L’hyperéveil peut être défini comme une augmentation de l’activité émotionnelle, cognitive et physiologique interférant avec le désengagement naturel de l’environnement et réduisant la probabilité de sommeil. Il peut être divisé en 3 catégories étroitement liées et impliquées dans le modèle de l’insomnie chronique tant primaire que concomitante à la dépression majeure (l’hyperéveil somatique, l’hyperéveil cognitif et l’hyperéveil cortical) où il est associé à la présence d’un état d’hypervigilance présent tout au long du cycle de 24h. Cependant, l’hyperéveil semble n’être uniquement présent que dans certains sous-types de dépression majeure caractérisés par un pattern polysomnographique similaire à celui de l’insomnie primaire, tant au niveau de la totalité de la nuit que des tiers de nuit. De plus, chez les individus souffrant d’insomnie et déprimés majeurs, ces altérations polysomnographiques compatibles avec le modèle de l’hyperéveil (courte durée de sommeil, efficience réduite du sommeil et fragmentation du sommeil) sont associées à un risque cardio-métabolique accru par l’intermédiaire d’une action combinée des différentes composantes de l’hyperéveil. Enfin, chez les individus déprimés majeurs présentant une insomnie caractérisée par la présence d’altérations polysomnographiques compatibles avec le modèle de l’hyperéveil, il existe des altérations de la neurotransmission caractérisées par la présence d’une organisation small-world moins efficiente du réseau neuronal durant le sommeil paradoxal et delta. En conclusion, dans l’insomnie et la dépression majeure avec insomnie objective, l’hyperéveil semble être un mécanisme physiopathologique fondamental favorisant la survenue de complications cardio-métaboliques et d’altérations de la neurotransmission durant le sommeil ce qui justifie une prise en charge adaptée de ce phénomène afin de permettre une meilleure prévention cardio-métabolique et une meilleure évolution clinique tant sur le plan symptomatologique que sur le plan cognitif chez ces individus. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le diabète de type 2 résulte d’une diminution de la masse fonctionnelle de cellules bêta pancréatiques, possiblement liée à une dédifférenciation cellulaire : les cellules bêta restent présentes, mais leur production d’insuline s’effondre. Ce phénomène, s’il est avéré, ouvrirait la voie à de nouvelles recherches thérapeutiques. Mais s’il est démontré dans certains modèles murins, il n’existe que des arguments très indirects chez l’Humain. Notre objectif est d’apporter de nouveaux arguments pour ce phénomène chez l’humain en modélisant la dédifférenciation de cellules bêta humaines, en utilisant la lignée de cellules bêta pancréatiques humaines EndoC-βH1 et des îlots pancréatiques humains primaires. Nous avons découvert qu’un traitement par FGF2 effondrait la production d'insuline, et des études par RNA-Seq ont révélé un effondrement de plusieurs marqueurs spécifiques de la cellule bêta, incluant INS, MAFB, SLC2A2, SLC30A8 and GCK. Parallèlement, le traitement par FGF2 induisait l'expression de gènes normalement absents d’une cellule bêta, tels les facteurs de transcription MYC, HES1, SOX9 et NEUROG3. La dédifférenciation induite par le FGF2 était temps- et dose-dépendante, et réversible après wash-out. En outre, nous démontrons que la dédifférenciation modifie l’interaction de la cellule bêta avec son environnement : l'expression de TNFRSF11B (ostéoprotégerine), un récepteur tronqué pour RANKL (receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand), est induite lors du traitement par FGF2, et les cellules β sont alors protégées contre la signalisation RANKL (TNFSF11) par inhibition de la phosphorylation de P38. Enfin, les analyses des données transcriptomiques ont révélé des niveaux accrus d'ARNm de FGF2 dans les cellules canalaires, endothéliales et stellaires dans les pancréas d’individus diabétiques de type 2, alors que les taux d'ARNm de FGFR1, SOX9 et HES1 sont augmentés dans les îlots pancréatiques d’individus diabétiques de type 2. Nous avons donc développé un modèle de dédifférenciation des cellules bêta humaines induit par le FGF2, identifié de nouveaux marqueurs de dédifférenciation, et trouvé des signes d'augmentation de FGF2, FGFR1 et des marqueurs de dédifférenciation au cours du diabète de type 2. / Clinical and experimental evidences indicate a reduced functional β cell mass in type 2 diabetes. A recent hypothesis implicates β cell dedifferentiation in this reduction of functional β-cell mass. The vast majority of data related to β cell dedifferentiation derive from rodent models, and only indirect evidences are available in human. Our goal was to model human β-cell dedifferentiation using the functional human pancreatic β-cell line, EndoC-βH1, and primary human pancreatic islets. By screening a number of molecules in EndoC-βH1 cells, we found that FGF2 treatment dramatically reduces insulin production and MAFA expression, a β cell specific transcriptional activator. RNASeq of EndoC-βH1 cells treated with FGF2 revealed the down-regulation of additional human β cell specific markers, including INS, MAFB, SLC2A2, SLC30A8 and GCK. In parallel, FGF2 treatment activated the expression of β cell disallowed genes. This is the case for transcription factors such as MYC, HES1, SOX9 and NEUROG3. This is also the case for hormones such as GASTRIN and PYY. Such data were further confirmed by qPCR and immunostaining on primary human islets, attesting that dedifferentiation process occurs in human primary β cells. FGF2-induced dedifferentiation was time- and dose-dependent, and reversible upon wash-out. Furthermore, transcriptomic analysis revealed an increase of TNFRSF11B (osteoprotegerin) expression upon FGF2 treatment. TNFRSF11B is a decoy receptor for the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL). Our experimental data on EndoC-βH1 demonstrated that FGF2-induced TNFRSF11B protected β cells against TNFSF11 (RANKL) signaling by preventing P38 phosphorylation. Finally, analyses of transcriptomic data revealed increased FGF2 mRNA levels in ductal, endothelial and stellate cells in pancreases from type 2 diabetic patients, whereas FGFR1, SOX9 and HES1 mRNA levels increased in islets from type 2 diabetic patients. In conclusion, we developed a robust model to study β-cell dedifferentiation in a human context. We discovered SOX9, HES1 and MYC as positive markers of human β cell dedifferentiation, demonstrating evidence for dedifferentiation process in human β cell.

Notre travail de thèse avait pour objet l’étude du potentiel anti-diabétique des urolithines A, B, C et D, métabolites de polyphénols formés par le microbiote colique à partir des tanins de l’acide ellagique (présents notamment dans la grenade et les noix).La première partie, bibliographique, constitue un rappel :• de la régulation de l’équilibre glycémique et le rôle de la sécrétion d’insuline dans cette régulation ; •de l ‘épidémiologie et la physiopathologie du diabète type 2 (DT2) ; •des polyphénols et leurs métabolites, ainsi que de leurs effets antidiabétiques potentiels.La seconde partie décrit les effets des urolithines sur différents modèles expérimentaux : •Sur un modèle de cellules β insulino-sécrétrices (lignée INS-1), les urolithines induisent une amplification concentration-dépendante de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, mais également par d’autres sécrétagogues comme un analogue du GLP-1 ou une sulfonylurée (médicaments utilisés dans le diabète). Les urolithines préviennent également l’altération sécrétoire induite par un stress oxydant. •L’effet insulino-sécrétoire des urolithines a été confirmé sur îlots de Langerhans isolés. •L’urolithine C étant apparu comme le composé le plus prometteur, nous avons poursuivi la caractérisation de son activité sur un modèle ex vivo mimant la situation physiologique, le pancréas isolé perfusé. Alors que l’effet sécrétoire de l’urolithine C n’apparaît pas en présence de 5mM de glucose, l’urolithine C (20µM) a stimulé la sécrétion d’insuline dans des conditions de stimulation modérée de la sécrétion d’insuline par le glucose (8.3mM). Cet effet est strictement dépendant du glucose, la sécrétion d’insuline retournant immédiatement à son niveau basal lors du passage de 8,3 à 5mM de glucose en présence d’urolithine C. •Des études de pharmacocinétique ont permis de mettre au point une méthodologie de dosage plasmatique de l’urolithine C dans le plasma de rat par chromatographie liquide / ionisation electrospray /spectrographie de masse en tandem. Cette méthodologie a été appliquée à une première étude pharmacocinétique chez le rat après injection de 10mg/kg d’urolithine C par voie intra-péritonéale. Cette étude montre notamment que le profil pharmacocinétique suit un modèle à 3 compartiments et suggère un stockage tissulaire du composé.D’autres résultats (confidentiels) ne peuvent être évoqués dans ce résumé mais confirment l’intérêt potentiel de l’urolithine C dans le traitement du diabète de type 2 en tant que médicament insulinotrope dépendant du glucose. / The objective of our thesis was to study the anti-diabetic potential of metabolites of ellagic acid tanins, present notably in pomegranate and nuts, that are formed by the colon microbiote. The metabolites are urolithins A, B, C and D.The first part of thesis is bibliographic and reviews: •The control of glycemic plasma levels, and in particular the role of insulin secretion in this process; • The pathophysiology of Type 2 Diabetes (T2D); •The various polyphenols and their metabolites, along with their potential anti-diabetic activity.The second part describes the effects of urolithins on various experimental models: •On a model of insulin secreting beta cells (the INS-1cell line), urolithins concentration-dependently amplified insulin secretion induced by glucose, but also by insulinotropic drugs used in the treatment of T2D such as a GLP-1 analogue or a sulfonylurea. In addition, urolithins were able to induce insulin secretion on cells rendered unresponsive to glucose by oxidative stress. • The insulinotropic effect of urolithins was also confirmed on isolated rat islets of Langerhans. •As urolithin C appeared to be the most promising antidiabetic compound, we further characterized its activity on an ex vivo model mimicking the physiological situation, the isolated infused pancreas. While urolithin C (20µM) had no effect in the presence of 5 mM glucose concentration, it amplified the stimulation of insulin secretion in the presence of 8.3mM glucose. The effect of urolithin C was also strictly glucose-dependent, as insulin secretion immediately returned to basal level when glucose concentration was switched from 8.3 to 5mM glucose in the presence of urolithin C. •We also conducted studies aiming at designing a validated methodology for rat plasma urolithin C determination using a liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry method. The applicability of this assay was demonstrated in a preclinical pharmacokinetic study carried out in rats receiving intraperitoneal administration of urolithin C (10mg/kg). We found that the urolithin C followed a three-compartment model, suggesting a long-term tissue storage of urolithin C.Some other (confidential) results, not described in this abstract, confirmed urolithin C as a potential glucose-dependent insulinotropic treatment for type 2 diabetes.

La transplantation d’îlots pancréatiques est une des thérapies proposées aux diabétiques de type 1. Cependant, la perte d’un nombre considérable d’îlots durant le processus est un frein à l’expansion de la thérapie (en culture : anoïkis et hypoxie ; lors de la greffe : réactions inflammatoires intenses déclenchées lors de l’infusion intra-portale). L’objectif de ce travail était de valider un biomatériau permettant d’optimiser la transplantation d’îlots. Nous avons pu démontrer l’efficacité du plasma réticulé sur la survie des îlots en culture via une diminution drastique de l’anoïkis. Nous avons également mis au point une technique de greffe intra-tissulaire à l’aide d’HPMC combinée à du plasma, permettant de reverser le diabète de manière semblable à la greffe hépatique. Ces travaux ont donc permis de valider l’importance d’un support de culture adapté, mais aussi du site receveur de la greffe et placé l’omentum comme site de choix pour ce type de greffe. / Pancreatic islet transplantation is one of the therapies proposed to type 1 diabetic patients. However, the considerable loss of islets during the process is an obstacle to the expansion of this therapy (culture: anoïkis and hypoxia; at graft time: intense inflammatory reactions triggered by intra-portal islet infusion). The objective of this work was to validate a biomaterial that can optimize islet transplantation. We were able to demonstrate the effectiveness of cross-linked plasma on the islet survival in culture through a drastic reduction of anoikis. We also design a new intra-tissular grafting technique using HPMC combined with plasma, which reversed diabetes in a manner similar to the liver. This work allowed validating the importance of an adapted culture support, but also the one of the recipient site. Also, this work placed the omentum as an excellent recipient site for this kind of transplant.

Certaines souches de bifidobactéries entrent dans la composition de laits infantiles. Leurs propriétés (modulation du microbiome, régulation de la translocation bactérienne, maturation de cellules dendritiques) sont liées à la capacité de sécrétion de composés de haut poids moléculaire lors de la fermentation bactérienne. Les objectifs de ce travail sont, dans un premier temps, de caractériser les molécules issues de la fermentation de la souche de référence B.breve C50, et de déterminer si d’autres bifidobactéries peuvent sécréter des molécules de propriétés similaires. Les analyses associant chromatographie gazeuse (GC), spectrométrie de masse (MS), électrophorèse, séquençage protéique montrent que les composés fermentaires de B.breve C50 sont des agrégats (>600kDa) associant des unités lipoprotéiques de la paroi cellulaire contenant un domaine CHAP et des sucres, en majorité du glucose. Ces agrégats sont reconnus par le TLR6, indiquant une structure lipoprotéique di-acylée. Ils sont également ligand de la galectine 1, ce qui suggère que les hexosamines et le galactose détectés par GC sont exposés à l’extérieur des agrégats. L’analyse in silico des homologies avec le gène codant pour la séquence protéique révèle la proximité du gène de B.longum avec B.breve. Par contre, il est peu probable que B.bifidum sécrète des agrégats semblables, la séquence du gène homologue étant dépourvu de lipobox. Les agrégats (>600 kDa), isolés après fermentation de la souche B.longum CBi0703 dans le milieu lacté de référence, montrent une composition similaire (unités lipoprotéique associées à des sucres, en majorité du glucose et du mannose), une reconnaissance par la Galectine 1 mais non par le TLR6. La différence de composition en lipide et l’hydrophobicité de la séquence protéique semble prévenir la reconnaissance de la structure lipoprotéique par le récepteur TLR6. Les agrégats de B.longum ayant montré des propriétés anti-inflammatoires, l’hypothèse d’une phagocytose a été explorée dans un deuxième temps. Les agrégats marqués par des marqueurs fluorescents ne sont pas détectés dans les cellules après contact direct (ex-vivo) ou gavage des animaux (in vivo). Une capture des agrégats par les cellules présentatrices d’antigènes est donc peu probable. La reconnaissance par la galectine 1 des deux types d’agrégats bifides nous fait privilégier la piste d’un mécanisme de régulation de la translocation du microbiome par l’intermédiaire des structures hexosamines et galactose exposées à la surface des agrégats. Dans un troisième temps, l’implication des agrégats bifides dans la prévention du diabète de type 1 a été explorée. En effet, le lait de femme prévient la survenue du diabète chez les souris NOD. La recherche par PCR du gène codant pour la lipoprotéine d’intérêt a permis la détection de B.longum dans 21 échantillons de lait maternel sur 33 (soit 12 mamans parmi 16). A l’inverse, B.breve est rarement isolé (2 mamans parmi 16). Comme l’analyse transcriptomique indique que les lipoprotéines sont synthétisées de façon continue, elles peuvent donc être sécrétées par les bifidobactéries dans le lait de femme. Aussi le choix s’est porté sur les agrégats de B.longum, testés à une dose anti-inflammatoire en prévention anti-diabétique. Si l’administration de lait maternel réduit l’incidence du DT1 chez des souris NOD âgées de plus de 18 semaines (p < 0.001), c’est au contraire une protection précoce mais qui ne persiste pas qui est observée sous agrégats bifides. L’effet protecteur est observé en absence de bifidobactéries intestinales. Les agrégats bifides à la dose anti-inflammatoire ne modulent pas à la même vitesse les bactéries intestinales sensibles au lait de femme, ce qui pourrait expliquer le retard d’apparition des premiers diabètes lors du traitement. / Some bifidobacterial strains are used to ferment infant formulas. Their properties (modulation of microbiome, regulation of bacterial translocation, dendritic cells maturation) are related to their ability to secrete high molecular weight compounds during the bacterial fermentation. The first objective of the study was to characterize the molecules secreted by the strain B.breve C50 used as a reference, and to determine whether other bifidobacteria can secrete molecules with similar properties. Analysis using gas chromatography (GC), mass spectrometry (MS), electrophoresis, protein sequencing showed that the B.breve C50 fermentation compounds are constituted of aggregates (>600kDa) combining units of a cell wall lipoprotein with a CHAP domain and sugars moities, mostly glucose. The aggregates are recognized by TLR6, indicating that the protein was diacetylated. They are also ligand of the galectin 1, suggesting that the hexosamine and galactose moieties detected by GC surrounded the aggregates. In silico analysis showed that a B.longum gene exhibiting a high homology with the B.breve C50 gene, coded for a lipoprotein, which was secreted during fermentation, and formed aggregates with sugars. B.bifidum species likely does not secrete similar aggregates since the sequence of the homologous gene is deprived of lipobox. B.longum CBi0703 and B.breve C50 aggregates shared the same global structure (lipoproteins with CHAP domain bordered by sugars primarily constituted of glucose and mannose). Remarkably, the CBi0703 aggregates were also able to bind Gal-1 but were lacking binding capacities to TLR6. It is likely that the hydrophobicity of the protein sequence, as well as the lipid and sugar compositions prevented the recognition of the lipoprotein structure by the TLR6 receptor. Secondly, a putative phagocytosis of aggregates was investigated. Fluorescent-labeled aggregates are not detected within cells after direct contact (ex-vivo) or oral challenge in animals (in vivo). Capture of the aggregates by antigen presenting cells seemed improbable. The two types of aggregates being recognized by galectin-1, regulation of the intestinal bacterial translocation by the aggregates likely involves the hexosamines and galactose surrounding their surface. In a third step, the possible involvement of the bifidobacterial aggregates in the prevention of type 1 diabetes was investigated. Actually, breast milk was previously shown to prevent diabetes onset in old NOD mice. Detection of bifidobacteria using amplification of the gene encoding the B.longum lipoprotein was positive in 21 human milk samples out of 31 (i.e. 12 mothers out of 16). Conversely, B.breve is rarely isolated (2/16 mothers). Since transcriptomic analysis showed that the lipoproteins were continuously synthesized, we hypothesized that the bifidobacterial aggregates were secreted by the bifidobacteria harbored in human milk. To ensure that B.longum aggregates play a role in the protection induced by human milk, they were assayed at an anti-inflammatory dose. Contrary to breast milk which reduced the incidence of T1D in NOD mice older than 18 weeks (p <0.001), only early but not persistent protection is observed during bifidobacterial aggregates intake. The protective effect was observed in the absence of intestinal bifidobacteria. Variation in intestinal bacterial colonization did not match in groups drinking human milk or bifidobacterial aggregates at an inflammatory dose. The difference in kinetics could support the delay in diabetes onset induced by the bifidobacterial aggregates.

Les acides biliaires sont depuis longtemps connus pour leur propriété d’agents solubilisant des graisses et des vitamines liposolubles, permettant ainsi une absorption efficace de ces nutriments lors de la digestion. Depuis les années 2000, plusieurs équipes ont montré que ces molécules étaient également dotées de propriétés de signalisation, en particulier via l’activation de deux récepteurs : le récepteur nucléaire FXR, et le récepteur membranaire TGR5. Le récepteur TGR5 est exprimé dans de très nombreux tissus, dont les muscles lisses et squelettiques, le tissu adipeux brun, la vésicule biliaire, mais aussi certaines cellules immunitaires et certaines populations cellulaires intestinales telles que les cellules entéroendocrine L. Selon le tissu étudié, l’activation de TGR5 peut être suivie de nombreux effets biologiques. En particulier, au niveau intestinal, l’activation de ce récepteur stimule la sécrétion de l’hormone incrétine GLP-1.Les hormones incrétines sont impliquées dans la régulation de la glycémie, en particulier dans la phase postprandiale, où elles concourent à potentialiser l’action de l’insuline, hormone hypoglycémiante majeure. Or, dans un contexte de diabète, et en particulier de diabète de type 2, l’organisme est devenu moins sensible à l’insuline, ce qui se traduit par un défaut de gestion de la glycémie, pouvant entrainer à terme des complications graves, telles que des amputations, une cécité, ou encore des problèmes cardiovasculaires. La prévalence et l’incidence de cette pathologie ont conduit l’OMS à la considérer comme la première épidémie d’origine non-infectieuse, ce qui illustre son impact sur la santé publique et le besoin médical constant qu’elle génère.Dans ce contexte, TGR5 apparait comme cible thérapeutique potentielle attrayante, de par l’effet GLP-1 sécrétagogue consécutif à son activation. En effet, parmi les thérapies antidiabétiques, deux classes de molécules basent leur efficacité sur une augmentation de la signalisation de la voie incrétine : les incrétinopotentiateurs (inhibiteurs de la DDP4, enzyme responsable de la faible demi-vie du GLP-1) et les incrétinomimétiques (agonistes synthétiques du récepteur au GLP-1). Récemment, cette dernière classe a également fait son apparition dans l’arsenal thérapeutique de l’obésité, confirmant l’intérêt de cette voie de signalisation dans les pathologies issues d’un désordre métabolique. L’obtention de composés GLP-1 sécrétagogues s’avère ainsi prometteuse et représente une approche complémentaire aux deux autres classes.L’objectif de ce travail était donc d’obtenir des agonistes puissants, sélectifs et originaux du récepteur TGR5. Afin de diminuer les risques d’effets indésirables, on-target ou off-target, nous avons choisi de profiter de la localisation intestinale de notre cible d’intérêt en concevant nos composés de manière à limiter l’exposition au seul tractus gastro-intestinal, en limitant leur absorption. Ainsi, nous avons cherché à obtenir des composés non systémiques GLP-1 sécrétagogues.La stratégie employée pour aboutir à ces composés a été le développement de molécules chimériques constituées d’une partie agoniste de TGR5, le pharmacophore, liée à un groupement permettant de limiter la perméabilité membranaire et donc l’absorption intestinale, le kinétophore. Après avoir optimisé la partie pharmacophore et identifié une position permettant l’ajout de différents types de kinétophores sans impact majeur sur l’activité du composé, nous avons pu obtenir plusieurs agonistes de TGR5 puissants, originaux, et dotés d’une très faible perméabilité membranaire. L’étude in vivo de ces molécules a ensuite permis de valider d’une part leur activité GLP-1 sécrétagogue, et d’autre part leur faible exposition systémique. Enfin, l’évaluation du potentiel thérapeutique d’un des meilleurs composés dans des modèles murins de diabète a récemment pu être initiée. / Bile acids have long been known as lipid solubilizing agents, enabling efficient absorption of nutrients and vitamins during digestion. Since 2000, several teams have demonstrated the signaling properties of these molecules, especially through the activation of two receptors : the nuclear receptor FXR and the membrane receptor TGR5.The TGR5 receptor is expressed in various tissues, such as smooth and skeletal muscles, brown adipose tissue, gallbladder, but also on some immune or intestinal cell lines such as the enteroendocrine L cells. Depending on the studied tissue, TGR5 activation can trigger various biological effects. In the intestine, its activation can stimulate the secretion of an incretin hormone, the GLP-1.Incretin hormones play a role in glycaemia regulation, especially during the postprandial phase during which they potentiate the action of the insulin, the main hypoglycemic hormone. Diabetes mellitus correspond to a decreased response of the organism to insulin signaling. This leads to a default in the glycaemia handling that can lead to serious complications, such as amputation, blindness, or cardiovascular problems. Prevalence and incidence of this disease have lead the WHO to define diabetes as the first non-infectious epidemic, illustrating its impact on public health and the constant need for new therapeutic opportunities.In this context, TGR5 appears as an appealing potential therapeutic target, especially because of the GLP-1 secretagogue effect triggered by its activation. Indeed, among the antidiabetic therapeutic options, two classes of drugs work by increasing the incretin signaling: the incretinopotentiators (inhibitors of the DPP4, which is the enzyme responsible for the very short half-life of GLP-1), and the incretinomimetics (synthetic agonists of the GLP-1 receptor). Recently, this last class has also been approved to treat obesity. This demonstrates the interest of this signaling pathway in the treatment of metabolic disorders. Hence, GLP-1 secretagogue compounds may prove to be an interesting approach, and could complement the two other classes.The aim of this work was then to obtain potent, selective and original agonists of the TGR5 receptor. In order to decrease the risk of on-target and off-target effects, we decided to take advantage of the intestinal localization of our target by designing compounds that would only expose the gastro-intestinal tract, by limiting their absorption. Thus, we wanted to obtain non systemic GLP-1 secretagogue compounds.Our strategy was to develop chimeric compounds consisting of a pharmacophore part, which would be a potent and selective agonist of TGR5, linked to a kinetophore part, which would decrease membrane permeability. After having optimized the pharmacophore part and having identified a position where we could link various kinetophore moieties with only weak impact on the activity, we obtained several potent TGR5 agonists with very low membrane permeability. In vivo evaluations of these compounds have validated both their GLP-1 secretagogue activity and their low systemic exposure. In the end, evaluation of our lead compound on mouse model of diabetes was recently started.

Notre équipe a récemment découvert l’importance du ciblage des granules d’insuline aux lysosomes lors d’une mise à jeun chez les cellules pancréatiques β. Le diabète de type 2 (TD2) est caractérisé par la résistance à l’insuline couplé au dysfonctionnement des cellules β-et à leur perte. Je souhaitais évaluer le ciblage des granules d’insuline aux lysosomes dans le contexte diabétique. Grâce à un modèle murin, nous avons trouvé que le nombre des lysosomes contenant des granules d’insuline était augmenté chez les cellules β-provenant de souris diabétiques en comparaison aux contrôles. Ceci était accompagné par l’augmentation des niveaux de la protéine lysosomale CD63. Parce que PKD1 contrôle le ciblage des granules d’insuline aux lysosomes lors d’une mise à jeun, nous nous sommes demandé si PKD1 était importante lors d’un diabète de type 2. Dans nos modèles, les niveaux de PKD1 étaient diminués en conditions diabétiques en comparaison aux contrôles. De plus, l’inhibition de PKD1 entrainait l’augmentation du ciblage des granules d’insuline aux lysosomes et accélérait l’apparition du diabète dans notre modèle murin. Nous souhaitions ensuite savoir si l’activation de PKD1 dans les cellules pancréatiques β-pouvait être avantageuse dans un contexte diabétique. De fait, grâce à l’utilisation d’un composé spécifique, nous avons pu montrer que l’activation de PKD1 menait à l’augmentation des niveaux d’insuline sur des ilots pancréatiques humains et ralentissait l’apparition du diabète dans notre modèle murin. Pour conclure, j’ai aussi débuté la caractérisation des lysosomes sur d’autres types cellulaires des ilots pancréatiques. Nous avons observé que LIMP2, une autre protéine lysosomale, était fortement exprimée chez les cellules pancréatiques α. / Our team recently uncovered the importance of the targeting of insulin granules to the lysosomal compartments in pancreatic β-cells during fasting. Type 2 Diabetes (T2D) is characterised by insulin resistance coupled with pancreatic β-cell failure which account for both β-cells dysfunction and β-cells death. I wanted to assess the targeting of insulin granule to the lysosomes in the context of T2D. Using murine diabetic model, we found that the number Granule-containing Lysosomes was enhanced in diabetic β-cells in comparison to controls. This was accompanied by an increase in the level of the lysosomal protein CD63. Because PKD1 controls the targeting of insulin granule to the lysosomes during fasting, I wondered if PKD1 was important during T2D. PKD1 levels were decreased in our diabetic models in comparison to controls. Moreover inhibition of PKD1 led to enhanced targeting of the insulin granules to the lysosomes and accelerated apparition of diabetes in our murine model. I also tested if activation of PKD1 in pancreatic β-cells could be beneficial in the context of diabetes. Indeed using a specific compound, we showed that PKD1 activation led to an increase in insulin levels and delayed onset of diabetes in our murine model. My work thus uncovered mechanisms underlying a fundamentally new process in β-cells with potential implications for novel therapeutic directions in T2D. Finally, I started to assess lysosomes in another pancreatic islets cell type. I found that LIMP2, another lysosomal membrane protein, was specifically highly expressed in the pancreatic α-cells.

Le diabète de type 2 (DT2) progresse dans le monde entier de manière alarmante. Les complications sont graves et les traitements sont souvent inefficaces et donnent beaucoup d'effets indésirables. Le resvératrol (RSV) et la curcumine (Cur), des polyphénols naturels, sont connus pour leurs différentes activités pharmacologiques, y compris antidiabétiques. Les objectifs de cette étude ont été d'évaluer les effets de la combinaison de ces deux polyphénols sur l'amélioration de la tolérance au glucose. Nos résultats montrent que chez des souris soumises à un régime riche en graisse (HFD), le RSV améliore la tolérance au glucose alors que la Cur n'a pas d'effet significatif. De manière surprenante, lorsque les deux polyphénols sont administrés simultanément, la Cur inhibe l'effet du RSV sur l'amélioration de la tolérance au glucose. Pour expliquer cet antagonisme, nous avons évalué l'effet de ces polyphénols associés ou pas sur le métagénome. Nos résultats indiquent que la Cur et le RSV normalisent la flore intestinale altérée par le HFD. Lors d'une association de ces polyphénols, la Cur inhibe aussi l'effet du RSV sur la croissance de certaines espèces bactériennes. Ainsi, la Cur bloque l'effet inhibiteur du RSV sur Alistipes putredinis. Nos données indiquent que ces polyphénols sont en général anti-inflammatoires mais leur association peut être synergique in vitro ou bien, à l'opposé, antagoniste in vivo pour l'expression de certaines cytokines. Afin d'évaluer l'effet physiologique de la modification de la flore intestinale par les polyphénols, nous avons étudié le métabolome. Parallèlement au métagénome, chacun des polyphénols améliore le profil métabolomique altéré par le HFD. Cependant, la Cur s'oppose à l'effet du RSV. Les données de ce travail indiquent que la Cur n'est pas associable au RSV pour améliorer la tolérance au glucose. / Each year, the worldwide impact of type 2 diabetes (T2D) increases significantly. The complications are serious and treatments are often ineffective and provide a lot of side effects. Resveratrol (RSV) and curcumin (Cur) are natural polyphenols known for their different pharmacological activities, including anti-diabetic. The objectives of this study were to evaluate the effects of the combination of these polyphenols on glucose tolerance improvement. Our results show that in animals fed with a high fat diet (HFD), RSV improved glucose tolerance while Cur displayed no significant effect. Surprisingly, when both polyphenols were administered simultaneously, Cur inhibited the effect of RSV on glucose tolerance improvement. To explain this antagonism between both polyphenols on glucose tolerance, we have evaluated the effect of these compounds on the metagenome associated or not. Our results indicate that RSV and Cur normalized gut flora altered by HFD. When Cur and RSV were administrated simultaneously, Cur inhibited the effect of RSV on the growth of some bacterial species. Thus, Cur blocked the inhibitory effect of RSV on Alistipes putredinis. Our data indicate that these polyphenols displayed generally anti-inflammatory effects, but their combination may be either synergistic in vitro or antagonistic in vivo on the expression of some cytokines. To evaluate the physiological effect of the gut flora changes induced by polyphenols, we have drawn a parallel between metagenome and metabolome data. Each of the polyphenols improved by itself the metabolomic profile altered by HFD. However, Cur hindered the effect of RSV. In a whole, this study indicates that combination of Cur with RSV is not successful to further enhance the RSV-induced improvement of glucose tolerance.

De nos jours, le changement de style de vie et la consommation excessive d'aliments riches en énergie sont associés avec l'augmentation majeure de l'incidence des maladies métaboliques comme l'obésité et le diabète de type 2. Le diabète de type 2 est caractérisé, entre autre, par une augmentation de la production hépatique de glucose responsable d'une hyperglycémie chronique. Durant ces 10 dernières années, plusieurs études ont suggéré que le microbiote intestinal pouvait être impliqué dans le développement des maladies métaboliques. Le microbiote intestinal est composé de plusieurs milliards de bactéries réparties en plus de 1000 espèces différentes qui colonisent le tractus digestif. Plusieurs études ont montré que certaines pathologies comme le diabète et l'obésité sont caractérisées par des altérations taxonomiques et fonctionnelles du microbiote intestinal. De plus, la colonisation de souris axéniques (i.e. dépourvues de microbiote) par un microbiote intestinal provenant de souris ou d'Hommes obèses/diabétiques est suffisante pour induire la pathologie. Ces résultats suggèrent que les modifications du microbiote intestinal retrouvées chez les patients obèses/diabétiques sont potentiellement impliquées dans le développement des maladies métaboliques. Cependant, l'absence de microbiote intestinal chez les souris axéniques induit des altérations structurelles et fonctionnelles de l'intestin comme une hyperperméabilité intestinale ou un système immunitaire atrophié. Dans ces conditions, il est possible de se demander si les effets délétères induits par la colonisation des souris axéniques avec un microbiote modifié peuvent être observés chez des souris conventionnelles. Pour répondre à cette question nous avons développé un nouveau protocole de transfert de microbiote intestinal dans un modèle de souris conventionnelles. Nous avons transféré le microbiote contenu dans le caecum de souris obèses (" microbiote obèse ") et celui contenu dans le caecum de souris minces (" microbiote mince ") dans des souris conventionnelles non traitées aux antibiotiques. De manière surprenante, le transfert du " microbiote obèse " a induit une diminution de la glycémie à jeun associée à une baisse de la néoglucogenèse hépatique chez les souris transplantées. A l'inverse, le transfert du " microbiote mince " n'a pas modifié la néoglucogenèse. De plus, le transfert du " microbiote obèse " a induit des modifications taxonomiques et fonctionnelles du microbiote intestinal des souris transplantées. De manière intéressante, une fois nourries avec un régime hyperlipidique les souris ayant reçu le " microbiote obèse " ont conservé une glycémie à jeun plus faible que les souris non transplantées. Encore une fois, ce phénotype résulte d'une diminution de la production hépatique de glucose caractérisée par une baisse de l'activité des enzymes néoglucogéniques phosphoenolpyruvate carboxykinase et glucose-6-phosphatase. Par ailleurs, ces souris sont également moins grasses que les souris non transplantées. En conclusion, nous avons montré que le transfert d'un " microbiote obèse " peut moduler le métabolisme hépatique et prévenir l'augmentation de la néoglucogenèse hépatique normalement induite par le régime hyperlipidique chez des souris conventionnelles. Ces travaux de thèse ont montré d'une part, que la modification du microbiote intestinal de souris conventionnelles est possible par transfert de microbiote caecal. D'autre part et contre toutes attentes, ces résultats mettent en lumière que, contrairement aux observations faites chez les souris axéniques, le transfert d'un " microbiote obèse " dans une souris conventionnelle n'induit pas les phénotypes caractéristiques des maladies métaboliques. Par ailleurs, ce modèle de transfert caecal pourrait être utile pour la compréhension du rôle des bactéries intestinales sur le développement des maladies métaboliques. / Nowadays, the change of lifestyle and increase in the consumption of high-calorie foods are associated with a marked rise of the prevalence of metabolic diseases, including obesity and type 2 diabetes. Type 2 diabetes is linked, at least in part, to an increase of hepatic glucose production responsible for a fasting hyperglycemia. In the past decade, an increasing body of evidence has proposed gut microbiota as a new factor contributing to these metabolic alterations. Gut microbiota consists of trillions of bacteria identifying more than 1000 different species that inhabit our intestine. A body of work has demonstrated that multiple pathologies such as type 2 diabetes and obesity are characterized by an altered proportion and activity of the gut microbiota. In addition, the colonization of germ-free mice with the gut microbiota from either obese/diabetic humans or obese/diabetic mice transfers the phenotype. These results suggest that the modifications of the gut microbiota found in obese/diabetic patients are a potential etiologic factor for those diseases. Nevertheless, the lack of microbiota in germ-free mice determines both structural and functional alterations such as gut hyperpermeability and the atrophy of the immune system. Therefore, we could wonder whether the detrimental effects of the gut microbiota from obese/diabetic patients observed in germ-free mice may also be observed in healthy conventional mice. To address this issue, we have developed a new gut microbiota transferring process from conventional mice to other mice. We have transferred the cecal microbiota harvested from either obese ("obese microbiota") or lean ("lean microbiota") mice in antibiotic-free conventional mice. Surprisingly, the mice which received the "obese microbiota" had a reduced fasted glycaemia compared to the mice which received the "lean microbiota". This diminution could be attributed to a decrease of the hepatic gluconeogenesis since conversion from pyruvate to glucose and phosphoenolpyruvate carboxykinase activity were lower in the liver of mice which received the "obese microbiota". Conversely, the transfer of the "lean microbiota" did not affect the hepatic gluconeogenesis. In addition, the transfer of the "obese microbiota" changed gut microbiota composition and the microbiome of recipient mice. Interestingly, mice which received the "obese microbiota" and fed a high-fat diet still exhibited reduced fed and fasted glycaemia. Once again, this phenotype was due to a decrease of hepatic gluconeogenesis characterized by a diminution of phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase activity. In addition, the mice which received the "obese microbiota" had less adiposity compared to the non-transferred mice. Finally, we reported that transferring the "obese microbiota" impact on hepatic metabolism and prevent HFD-increase hepatic gluconeogenesis. On the one hand, these thesis works, have demonstrated that it is possible to modify the gut microbiota by our caecal transferring process. On the other hand, our results suggest that the transfer of the "obese microbiota" in conventional mice does not induced some characteristics of metabolic diseases contrary to that it is observed in germ-free mice. Furthermore, this kind of gut microbiota transferring process may be useful for a better understanding of the etiology of metabolic diseases.

Le présent travail rend compte des études phytochimiques et biologiques d'extraits non volatils de quatre plantes utilisées au Bénin dans le traitement du diabète. La première partie passe en revue la bibliographie sur les plantes sujettes à notre étude. Dans cette partie, la systématique, l'importance en pharmacopée ainsi que les travaux déjà effectués sur ces plantes ont été présentés. La deuxième partie présente le mode d'extraction et les études chimiques des extraits et les résultats obtenus. La spectrophotométrie a permis de déterminer quelques grandes familles de composés présents dans les extraits : les polyphénols totaux, les flavonoïdes et les tanins tandis que la GC/MS et la LC/MS ont servi à mettre en exergue la présence de composés volatils et non volatils. La troisième partie décrit les tests biologiques in vitro et ex vitro effectués sur les extraits. Les extraits ont montré de manière générale des activités : inhibitrice de l' α-glucosidase, antioxydantes (DPPH, FRAP, ORAC), antimicrobiennes et l'une (Bridelia ferruginea) une activité cytotoxique sur les cellules cancéreuses (PA1, MCF7, PC3, DU-145), avec une efficacité variable d'une plante à une autre. La quatrième partie discute de manière générale des résultats issus des études phytochimiques et des tests biologiques. Parmi les quatre échantillons de plantes sélectionnées pour notre étude, seul l'extrait semi-éthanolique des racines de Ceiba pentandra a une faible teneur en familles de composés dosés et présente des activités biologiques (ci-dessus citées) faibles comparativement aux extraits de Bridelia ferruginea, de Pseudocedrela kotschyi et de Polygonum senegalensis. L'ensemble des résultats tant sur le plan chimique que biologique met en évidence les potentialités des extraits de plantes étudiées, pour une exploitation à des fins thérapeutiquesfutures. / The present work had reported on the phytochemical and biological studies of non-volatile extracts of four plants used in Benin for diabetes treatment. The first part reviewed the bibliography of investigated plants in our study. In this part, the systematic, the importance in the pharmacopoeia and the previous works done on these plants were presented. The second part has presented the extraction method and chemical studies of the extracts and results obtained. The spectrophotometry has permitted to identify some important families of compounds in the extracts: the total polyphenols, flavonoids and tannins whereas the GC / MS and LC/MS were used to highlight the presence of volatile and non-volatile compounds. The third part described the biological tests in vitro and ex vitro carried out on the extracts. The extracts showed in general activities: α-glucosidase inhibition, antioxidant (DPPH, FRAP, ORAC), antimicrobial, and one of them (Bridelia ferruginea) were cytotoxic on cancer cells (PA1, MCF7, PC3, DU-145), with a variable efficiency from one plant to another. The fourth part had discussed in general about the results obtained from phytochemical studies and biological tests. Among the four plants samples selected for our study, only the semi-alcoholic extract of Ceiba pentandra roots had a low-dosed compounds families and presented of this biological activities (cited below) low comparatively to Bridelia ferruginea, Pseudocedrela kotschyi and Polygonum senegalensis extracts. Both of the chemical and biological results highlight the potential of certain species for future exploitation of their non-volatile extract for therapeutic purposes.