dieses Forschungsparadigmas für medienpsychologische Forschung und zeigt auf, wie die Synthese einer proximaten und ultimaten Perspektive zu einem umfassenderen Verständnis des Phänomens Smartphone führt.
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The role of a fungal-specific transcription regulator on vacuolar biology and host interaction in \(Candida\) \(albicans\) / Die Rolle eines pilzspezifischen Transkriptionsfaktors für die Vakuole und Wirtsinteraktion von \(Candida\) \(albicans\)

Reuter-Weissenberger, Philipp January 2022 (has links) (PDF)
Microorganisms that colonize the human body face large fluctuations in their surroundings. Therefore, those microbes developed sophisticated mechanisms that allow them to adapt their cell biology and maintain cellular homeostasis. One organelle vital to preserve cell physiology is the vacuole. The vacuole exhibits a wide range of functions and is able to adjust itself in response to both external and internal stimuli. Moreover, it plays an important role in host interaction and virulence in fungi such as Candida albicans. Despite this connection, only a few regulatory proteins have been described to modulate vacuolar biology in fungal pathogens. Furthermore, whether such regulation alters fungus-host interplay remains largely unknown. This thesis focuses on the characterization of ZCF8, a fungus-specific transcription regulator in the human-associated yeast C. albicans. To this end, I combined genome-wide protein-DNA interaction assays and gene expression analysis that identified genes regulated by Zcf8p. Fluorescence microscopy uncovered that several top targets of Zcf8p localize to the fungal vacuole. Moreover, deletion and overexpression of ZCF8 resulted in alterations in vacuolar morphology and in luminal pH and rendered the fungus resistant or susceptible to a vacuole-disturbing drug. Finally, in vitro adherence assays showed that Zcf8p modulates the attachment of C. albicans to human epithelial cells in a vacuole-dependent manner. Given those findings, I posit that the previously uncharacterized transcription regulator Zcf8p modulates fungal attachment to epithelial cells in a manner that depends on the status of the fungal vacuole. Furthermore, the results highlight that vacuolar physiology is a substantial factor influencing the physical interaction between Candida cells and mammalian mucosal surfaces. / Mikroorganismen, die den Menschen besiedeln, sind großen Schwankungen in ihrer Umgebung ausgesetzt. Daher haben sie ausgeklügelte Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen, ihre Zellbiologie anzupassen und die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Eine für die Aufrechterhaltung der Zellphysiologie wichtige Organelle ist die Vakuole. Sie verfügt über ein breites Spektrum an Funktionen und ist in der Lage, auf externe und interne Stimuli zu reagieren. Außerdem spielt dieses Organell eine wichtige Rolle bei der Pilz-Wirt-Interaktion und somit für die Pathogenität von Pilzen wie Candida albicans. Trotz dieses Zusammenhangs wurden bisher nur wenige regulatorische Proteine beschrieben, welche die Biologie der Vakuolen in pathogenen Pilzen modulieren. Zudem ist weitgehend unbekannt, ob eine solche Regulierung das Zusammenspiel von Pilz und Wirt verändert. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung von ZCF8, einem pilzspezifischen Transkriptionsregulator in der pathogenen Hefe C. albicans. Zu diesem Zweck wurden Protein-DNA-Interaktionstests und Genexpressionsanalysen kombiniert, um Gene zu identifizieren, die direkt von Zcf8p reguliert werden. Fluoreszenzmikroskopie zeigte zudem, dass mehrere der wichtigsten Ziele von Zcf8p in der Pilzvakuole lokalisiert sind. Darüber hinaus führte die Deletion und Überexpression von ZCF8 zu Veränderungen der Morphologie und des luminalen pH-Werts der Vakuole, und veränderte die Sensitivität des Pilzes gegenüber Stoffen, welche Funktionen der Vakuole beeinträchtigen. Schließlich deuteten In-vitro-Adhärenztests daraufhin, dass Zcf8p die Anheftung von C. albicans an menschliche Epithelzellen auf eine Weise moduliert, die abhängig von der Vakuole ist. Angesichts dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass der bisher unbekannte Transkriptionsregulator ZCF8 die Interaktion zwischen Pilz- und Epithelzellen des Wirts kontrolliert, und das auf eine Weise, die von der Pilzvakuole abhängig ist. Des Weiteren, unterstreichen die Ergebnisse, dass die Physiologie der Vakuole ein wesentlicher Faktor ist, welcher die Interaktion zwischen C. albicans und dem Wirt beeinflusst.
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Optimierung und Objektivierung der DNA-Biegewinkelmessung zur Untersuchung der initialen Schadenserkennung von Glykosylasen im Rahmen der Basen-Exzisions-Reparatur / Optimisation and standardisation of DNA bend angle measurements as application of automated DNA bend angle measurements to initial damage detection of base excision repair glycosylases

Mehringer, Christian Felix January 2021 (has links) (PDF)
Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte anknüpfend an die Ergebnisse aus vo-rangegangenen Untersuchungen der AG Tessmer, das von Büchner et al. [1] vorgestellte Modell zur DNA-Schadenserkennung, welches im Speziellen auf Daten zu den Glykosylasen hTDG und hOGG1 basierte, auf seine Allgemein-gültigkeit für DNA-Glykosylasen untersucht werden. Das Modell beschreibt den Prozess der Schadenserkennung als eine notwendige Übereinstimmung der passiven Biegung am Schadensort mit dem aktiven BiegungswinkeI der scha-densspezifischen Glykosylase. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit war zudem die Etablierung einer automatisierten Messsoftware zur objektiven Biegewinkelmessung an DNA-Strängen in rasterkraftmikroskopischen Aufnah-men. Dies wurde mit verschiedenen Bildverarbeitungsprogrammen sowie einer in MATLAB implementierten Messsoftware erreicht und das Programm zudem auf die Biegewinkelmessung von proteininduzierten Biegewinkeln erweitert. Zur Anwendung kam die Methode der automatisierten Biegewinkelmessung sowohl an rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen der Glykosylase MutY gebunden an ungeschädigter DNA als auch an Aufnahmen von DNA mit und ohne Basen-schaden. Neben oxoG:A und G:A, den spezifischen MutY-Zielschäden, wurden auch andere Basenschäden wie beispielsweise oxoG:C und ethenoA:T vermes-sen und zudem die von der Glykosylase MutY an ungeschädigter DNA induzier-te Biegung mit den Biegewinkeln der jeweiligen Zielschäden verglichen. Die Übereinstimmung in den Konformationen der Zielschäden und der Reparatur-komplexe auch für die Glykosylase MutY (wie bereits für hTDG und hOGG1 in oben genannter Arbeit gezeigt) erlauben ein verbessertes Verständnis der Schadenssuche und -erkennung durch DNA-Glykosylasen, indem sie die All-gemeingültigkeit einer Biegungsenergie-basierten initialen Schadenserkennung durch DNA-Glykosylasen unterstützen. Die etablierte Messsoftware kann zu-künftig an weiteren DNA-Schäden und den entsprechenden Protein-DNA-Komplexen ihre Anwendung finden und kann somit durch die effektive Gewin-nung objektiver Daten in großer Menge zur Stützung des Modells beitragen. / The focus of this thesis was to test the general applicability of a model for initial lesion detection by base excision repair (BER) glycosylases. This thesis built on previous results from the Tessmer laboratory on the human base excision re-pair (BER) glycosylases hTDG and hOGG1 (Büchner et al. [1]). Based on this work, a model for initial lesion detection by glycosylases had been proposed that describes the process of damage recognition as a necessary match of the passive bending at the point of damage with the active bending by the damage-specific glycosylase. An essential component of this work was also the estab-lishment of an automated measurement software for objective bend angle measurements on DNA strands in atomic force microscopy (AFM) images. This was achieved with various image processing programs and a custom written MATLAB software. In addition, the procedure was extended to the measure-ment of DNA bend angles in protein-DNA complexes. In particular, the automa-ted bend angle analsyis was applied to AFM images of the glycosylase MutY bound to non-specific DNA and MutY target lesions (oxoG:A and G:A), as well as other DNA damages (oxoG:C and ethenoA:T). In the analyses, DNA bending induced by MutY in undamaged DNA was measured and compared to bending at the respective target damage. Similarities in the conformations of target da-mage and repair complexes also for this additional glycosylase (as already shown for hTDG and hOGG1 in above mentioned work) allow an improved un-derstanding of DNA glycosylase damage search and recognition by supporting the general validity of bending energy-based initial damage detection by DNA glycosylases. In addition, the established measurement software can also be used to measure DNA bending by other protein systems in an unbiased manner and on a high-throughput scale. The software thus contributes to the effective acquisition of objective data.
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SLC6A2-regulierende microRNAs bei Angsterkrankungen: Genexpressions- und Assoziationsuntersuchungen / SLC6A2-regulating microRNAs in anxiety disorders: Genexpression and association studies

Lang, Konstantin January 2021 (has links) (PDF)
Angsterkrankungen sind häufige Krankheitsbilder mit bislang nicht vollständig geklärter multifaktorieller Ätiologie. Neben Umwelt- und psychosozialen Faktoren zeigen Studien eine signifikante familiäre Häufung und lassen eine genetische Komponente mit einer Heritabilität in einem Bereich von 30-60 % vermuten. Da hierbei am ehesten von einem komplexen Zusammenspiel verschiedenster Gene mit unterschiedlicher Relevanz auszugehen ist, stellen miRNAs eine bedeutende Größe dar, da sie es vermögen auf transkriptioneller Ebene Einfluss auf die Regulierung einer Vielzahl von Genen zu nehmen. Verschiedene Aspekte liefern Hinweise darauf, dass eine Neurotransmitterdysregulation eine wichtige Komponente in der Pathogenese von Angsterkrankungen einnimmt – insbesondere veränderte noradrenerge Signalwege sind hierbei entscheidend beteiligt. Dies macht den Noradrenalin-Transporter bzw. SLC6A2 zu einem interessanten Kandidatengen, und stellt die Bezugsgröße der angestellten Untersuchungen in dieser Arbeit dar. miRNAs, welche die SLC6A2-Expression modulieren, können somit Einfluss auf zentrale Verarbeitungswege von Angst nehmen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden potentielle miRNA-Regulatoren von SLC6A2 in silico ermittelt und in einem weiteren Schritt in vitro überprüft. Zehn der miRNAs (hsa-miR-378g, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-4781-5p, hsa-miR664b-3p, hsa-miR-4715-3p, hsa-miR-579-3p, hsa-miR-3921, hsa-miR-3622b-5p, hsa-miR-4773, hsa-miR-532-3p) zeigten hierbei eine relevante Abnahme der Luciferase-Aktivität als Hinweis auf ihre funktionelle Relevanz und stellen damit die Basis der nachfolgenden Untersuchungen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Einzelbasenpolymorphismen im Bereich der zuvor ermittelten miRNA-Gene sowie eines SNP innerhalb der 3’-UTR von SLC6A2 mittels Fall-Kontroll-Studie in einer Population von Patienten mit Panikstörung und entsprechenden Kontrollen untersucht. Eine nominelle Assoziation ließ sich für das (minor) T-Allel von rs2910931 (stromaufwärts von MIR579) (p-allel = 0,004) sowie das (major) A-Allel von rs2582372 (p-allel = 0,023) feststellen. In Einklang hiermit ließ sich weiterhin für rs2910931 eine signifikante Assoziation zwischen der Anzahl der (minor) T-Allele und dem ASI-Wert (β = 0,371, p = 0,029, 95 %-CI 0,039-0,702) sowie dem ACQ-Wert (β = 0,012, p = 0,041, 95 %-CI 0,000-0,023) ermitteln. Somit zeigt sich eine Einflussnahme der genetischen Variante um MIR579 auf die Feinmodulation der Noradrenalin-Homöostase als möglichem ätiopathogenetischen Faktor von Angsterkrankungen. / Anxiety disorders are common conditions with a multifactorial etiology that has not yet been fully understood. In addition to environmental and psychosocial factors, studies show a significant familial clustering and suggest a genetic component with a heritability in the range of 30-60%. Since a complex interaction of various genes with different relevance can be assumed, miRNAs are an important factor, since they are able to influence the regulation of a large number of genes at the transcriptional level. Various aspects provide evidence that neurotransmitter dysregulation is an important component in the pathogenesis of anxiety disorders - in particular, altered noradrenergic signaling pathways are crucially involved. This makes the norepinephrine transporter, or SLC6A2, an interesting candidate gene, and represents the reference parameter for the studies conducted in this work. miRNAs that modulate SLC6A2 expression can thus influence central processing pathways of anxiety. In the first part of the present work, potential miRNA regulators of SLC6A2 were identified in silico and, in a further step, tested in vitro. Ten of the miRNAs (hsa-miR-378g, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-4781-5p, hsa-miR664b-3p, hsa-miR-4715-3p, hsa-miR-579-3p, hsa-miR-3921, hsa-miR-3622b-5p, hsa-miR-4773, hsa-miR-532-3p) here showed a relevant decrease in luciferase activity as an indication of their functional relevance and thus form the basis of subsequent studies. In the second part of the work, single base polymorphisms in the region of the previously identified miRNA genes as well as a SNP within the 3'-UTR of SLC6A2 were investigated by case-control study in a population of patients with panic disorder and corresponding controls. A nominal association could be detected for the (minor) T allele of rs2910931 (upstream of MIR579) (pallel = 0.004) as well as the (major) A allele of rs2582372 (pallel = 0.023). Consistent with this, a significant association between the number of (minor) T alleles and the ASI value (β = 0.371, p = 0.029, 95%-CI 0.039-0.702) as well as the ACQ value (β = 0.012, p = 0.041, 95%-CI 0.000-0.023) could further be determined for rs2910931. Thus, an influence of the genetic variant around MIR579 on the fine modulation of noradrenaline homeostasis as a possible etiopathogenetic factor of anxiety disorders is revealed.
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Involvement of neuronal nitric oxide synthase (NOS-I) PDZ interactions in neuropsychiatric disorders / Der Einfluss von PDZ Interaktionen der neuronalen Stickstoffmonoxidsynthase (NOS-I) auf neuropsychiatrische Störungen

Candemir, Esin January 2018 (has links) (PDF)
Neuronal nitric oxide (NO) synthase (NOS-I) and its adaptor protein (NOS1AP) have been repeatedly and consistently associated with neuropsychiatric disorders in several genetic association and linkage studies, as well as functional studies. NOS-I has an extended PDZ domain which enables it to interact with postsynaptic density protein 95 (PSD-95) bringing NOS-I in close proximity to NMDA receptors. This interaction allows NMDA receptor activity dependent calcium-influx to activate NOS-I, linking NO synthesis to regulation of glutamatergic signaling pathways. NOS1AP is a PDZ-domain ligand of NOS-I and has been proposed to compete with PSD-95 for NOS-I interaction. Studies performed on post-mortem brain tissues have shown increased expression of NOS1AP in patients with schizophrenia and bipolar disorder, suggesting that increased NOS-I/NOS1AP interactions might be involved in neuropsychiatric disorders possibly through disruption of NOS-I PDZ interactions. Therefore, I have investigated the involvement of NOS-I in different endophenotypes of neuropsychiatric disorders by targeting its specific PDZ interactions in vitro and in vivo. To this end, I used recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors expressing NOS1AP isoforms/domains (NOS1AP-L: full length NOS1AP; NOS1AP-LC20: the last 20 amino acids of NOS1AP-L, containing the PDZ interaction motif suggested to stabilize interaction with NOS-I; NOS1AP-LΔC20: NOS1AP-L lacking the last 20 amino acids; NOS1AP-S: the short isoform of NOS1AP), residues 396-503 of NOS1AP-L (NOS1AP396-503) encoding the full NOS-I interaction domain, and N-terminal 133 amino acids of NOS-I (NOS-I1-133) encoding for the extended PDZ-domain. Neuropsychiatric disorders involve morphological brain changes including altered dendritic development and spine plasticity. Hence, I have examined dendritic morphology in primary cultured hippocampal and cortical neurons upon overexpression of constructed rAAV vectors. Sholl analysis revealed that overexpression of NOS1AP-L and NOS1AP-LΔC20 mildly reduced dendritic length/branching. Moreover, overexpression of all NOS1AP isoforms/domains resulted in highly altered spine plasticity including significant reduction in the number of mature spines and increased growth of filopodia. These findings suggest that NOS1AP affects dendritic growth and development of dendritic spines, which may involve both, increased NOS-I/NOS1AP interaction as well as interaction of NOS1AP with proteins other than NOS-I. Interestingly, the observed alterations in dendritic morphology were reminiscent of those observed in post-mortem brains of patients with neuropsychiatric disorders. Given the dendritic alterations in vitro, I have examined, whether disruption of NOS-I PDZ interaction would also result in behavioral deficits associated with neuropsychiatric disorders. To this end, rAAV vectors expressing NOS1AP-L, NOS1AP396-503, NOS-I1-133, and mCherry were stereotaxically delivered to the dorsal hippocampus of 6-week-old male C57Bl/6J mice. One week after surgery, mice were randomly separated into two groups. One of those groups underwent three weeks of chronic mild stress (CMS). Afterwards all mice were subjected to a comprehensive behavioral analysis. The findings revealed that overexpression of the constructs did not result in phenotypes related to anxiety or depression, though CMS had an anxiolytic effect independent of the injected construct. Mice overexpressing NOS-I1-133, previously shown to disrupt NOS-I/PSD-95 interaction, showed impaired spatial memory, sensorimotor gating, social interaction, and increased locomotor activity. NOS1AP overexpressing mice showed mild impairments in sensorimotor gating and spatial working memory and severely impaired social interaction. NOS1AP396-503 overexpressing mice also showed impaired social interaction but enhanced sensorimotor gating and reduced locomotor activity. Taken together, these behavioral findings indicate an involvement of NOS-I PDZ interactions in phenotypes associated with positive symptoms and cognitive deficits of psychotic disorders. In summary, this study revealed an important contribution of NOS-I protein interactions in the development of endophenotypic traits of neuropsychiatric disorders, in particular schizophrenia, at morphological and behavioral levels. These findings might eventually aid to a better understanding of NOS-I-dependent psychopathogenesis, and to develop pharmacologically relevant treatment strategies. / Die neuronal Stickstoffmonoxid(NO)synthase (NOS-I) und deren Adapterprotein (NOS1AP) wurden in mehreren Genassoziations- und Genkopplungsstudien, sowie funktionellen Studien, wiederholt und konsistent mit neuropsychiatrischen Störungen assoziiert. NOS-I trägt eine erweiterte PDZ Domäne, die eine Interaktion mit postsynaptic density protein 95 (PSD-95) ermöglicht und es in die Nähe von NMDA Rezeptoren bringt. Diese Interaktion erlaubt es NMDA Rezeptoraktivitätsabhängigen Kalziumeinstrom NOS-I zu aktivieren, was die Synthese von NO an die Regulierung glutamaterger Signalwege koppelt. NOS1AP ist ein Ligand der NOS-I PDZ Domäne und NOS1AP kompetiert mit PSD-95 um die Bindung mit NOS-I. Post mortem Untersuchungen zeigten eine erhöhte Expression von NOS1AP im Gehirn von Patienten mit Schizophrenie und bipolarer Störung, was eine erhöhte NOS-I/NOS1AP Interaktion (was möglicherweise zu gestörter NOS-I PDZ Interaktion führt) mit neuropsychiatrischen Störungen verbindet. Daher habe ich den Einfluss von NOS-I auf Endophänotypen neuropsychiatrischer Störungen untersucht, indem ich spezifische PDZ Interaktionen von NOS-I in vitro und in vivo gestört habe. Dazu verwendete ich rekombinante Adenoassozierte virale (rAAV) Vektoren, die NOS1AP Isoformen/Domänen (NOS1AP-L: Volllänge NOS1AP; NOS1AP-LC20: Die letzten 20 Aminosäuren von NOS1AP-L, welche das PDZ Interaktionsmotiv enthalten, das zur Stabilisierung der Interaktion mit NOS-I beiträgt; NOS1AP-LΔC20: NOS1AP-L dessen letzte 20 Aminosäuren fehlen; NOS1AP-S: die Kurzform von NOS1AP), Aminosäurereste 396-503 von NOS1AP-L (NOS1AP396-503), welche die volle NOS-I Interaktionsdomäne kodieren, und die N-terminalen 133 Aminosäuren von NOS-I (NOS-I1-133), welche die erweiterte PDZ Domäne enthalten. Bei neuropsychiatrischen Störungen kommt es zu morphologischen Änderungen des Gehirns, einschließlich veränderter dendritischer Entwicklung und Plastizität dendritischer Dornfortsätze (‚spines‘). Daher habe ich die dendritische Morphologie in primär kultivierten Hippokampal- und Kortikalneuronen nach Überexpression der konstruierten rAAV Vektoren untersucht. Eine Sholl Analyse ergab dabei, dass die Überexpression von NOS1AP-L und NOS1AP-LΔC20 die Länge und Anzahl dendritscher Verzweigungen leicht reduzierte. Zudem führte die Überexpression aller NOS1AP Isoformen/Domänen zu einer stark veränderten Plastizität dendritischer ‚spines‘, einschließlich einer signifikanten Reduktion der Anzahl ausgereifter ‚spines‘ und einem erhöhten Wachstum von Filopodien. Diese Ergebnisse zeigen, dass NOS1AP einen Einfluss auf das dendritische Wachstum und die Entwicklung dendritischer ‚spines‘ hat, dem sowohl eine erhöhte NOS-I/NOS1AP Interaktion, sowie Interaktionen von NOS1AP mit anderen Proteinen zugrunde liegen könnten. Interessanterweise, ähnelten die beobachteten Veränderungen solchen, die in post mortem Gehirnen von Patienten mit neuropsychiatrischen Störungen beobachtet wurden. Aufgrund der Beobachtungen in vitro, habe ich untersucht, ob eine Störung der NOS-I PDZ Interaktion auch zu Verhaltensdefiziten, die mit neuropsychiatrischen Störungen assoziiert sind, führt. Zu diesem Zweck, wurden rAAV Vektoren, die NOS1AP-L, NOS1AP396-503, NOS-I1-133,und mCherry exprimieren, stereotaxisch in den dorsalen Hippokampus von sechs Wochen alten männlichen C57Bl/6J Mäusen injiziert. Eine Woche nach der Operation wurden die Mäuse zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine dieser Gruppen wurde für drei Wochen dem ‚chronic mild stress‘(CMS) Paradigma unterzogen. Im Anschluss daran wurden alle Mäuse einer umfassenden Verhaltensanalyse unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression der Konstrukte nicht zu Angst- oder Depressionsassoziierten Phänotypen führten. Jedoch hatte das CMS Paradigma einen anxiolytischen Effekt, der unabhängig vom injizierten Konstrukt war. Eine Überexpression des NOS-I1-133 Konstruktes, von welchem zuvor eine Störung der NOS-I/PSD-95 Interaktion nachgewiesen wurde, führte zu Störungen des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses, der Reaktionsunterdrückung (‚sensorimotor gating‘) und der sozialen Interaktion, sowie zu erhöhter lokomotorischer Aktivität. NOS1AP überexprimierende Mäuse zeigten leichte Störungen in der Reaktionsunterdrückung und des räumlichen Kurzzeitgedächtnisses, sowie erheblich gestörte soziale Interaktionen. NOS1AP396-503 überexprimierende Mäuse zeigten ebenfalls gestörte soziale Interaktion, jedoch eine erhöhte Reaktionsunterdrückung und verminderte lokomotorische Aktivität. Zusammengenommen, deuten diese Verhaltensuntersuchungen auf einen Beitrag der NOS-I PDZ Interaktionen zu Phänotypen, die mit positiven Symptomen und kognitiven Defiziten bei Psychosen assoziiert sind, hin. Zusammengefasst konnte diese Studie einen wichtigen Beitrag der NOS-I Proteininteraktionen bei der Entstehung endophenotypischer Züge (morphologisch sowie im Verhalten) neuropsychiatrischer Störungen, insbesondere der Schizophrenie, aufzeigen. Diese Erkenntnisse könnten zu einem besseren Verständnis NOS-I abhängiger Psychopathogenese, sowie zur Entwicklung relevanter pharmakologischer Behandlungsstrategien führen.
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Genomics of pathogenic and commensal \(Escherichia\) \(coli\) / Genomik pathogener und kommensaler \(Escherichia\) \(coli\)

Leimbach, Andreas January 2017 (has links) (PDF)
High-throughput sequencing (HTS) has revolutionized bacterial genomics. Its unparalleled sensitivity has opened the door to analyzing bacterial evolution and population genomics, dispersion of mobile genetic elements (MGEs), and within-host adaptation of pathogens, such as Escherichia coli. One of the defining characteristics of intestinal pathogenic E. coli (IPEC) pathotypes is a specific repertoire of virulence factors (VFs). Many of these IPEC VFs are used as typing markers in public health laboratories to monitor outbreaks and guide treatment options. Instead, extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) isolates are genotypically diverse and harbor a varied set of VFs -- the majority of which also function as fitness factors (FFs) for gastrointestinal colonization. The aim of this thesis was the genomic characterization of pathogenic and commensal E. coli with respect to their virulence- and antibiotic resistance-associated gene content as well as phylogenetic background. In order to conduct the comparative analyses, I created a database of E. coli VFs, ecoli_VF_collection, with a focus on ExPEC virulence-associated proteins (Leimbach, 2016b). Furthermore, I wrote a suite of scripts and pipelines, bac-genomics-scripts, that are useful for bacterial genomics (Leimbach, 2016a). This compilation includes tools for assembly and annotation as well as comparative genomics analyses, like multi-locus sequence typing (MLST), assignment of Clusters of Orthologous Groups (COG) categories, searching for protein homologs, detection of genomic regions of difference (RODs), and calculating pan-genome-wide association statistics. Using these tools we were able to determine the prevalence of 18 autotransporters (ATs) in a large, phylogenetically heterogeneous strain panel and demonstrate that many AT proteins are not associated with E. coli pathotypes. According to multivariate analyses and statistics the distribution of AT variants is instead significantly dependent on phylogenetic lineages. As a consequence, ATs are not suitable to serve as pathotype markers (Zude et al., 2014). During the German Shiga toxin-producing E. coli (STEC) outbreak in 2011, the largest to date, we were one of the teams capable of analyzing the genomic features of two isolates. Based on MLST and detection of orthologous proteins to known E. coli reference genomes the close phylogenetic relationship and overall genome similarity to enteroaggregative E. coli (EAEC) 55989 was revealed. In particular, we identified VFs of both STEC and EAEC pathotypes, most importantly the prophage-encoded Shiga toxin (Stx) and the pAA-type plasmid harboring aggregative adherence fimbriae. As a result, we could show that the epidemic was caused by an unusual hybrid pathotype of the O104:H4 serotype. Moreover, we detected the basis of the antibiotic multi-resistant phenotype on an extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) plasmid through comparisons to reference plasmids. With this information we proposed an evolutionary horizontal gene transfer (HGT) model for the possible emergence of the pathogen (Brzuszkiewicz et al., 2011). Similarly to ExPEC, E. coli isolates of bovine mastitis are genotypically and phenotypically highly diverse and many studies struggled to determine a positive association of putative VFs. Instead the general E. coli pathogen-associated molecular pattern (PAMP), lipopolysaccharide (LPS), is implicated as a deciding factor for intramammary inflammation. Nevertheless, a mammary pathogenic E. coli (MPEC) pathotype was proposed presumably encompassing strains more adapted to elicit bovine mastitis with virulence traits differentiating them from commensals. We sequenced eight E. coli isolates from udder serous exudate and six fecal commensals (Leimbach et al., 2016). Two mastitis isolate genomes were closed to a finished-grade quality (Leimbach et al., 2015). The genomic sequence of mastitis-associated E. coli (MAEC) strain 1303 was used to elucidate the biosynthesis gene cluster of its O70 LPS O-antigen. We analyzed the phylogenetic genealogy of our strain panel plus eleven bovine-associated E. coli reference strains and found that commensal or MAEC could not be unambiguously allocated to specific phylogroups within a core genome tree of reference E. coli. A thorough gene content analysis could not identify functional convergence of either commensal or MAEC, instead both have only very few gene families enriched in either pathotype. Most importantly, gene content and ecoli_VF_collection analyses showed that no virulence determinants are significantly associated with MAEC in comparison to bovine fecal commensals, disproving the MPEC hypothesis. The genetic repertoire of bovine-associated E. coli, again, is dominated by phylogenetic background. This is also mostly the case for large virulence-associated E. coli gene cluster previously associated with mastitis. Correspondingly, MAEC are facultative and opportunistic pathogens recruited from the bovine commensal gastrointestinal microbiota (Leimbach et al., 2017). Thus, E. coli mastitis should be prevented rather than treated, as antibiotics and vaccines have not proven effective. Although traditional E. coli pathotypes serve a purpose for diagnostics and treatment, it is clear that the current typing system is an oversimplification of E. coli's genomic plasticity. Whole genome sequencing (WGS) revealed many nuances of pathogenic E. coli, including emerging hybrid or heteropathogenic pathotypes. Diagnostic and public health microbiology need to embrace the future by implementing HTS techniques to target patient care and infection control more efficiently. / Eines der definierenden Charakteristika intestinal pathogener E. coli (IPEC) Pathotypen ist ein spezifisches Repertoire an Virulenzfaktoren (VFs). Viele dieser IPEC VFs werden als Typisierungsmarker benutzt. Stattdessen sind Isolate extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) genotypisch vielfältig und beherbergen verschiedenartige VF Sets, welche in der Mehrheit auch als Fitnessfaktoren (FFs) für die gastrointestinale Kolonialisierung fungieren. Das Ziel dieser Dissertation war die genomische Charakterisierung pathogener und kommensaler E. coli in Bezug auf ihren Virulenz- und Antibiotikaresistenz-assoziierten Gengehalt sowie ihre phylogenetische Abstammung. Als Voraussetzung für die vergleichenden Analysen erstellte ich eine E. coli VF-Datenbank, ecoli_VF_collection, mit Fokus auf Virulenz-assoziierte Proteine von ExPEC (Leimbach, 2016b). Darüber hinaus programmierte ich mehrere Skripte und Pipelines zur Anwendung in der bakteriellen Genomik, bac-genomics-scripts (Leimbach, 2016a). Diese Sammlung beinhaltet Tools zur Unterstützung von Assemblierung und Annotation sowie komparativer Genomanalysen, wie Multilokus-Sequenztypisierung (MLST), Zuweisung von Clusters of Orthologous Groups (COG) Kategorien, Suche nach homologen Proteinen, Identifizierung von genomisch unterschiedlichen Regionen (RODs) und Berechnung Pan-genomweiter Assoziationsstatistiken. Mithilfe dieser Tools konnten wir die Prävalenz von 18 Autotransportern (ATs) in einer großen, phylogenetisch heterogenen Stammsammlung bestimmen und nachweisen, dass viele AT-Proteine nicht mit E. coli Pathotypen assoziiert sind. Multivariate Analysen und Statistik legten offen, dass die Verteilung von AT-Varianten vielmehr signifikant von phylogenetischen Abstammungslinien abhängt. Deshalb sind ATs nicht als Marker für Pathotypen geeignet (Zude et al., 2014). Während des bislang größten Ausbruchs von Shiga-Toxin-produzierenden E. coli (STEC) im Jahre 2011 in Deutschland waren wir eines der Teams, welches die genomischen Eigenschaften zweier Isolate analysieren konnte. Basierend auf MLST und Detektion orthologer Proteine zu bekannten E. coli Referenzgenomen konnte ihre enge phylogenetische Verwandschaft und Ähnlichkeit des gesamten Genoms zum enteroaggregativen E. coli (EAEC) 55989 aufgedeckt werden. Im Detail identifizierten wir VFs von STEC und EAEC Pathotypen, vor allem das Prophagen-kodierte Shiga-Toxin (Stx) und ein Plasmid des pAA-Typs kodierend für aggregative Adhärenz-Fimbrien. Die Epidemie wurde demnach durch einen ungewöhnlichen Hybrid-Pathotyp vom O104:H4 Serotyp verursacht. Zusätzlich identifizierten wir die Grundlage für den multiresistenten Phänotyp dieser Ausbruchsstämme auf einem Extended-Spektrum-beta-Laktamase (ESBL) Plasmid über Vergleiche mit Referenzplasmiden. Mit diesen Informationen konnten wir ein horizontales Gentransfer-Modell (HGT) zum Auftreten dieses Pathogenen vorschlagen (Brzuszkiewicz et al., 2011). Ähnlich zu ExPEC sind E. coli Isolate boviner Mastitiden genotypisch und phänotypisch sehr divers, und viele Studien scheiterten am Versuch eine positive Assoziation vermeintlicher VFs nachzuweisen. Stattdessen gilt Lipopolysaccharid (LPS) als entscheidender Faktor zur intramammären Entzündung. Gleichwohl wurde ein mammärer pathogener E. coli (MPEC) Pathotyp vorgeschlagen, der mutmaßlich Stämme umfasst, welche eher geeignet sind eine bovine Mastitis auszulösen und über Virulenz-Merkmale von Kommensalen abgegrenzt werden können. Wir sequenzierten acht E. coli Isolate aus serösem Eutersekret und sechs fäkale Kommensale (Leimbach et al., 2016). Bei zwei Mastitisisolaten wurden die Genome vollständig geschlossen (Leimbach et al., 2015). Anhand der genomischen Sequenz des Mastitis-assoziierten E. coli (MAEC) Stamms 1303 wurde das Gencluster zur Biosynthese seines O70 LPS O-Antigens aufgeklärt. Wir analysierten die phylogenetische Abstammung unserer Stammsammlung plus elf bovin-assoziierter E. coli Referenzstämme, aber konnten weder MAEC noch Kommensale bestimmten Phylogruppen innerhalb eines Core-Genom Stammbaums aus Referenz-E. coli eindeutig zuordnen. Eine ausführliche Gengehalt-Analyse konnte keine funktionelle Konvergenz innerhalb von Kommensalen oder MAEC identifizieren. Stattdessen besitzen beide nur sehr wenige Genfamilien, die bevorzugt in einer der beiden Pathotypen vorkommen. Weder eine Gengehalt- noch eine ecoli_VF_collection-Analyse konnte zeigen, dass eine signifikante Assoziation von bestimmten Virulenzfaktoren mit MAEC, im Vergleich zu bovinen fäkalen Kommensalen, besteht. Damit wurde die MPEC Hypothese widerlegt. Auch das genetische Repertoire von Rinder-assoziierten E. coli wird durch die phylogenetische Abstammung bestimmt. Dies ist überwiegend auch bei großen Virulenz-assoziierten Genclustern der Fall, die bisher mit Mastitis in Verbindung gebracht wurden. Dementsprechend sind MAEC fakultative und opportunistische Pathogene, die ihren Ursprung als Kommensale in der bovinen gastrointestinalen Mikrobiota haben (Leimbach et al., 2017). Obwohl traditionelle E. coli Pathotypen in der Diagnostik und Behandlung einen Zweck erfüllen, ist es offensichtlich, dass das derzeitige Typisierungs-System die genomische Plastizität von E. coli zu sehr vereinfacht. Die Gesamtgenom-Sequenzierung (WGS) deckte viele Nuancen pathogener E. coli auf, einschließlich entstehender hybrider oder heteropathogener Pathotypen. Diagnostische und medizinische Mikrobiologie müssen einen Schritt in Richtung Zukunft gehen und HTS-Technologien anwenden, um Patientenversorgung und Infektionskontrolle effizienter zu unterstützen.

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