A asma é uma doença crônica inflamatória das vias aéreas, de importância mundial pela sua elevada prevalência, com considerável impacto na qualidade de vida dos pacientes. Dentre os diferentes fenótipos de asma, a asma alérgica constitui a maioria dos casos. Dentre os diferentes desencadeantes de exacerbações na asma, os aeroalérgenos têm papel de destaque, sendo os ácaros o grupo mais importante e prevalente. Entre os ácaros, os mais relevantes para estudo são o Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) e a Blomia tropicalis (Blo t), com importância significativa nos países tropicais. Pacientes podem ser sensibilizados a esses dois ácaros ou a um deles somente, mas a positividade do teste in vivo ou in vitro não significa reatividade clínica e que haja concordância com o alérgeno relevante para o desencadeamento dos sintomas. A reatividade cruzada entre esses dois ácaros vem sendo estudada. In vivo, há poucos trabalhos demonstrando a reatividade cruzada entre Der p e Blo t e analisando a correlação entre os testes cutâneos e os de provocação brônquica. O objetivo desse estudo é avaliar a reatividade clínica em pacientes com asma sensibilizados a ambos os ácaros, Der p e Blo t. Para isso, pacientes com asma do Ambulatório do Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do HC-FMUSP foram selecionados. Broncoprovocações específicas foram realizadas com os dois ácaros, em diferentes momentos. Dezoito pacientes com asma foram selecionados, e trinta e seis provocações foram realizadas. Todas as provocações com o ácaro Der p foram positivas. Em relação à Blo t, o resultado foi positivo em 93% dos testes. No presente estudo, houve concordância na maioria dos casos entre a presença de sensibilização aos ácaros estudados e a positividade na boncoprovocação. Portanto, as sensibilizações aos ácaros identificados no teste cutâneo são relevantes para o desencadeamento dos sintomas de asma nesses pacientes / Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways of global importance due to its high prevalence, with considerable impact on quality of life of patients. Among the different phenotypes of asthma, allergic asthma constitutes the majority of cases. Among the different triggers of asthma exacerbations, aeroallergens have the leading role, being mites group more important and prevalent. Among the mites, the most relevant to the study are Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) and Blomia tropicalis (Blo t), with significant importance in tropical countries. Patients can be sensitive to these two mites or only one of them, but the positivity of test in vivo or in vitro clinical reactivity and does not mean that there is agreement with the relevant allergen for the triggering of symptoms. The cross-reactivity between these two mites has been studied. In vivo, there are few studies demonstrating the cross-reactivity between Der p and Blo t analyzing the correlation between skin tests and bronchial provocation. The aim of this study is to evaluate the clinical reactivity in patients with asthma sensitized to both house dust mites, Der p and Blo t. For this reason, patients with asthma, Ambulatory Service of Clinical Immunology and Allergy HCFMUSP were selected. Specific bronchial provocation tests were performed with both mites at different times. Eighteen patients with asthma were selected, and thirty-six provocations were performed. All provocations with the mite Der p were positive. Regarding Blo t, the result was positive in 93% of tests. In the present study, there was agreement in most cases between the presence of sensitization to mites and positivity in bronchial provocation test. Therefore, sensitization to mites in skin test identified is relevant to the triggering of asthma symptoms in these patients

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-10-10T13:46:10Z No. of bitstreams: 1 ingridpimentelcunhamagalhaesdesouzalima.pdf: 1571962 bytes, checksum: 521511b66ed89adf27b01a59f98c7cfc (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-16T13:34:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ingridpimentelcunhamagalhaesdesouzalima.pdf: 1571962 bytes, checksum: 521511b66ed89adf27b01a59f98c7cfc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-16T13:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ingridpimentelcunhamagalhaesdesouzalima.pdf: 1571962 bytes, checksum: 521511b66ed89adf27b01a59f98c7cfc (MD5) Previous issue date: 2018-08-24 / O objetivo do presente estudo é avaliar a positividade do teste cutâneo de contato alérgico de leitura tardia para Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae e Blomia tropicalis em pacientes com doenças respiratórias como rinite alérgica e/ou asma com ou sem dermatite atópica. A maioria dos trabalhos existentes nessa área de pesquisa se refere ao emprego desse método diagnóstico na dermatite atópica, mas, neste estudo, a amostra é composta, principalmente, de pacientes com doenças respiratórias. Blomia tropicalis é um ácaro muito incidente no Brasil e só há dois trabalhos que envolvem o emprego deste ácaro da poeira domiciliar típico de países de clima tropical. Os pacientes foram selecionados pela história clínica e foram divididos em dois grupos: I- pacientes com doenças respiratórias, como asma e/ou rinite alérgica, com dermatite atópica e II- pacientes somente com doenças respiratórias. Foi realizado teste cutâneo de leitura imediata e teste de cutâneo de contato alérgico de leitura tardia para os três ácaros no mesmo dia. O teste de contato alérgico foi retirado em 48 horas. A análise estatísitica foi realizada em porcentagens e a tabela 1 apresenta as variáveis por sexo e por grupo estudado. Setenta e quatro pacientes, com idades de 2 a 60 anos, foram incluídos neste estudo; 16 no grupo I e 58 no grupo II. Considerando o teste cutâneo de leitura imediata, o ácaro mais prevalente foi o Dermatophagoides pteronyssinus, seguido pelo Dermatophagoides farinae e Blomia tropicalis. Em relação ao teste cutâneo de contato alérgico de leitura tardia, o ácaro que induziu maior positividade foi o Dermatophagoides farinae (78,4%), seguido pelo Dermatophagoides pteronyssinus (77%) e Blomia tropicalis (52,7%). Comparando o teste cutâneo de leitura imediata com o teste cutâneo de contato alérgico de leitura tardia, 53 pacientes (71,6%) foram positivos para ambos os testes, e 30 (56,6%) foram positivos ao mesmo ácaro. Foram identificados seis pacientes (8%) que tinham história clinica positiva para alergia e só apresentavam positividade no teste cutâneo de contato alérgico de leitura tardia. Estes resultados sugerem que o teste cutâneo de contato alérgico de leitura tardia é relevante e deve ser considerado como um teste diagnóstico adicional, em pacientes com história clínica positiva para doenças respiratórias, com teste cutâneo de leitura imediata negativa. / The aim of this study is to evaluate the positivity rates of atopy patch tests for Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae and Blomia tropicalis in patients with respiratory diseases such as asthma and allergic rhinitis with or without atopic dermatitis. Most studies have been performed with atopic dermatitis patients, but in our study, most of the patients had respiratory conditions. Blomia tropicalis is a mite that is prevalent in tropical areas, such as Brazil, and only two publications include these three mites, which are present in Brazil. The patients’ clinical histories were collected, and the patients were subjected to skin prick and patch tests with the three different house dust mites on the same day. The patch tests were examined 48 hours later, and then, the patients were divided into two groups: I- patients with respiratory diseases, such as asthma and/or rhinitis, and atopic dermatitis and II-patients with only respiratory diseases. The statistical analysis results are presented as percentages, and Table 1 presents the variables by gender and groups studied. A total of 74 patients ranging in age from 2 to 60 years old were included in this study; 16 patients were included in group I and 58 were included in group II. In the skin prick tests, the most prevalent mite that evoked a reaction was Dermatophagoides pterronyssinus, followed by Dermatophagoides farinae and Blomia tropicalis. Regarding the atopy patch tests, the mite that most frequently induced a positive reaction was Dermatophagoides farinae (78.4%), followed by Dermatophagoides pteronyssinus (77%) and Blomia tropicalis (52.7%). A comparison between the skin prick and atopy patch tests revealed that 53 patients (71.6%) were positive on both tests, and 30 (56.6%) patients were positivite for the same mite. We found six patients (8%) who had a positive clinical history of allergy and only exhibited positivity on the atopy patch test. These results suggest that the mite atopy patch test is relevant and should be considered as an additional test for patients with clinical histories of allergic respiratory disease who have negative prick test results.

One of the purposes of allergen-specific immunotherapy (SIT) is to modulate the humoral immune response against allergens with significant increases in allergen-specific IgG1 and IgG4 levels. These antibodies are associated with blocking activity by preventing IgE binding to allergen and leading to reduced inflammatory responses. This study aimed to investigate in vitro blocking activity of allergen-specific IgG antibodies on IgE reactivity to D. pteronyssinus (Dpt) in sera from atopic patients. Dpt-specific IgG antibodies were obtained from atopic sera and irrelevant IgG from non-atopic sera. IgG antibodies were purified by ammonium sulfate precipitation followed by Protein-G affinity chromatography and evaluated with regards to purity by SDS-PAGE and immunoreactivity by slot-blot and immunoblot assays. The blocking activity was evaluated by inhibition ELISA. The electrophoretical profile after salting-out precipitation showed an enrichment of high molecular weight proteins in the precipitated fraction and strongly stained bands in the ligand fraction after chromatography, compatible with molecular weight of human IgG. It was detected strong immunoreactivity to IgG, negligible to IgA, and no reactivity to IgE and IgM. Dpt-specific IgG fraction was capable to significantly reduce levels of IgE anti-Dpt, resulting in 35-51% inhibition of IgE reactivity to Dpt in atopic patient sera. Allergen-specific IgG antibodies purified using available and standardized methodology are able to inhibit IgE reactivity to Dpt allergen extract. In addition to the clinical symptoms improvement (subjective parameter), this approach reinforces that the intermittent measurement of serum allergen-specific IgG antibodies will be an important objective laboratorial parameter that will help specialists to follow their patients under SIT. / Uma das propostas da imunoterapia alérgeno específica é a de modular a resposta imune humoral contra alérgenos, com aumento significativo nos níveis de IgG1 e IgG4 específicos. Esses anticorpos estão associados com uma atividade bloqueadora, impedindo a ligação de anticorpos IgE ao alérgeno e levando a uma redução nas respostas inflamatórias. Esse estudo objetivou investigar a atividade bloqueadora, in vitro, de anticorpos IgG específicos sobre a reatividade de IgE a D. pteronyssinus (Dpt) em soros de pacientes atópicos. Anticorpos IgG específicos foram obtidos de soros de pacientes atópicos, e IgG irrelevante a partir de soros de não atópicos, e depois purificados por precipitação com sulfato de amônio, seguido de cromatografia de afinidade em Proteina G-agarose. A pureza desses anticorpos foi avaliada por SDS-PAGE, a imunoreatividade por ensaios de slot-blot e immunoblot, e a atividade bloqueadora por ELISA inibição. O perfil eletroforético, após precipitação com sulfato de amônio, mostrou um enriquecimento de proteínas de alto peso molecular na fração precipitada,e bandas fortemente coradas na fração ligante após a cromatografia, compatíveis com o peso molecular de IgG humana. Foi detectada uma forte imunoreatividade para IgG, leve para IgA, e nenhuma reatividade para IgE e IgM. A Fração IgG específica foi capaz de reduzir significantemente os níveis de IgE anti-Dpt, resultando em 35-51% de inibição da reatividade de IgE a Dpt em pools de soros de pacientes atópicos. Anticorpos IgG específicos purificados, através de uma metodologia disponível e padronizada, são capazes de inibir a reatividade de IgE ao extrato alergênico Dpt. Além da melhoria da sintomatologia clínica, considerada um parâmetro subjetivo, essa abordagem reforça que a avaliação intermitente de anticorpos IgG alérgeno-específicos pode ser uma ferramenta importante, auxiliando especialistas a acompanharem seus pacientes em processo de imunoterapia específica. / Mestre em Ciências da Saúde

This diploma thesis was focused on the study of lysozyme and lysozyme-like proteins, either of similar function (antibacterial) or molecular weight (14 - 17 kDa), of synanthropic acaroid mites. In general, animals utilize lysozymes for defensive (antimicrobial) or digestive purposes but also as a digestive enzyme. Some chitinases or other enzymes that act similarly to lysozyme can be utilized for similar purposes. Chitinases belong to house dust mite allergens. One of major mite are historically named lysozyme-like proteins which name relates to their size similar to lysozyme. Bacteriolytic activity has also 14.5 kDa (UniprotKB Q8MWR6) protein. The species selected for the study were domestic mites Dermatophagoides farinae, D. pteronyssinus and Lepidoglyphus destructor. Presence of lysozyme was detected by direct detection with polyclonal antibody using immunohistochemistry and dot blots. Immunohistochemistry proved presence of lysozyme epitopes in the feces of D. farinae, D pteronyssinus a L. destructor. Dot blot analysis demonstrated the presence of imunoreactivity of antibody in spent growth medium extracts (SGME) of all three species. This implies that lysozyme is synthesized in the midgut. The presence of lysozyme and lysozyme-like proteins was proved using 2D electrophoresis and MALDI TOF/TOF...

This study aimed to evaluate the clinical efficacy and systemic/mucosal antibody response changes after sublingual immunotherapy (SLIT) using Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) allergens with or without bacterial extracts in mite-allergic children. One-hundred and two patients presenting allergic rhinitis with or without asthma were selected for a randomized double-blind, placebo-controlled trial and distributed into three groups: DPT (Dpt allergen extract, n=34), DPT+MRB (Dpt allergen plus mixed respiratory bacterial extracts, n=36), and Placebo (n=32). Clinical evaluation and immunological analyses were carried out before and after 12 and 18 months of treatment, including rhinitis/asthma symptom and medication scores, skin prick test (SPT) to Dpt extract, and measurements of Dpt, Der p 1, Der p 2 specific IgE, IgG4, and IgG1 in serum and specific IgA in saliva and nasal lavage fluid. Clinical results showed a significant decline in rhinitis/asthma symptom scores in all groups, but medication use decreased only in DPT group after 12 months. SPT results showed no significant changes and SLIT was generally safe, with no severe systemic reactions. SLIT using Dpt allergen alone induced increased serum IgG4 levels to Dpt, Der p 1 and Der p 2, and increased serum IgG1 and salivary IgA levels to Dpt and Der p 1. SLIT using DPT+MRB was able to decrease IgE levels to Der p 2, to increase salivary IgA levels to Der p 1, but had no changes on specific IgG4 and IgG1 levels. In conclusion, clinical improvement was observed both in the SLIT group and the control, but only active SLIT was able to modulate the mucosal/systemic antibody responses. These findings support the role of specific serum IgG4 and IgG1, in addition to salivary IgA, as probable blocking antibodies or biomarkers of tolerance that may be useful for monitoring the allergen specific immunotherapy. / Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia clínica e alterações da resposta de anticorpos sistêmicos e de mucosa após a imunoterapia sublingual (SLIT), utilizando alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt), com ou sem extratos bacterianos em crianças alérgicas a ácaros. Cento e dois pacientes com rinite alérgica com ou sem asma foram selecionados para um estudo randomizado duplocego, controlado por placebo e distribuídos em três grupos: DPT (extrato alergênico de Dpt, n=34), DPT+MRB (extrato alergênico de Dpt associado com extrato de bactérias mistas do trato respiratório, n=36), e Placebo (n=32). Avaliação clínica e análises imunológicas foram realizadas antes do tratamento e após 12 e 18 meses, incluindo a pontuação de escores de sintomas e medicamentos de rinite/asma, teste cutâneo (SPT) ao extrato Dpt, e medidas de anticorpos específicos IgE, IgG4 e IgG1 para Dpt, Der p 1, Der p 2 no soro e IgA específicos na saliva e no lavado nasal. Os resultados clínicos mostraram uma redução significativa nos escores de sintomas de rinite/asma em todos os grupos, mas o uso de medicamentos diminuiu apenas no grupo DPT após 12 meses. Resultados de SPT não mostraram mudanças significativas e SLIT foi geralmente segura, sem reação sistêmica grave. SLIT usando somente alérgeno Dpt induziu aumento dos níveis de IgG4 para Dpt, Der p 1 e Der p 2 no soro, e aumentou os níveis de IgG1 no soro e salivares de IgA para Dpt e Der p 1. SLIT usando DPT+MRB foi capaz de diminuir os níveis de IgE para Der p 2, aumentar os níveis salivares de IgA para Der p 1, mas não tiveram alterações nos níveis de anticorpos específicos de IgG4 e IgG1. Em conclusão, foi observado melhora clínica tanto no grupo da SLIT como do controle, porém somente na SLIT com alérgeno foi capaz de modular as respostas de anticorpos sistêmicos e de mucosa. Estes achados reforçam o papel de anticorpos IgG4 e IgG1 séricos específicos, além de IgA salivar, como prováveis anticorpos bloqueadores ou biomarcadores de tolerância que podem ser úteis para monitoramento da imunoterapia alérgeno-específica. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O aumento da prevalência de doenças alérgicas como a asma, tem sido atribuído à falta de estímulos infecciosos. A atopia, que embasa as manifestações alérgicas, caracteriza-se por uma disfunção imune com predomínio da resposta do tipo Th2. Experimentos em modelos animais com micobactérias e seus produtos têm demonstrado resultados promissores na proteção e reversão de resposta imune do tipo Th2. A imunoterapia para alérgenos inalatórios tem mostrado resultados positivos e o uso do BCG como adjuvante poderia trazer benefícios adicionais. Em estudo randomizado duplo cego foram avaliados 21 indivíduos de ambos os sexos, com idades de 8 a 17 anos sensibilizados ao Dermatophagoides pteronissynus (Dpt) e portadores de asma leve ou moderada persistentes. Os pacientes foram divididos em dois grupos e tratados com imunoterapia específica (ITE) para Dpt. O Grupo A recebeu como adjuvante, no início da ITE, uma aplicação do diluente do BCG e o Grupo B uma dose da vacina BCG. Na avaliação realizada após o período de indução da ITE constatou-se nos dois grupos diminuição significativa dos sintomas, da necessidade de medicação para asma, da hiperreatividade brônquica inespecífica, da reatividade cutânea ao Dpt juntamente com a melhora da função pulmonar. Houve uma redução no índice de estimulação da cultura de células mononucleares do sangue periférico estimuladas com Dpt, acompanhada de uma elevação da IL-10 no sobrenadante e dos níveis da IgG específica para Dpt e da IgE total. Os eosinófilos, a IgE específica para Dpt do sangue e o óxido nítrico no ar exalado não se alteraram. Não houve diferença na comparação dentre os grupos, exceto na proliferação das células mononucleares do sangue periférico estimuladas com PPD, que foi maior no Grupo B. Conclusão: a ITE levou a resultados satisfatórios com melhora clínica e alterações imunológicas já ao final do período de indução. A avaliação do uso do BCG como adjuvante, não mostrou benefícios adicionais. / The increase of allergic diseases, such as asthma, has often been explained by a decline in infectious stimulation. Atopy that is characterized as an immune dysfunction promotes a strong type Th2 immune response and underlines allergic diseases. Experimental animal models researches with mycobacteria and its products had led to promising results in prevention or reversion of type Th2 response. Positive results have been obtained to allergens specific immunotherapy (SIT) and its association with BCG vaccine, as an adjuvant, could promote additional benefits. In a randomized double blind study 21 patients sensitized to mite Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) with mild or moderate persistent asthma, aged 8 to 17 years of both sex were evaluated. Patients were divided in two groups. Group A received at the beginning of SIT one dose of BCG diluent and Group B one dose of BCG vaccine. After the SIT induction period we observed in both groups a significant decrease in asthma symptoms, bronchial hyperreactivity, immediate cutaneous reactivity to Dpt and the necessity of drugs intake. Specific lymphoproliferation against Dpt significantly decreased while IL-10 levels, specific IgG and total IgE increased. Blood eosinophils, specific IgE, others immunoglobulins levels and nitric oxide in exhaled air didn\'t change. There were no differences in all parameters evaluated between the two groups except on specific lymphoproliferation against PPD that was higher in Group B. Conclusions: improvement in symptoms and immunologicals changes where observed at the end of SIT induction period. BCG as adjuvant didn\'t add additional benefits.

O aumento da prevalência de doenças alérgicas como a asma, tem sido atribuído à falta de estímulos infecciosos. A atopia, que embasa as manifestações alérgicas, caracteriza-se por uma disfunção imune com predomínio da resposta do tipo Th2. Experimentos em modelos animais com micobactérias e seus produtos têm demonstrado resultados promissores na proteção e reversão de resposta imune do tipo Th2. A imunoterapia para alérgenos inalatórios tem mostrado resultados positivos e o uso do BCG como adjuvante poderia trazer benefícios adicionais. Em estudo randomizado duplo cego foram avaliados 21 indivíduos de ambos os sexos, com idades de 8 a 17 anos sensibilizados ao Dermatophagoides pteronissynus (Dpt) e portadores de asma leve ou moderada persistentes. Os pacientes foram divididos em dois grupos e tratados com imunoterapia específica (ITE) para Dpt. O Grupo A recebeu como adjuvante, no início da ITE, uma aplicação do diluente do BCG e o Grupo B uma dose da vacina BCG. Na avaliação realizada após o período de indução da ITE constatou-se nos dois grupos diminuição significativa dos sintomas, da necessidade de medicação para asma, da hiperreatividade brônquica inespecífica, da reatividade cutânea ao Dpt juntamente com a melhora da função pulmonar. Houve uma redução no índice de estimulação da cultura de células mononucleares do sangue periférico estimuladas com Dpt, acompanhada de uma elevação da IL-10 no sobrenadante e dos níveis da IgG específica para Dpt e da IgE total. Os eosinófilos, a IgE específica para Dpt do sangue e o óxido nítrico no ar exalado não se alteraram. Não houve diferença na comparação dentre os grupos, exceto na proliferação das células mononucleares do sangue periférico estimuladas com PPD, que foi maior no Grupo B. Conclusão: a ITE levou a resultados satisfatórios com melhora clínica e alterações imunológicas já ao final do período de indução. A avaliação do uso do BCG como adjuvante, não mostrou benefícios adicionais. / The increase of allergic diseases, such as asthma, has often been explained by a decline in infectious stimulation. Atopy that is characterized as an immune dysfunction promotes a strong type Th2 immune response and underlines allergic diseases. Experimental animal models researches with mycobacteria and its products had led to promising results in prevention or reversion of type Th2 response. Positive results have been obtained to allergens specific immunotherapy (SIT) and its association with BCG vaccine, as an adjuvant, could promote additional benefits. In a randomized double blind study 21 patients sensitized to mite Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) with mild or moderate persistent asthma, aged 8 to 17 years of both sex were evaluated. Patients were divided in two groups. Group A received at the beginning of SIT one dose of BCG diluent and Group B one dose of BCG vaccine. After the SIT induction period we observed in both groups a significant decrease in asthma symptoms, bronchial hyperreactivity, immediate cutaneous reactivity to Dpt and the necessity of drugs intake. Specific lymphoproliferation against Dpt significantly decreased while IL-10 levels, specific IgG and total IgE increased. Blood eosinophils, specific IgE, others immunoglobulins levels and nitric oxide in exhaled air didn\'t change. There were no differences in all parameters evaluated between the two groups except on specific lymphoproliferation against PPD that was higher in Group B. Conclusions: improvement in symptoms and immunologicals changes where observed at the end of SIT induction period. BCG as adjuvant didn\'t add additional benefits.