Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’α-synucléine est une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson qui forme des agrégats fibrillaires pathologiques. Une séquence précise de 12 acides aminés est essentielle pour que le phénomène d’agrégation ait lieu. Le peptide correspondant à cette séquence (noté α-syn71-82) a été synthétisé et étudié par dichroïsme circulaire, spectroscopie infrarouge et RMN solide du 31P, afin de mieux comprendre sa structure, ses interactions membranaires ainsi que son mécanisme de fibrillation. Les résultats montrent que le peptide adopte une conformation majoritairement désordonnée en solution. À haute concentration ou basse température, les chaînes peptidiques s’assemblent de façon réversible en oligomères en formant des feuillets-β intermoléculaires. L’α-syn71-82 interagit fortement avec les membranes anioniques mais n’interagit pratiquement pas avec les membranes zwitterioniques. Grâce aux interactions électrostatiques entre le peptide chargé positivement et les membranes chargées négativement, le peptide semble adopter une structure en feuillets-β parallèles et agrégés.

Les peptides et les protéines font partie intégrante de l'arsenal dont l'évolution a pourvu les êtres vivants. Plusieurs fonctions essentielles d'un organisme, tel le transport ionique, dépendent d'ailleurs de leur implication. Les protéines-canal sont ubiquitaires chez tous les êtres vivants et pourtant, plusieurs questions non résolues sont soulevées quand on pense à leur mécanisme d'action et plus précisément à la relation qui existe entre leur structure et leur activité. Puisque l'étude des protéines-canal s'avère très complexe et laborieuse, plusieurs ont cherché à les étudier indirectement en développant, par exemple, des modèles synthétiques. Ce mémoire présente une catégorie unique de peptides développés par le groupe Voyer et constitués exclusivement de leucines et de 21-couronne-7-L-phénylalanines. La structure du peptide a été conçue spécialement pour qu'il puisse effectuer du transport ionique membranaire et servir de modèle dans l'étude des protéines-canal. Le peptide a été caractérisé de façon exhaustive au cours des vingt dernières années et les études ont bien établi sa conformation et démontré sa capacité à effectuer du transport membranaire sans, toutefois, lever le voile sur le mécanisme par lequel il opère. Afin d'y voir plus clair et d'en apprendre davantage sur leur mécanisme d'action, les travaux qui sont décrits dans les pages suivantes portent sur la caractérisation par dichroïsme circulaire orienté de la structure et de la topologie membranaire des peptides du groupe Voyer.

Une série de chiroporphyrines bridées et leurs complexes métalliques, dans lesquels les substituants méso adjacents, dérivés du biocartol, sont liés deux à deux par une bride de n groupements méthylènes, a été préparée. Ces composés peuvent exister sous la forme de quatre atropoisomères (alpha-alpha-alpha-alpha, alpha-beta-alpha-beta, alpha-alpha-alpha-beta ou alpha-alpha-beta-beta) suivant que les substituants méso sont orientés au-dessus (alpha) ou en dessous (beta) du plan moyen de la porphyrine. Nous avons caractérisé la conformation de ces porphyrines chirales à l'aide de plusieurs techniques spectroscopiques : résonance magnétique nucléaire du proton, dichroïsme circulaire électronique, et dichroïsme circulaire vibrationnel. Ces deux dernières techniques se sont révélées particulièrement utiles pour la caractérisation conformationnelle des métallochiroporphyrines paramagnétiques. La chiroporphyrine comportant les brides les plus courtes (n = 8), ainsi que son complexe de zinc, peuvent être isolés à l'état solide sous la forme de l'atropoisomère alpha-alpha-alpha-alpha mais en solution ils sont soumis à des équilibres conformationnels aboutissant à des distributions d'atropoisomères qui dépendent fortement du solvant et de la concentration. L'addition de pipéridine en position axiale sur le complexe de zinc a une influence importante sur la distribution des atropoisomères. Inspirés par cette remarquable flexibilité conformationnelle, nous avons tenté de contrôler la forme moléculaire de quelques complexes métalliques dans cette série par plusieurs méthodes. Nos résultats démontrent qu'il est possible d'induire des changements conformationnels de grande ampleur (alpha-alpha-alpha-alpha ↔ alpha-beta-alpha-beta) dans les complexes de nickel(II) et de manganèse(II/III) par application d'un signal chimique ou rédox qui modifie l'occupation de l'orbitale stéréochimiquement active 3dx2-y2. Les basculements conformationnels observés sont réversibles. La bistabilité moléculaire que nous avons mise en évidence dans ces systèmes est potentiellement intéressante pour la conception de dispositifs nanoélectroniques tels que les mémoires moléculaires non volatiles.

Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures non canoniques d'acides nucléiques formées par des séquences d'ADN ou d'ARN contenant des blocs de guanines. In vivo, ces structures pourraient être impliquées de façon transitoire dans de nombreux processus cellulaires, en particulier au niveau des télomères. Dans ce dernier cas, la formation de G4 aux télomères au moyen de ligands favorisant ces structures pourrait limiter la prolifération de cellules tumorales. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé une méthode de criblage à moyen débit permettant de tester l'effet de diverses molécules sur la stabilisation du G4 télomérique humain. Cette méthode, basée sur la dénaturation thermique de G4 suivie en fluorescence, en présence d'autres structures compétitrices d'ADN, a permis d'identifier plusieurs familles de ligands présentant des affinités et des sélectivités intéressantes, tels que des dérivés macrocycliques de néomycine et des N-méthylbisquinolinium phénanthrolines. Nous avons ensuite caractérisé plus précisément les mécanismes moléculaires expliquant la stabilisation des G4 par divers ligands. L'étude cinétique sur un modèle de G4 tétramoléculaire a permis de mettre en évidence la possibilité d'une accélération importante de la vitesse d'association des G4 par certaines familles de composés. Nous avons également analysé l'inhibition de la télomérase en présence de ces ligands. En utilisant un test d'extension d'amorce par la télomérase, nous avons montré que seuls certains ligands étaient capables d'enrayer l'élongation par la télomérase sur un substrat ne formant pas initialement de G4 intramoléculaire. Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle les effets cellulaires de ces ligands ne sont pas uniquement corrélés à leur effet sur la télomérase, mais aussi à des effets connexes impliquant d'autres protéines télomériques, essentielles au maintien de télomères fonctionnels. Enfin, nous avons transposé cette stratégie de ciblage du télomère pour limiter la prolifération cellulaire, à l'agent pathogène responsable de la Malaria : Plasmodium falciparum. Nous avons montré l'existence d'une extrémité télomérique 3' sortante chez le parasite et son potentiel repliement en G4 dans des conditions physiologiques. Plusieurs molécules stabilisant les G4 télomériques du parasite avec une bonne sélectivité ont été identifiées, et leur impact sur sa prolifération a été testé.

La protéine FUR (Ferric Uptake Regulator) est un régulateur global ubiquitaire chez les bactéries Gram-négatives. Sa liaison au Fe2+, in vivo, entraîne la répression de l'expression des gènes qu'elle contrôle. Ce travail est une étude structurale par RMN de la forme dimérique non activée de FUR d'Escherichia coli, un dimère de 2*17 kDa contenant un ion zinc par monomère. Une forme monomérique oxydée, capable de dimériser en présence de réducteur et de zinc, a également été isolée et étudiée. Le dichroïsme circulaire et la RMN montrent que la dimérisation entraîne une structuration du domaine C-terminal lors de l'incorporation du zinc. Les structures secondaires du domaine N-terminal du monomère et du dimère sont très proches. Seuls les premiers résidus sont structurés en hélice Α dans le monomère et déstructurés dans le dimère non activé. Cette hélice, observée dans le dimère activé de FUR de P. aeruginosa, pourrait jouer un rôle dans le mécanisme de régulation. Une protéine tronquée (FUR1-82) a été construite, purifiée, cristallisée. Sa structure est superposable à celle du domaine N-terminal de FUR de P. aeruginosa et le spectre 1H-15N-HSQC est superposable aux signaux du domaine N-terminal de FUR monomère. L'étude, par anisotropie de fluorescence, de la liaison du monomère et du dimère à l'ADN montre qu'ils se lient spécifiquement à l'ADN en présence de métal, contrairement à la forme tronquée. L'affinité du monomère pour l'ADN est 5 fois plus faible que celle du dimère en excès de métal. L'ensemble de ces données nous a permis de proposer un mécanisme de dimérisation de FUR d'E. coli ainsi qu'un mécanisme d'activation mettant en jeu cette hélice Α N-terminale.

L'objectif principal de cette thèse est l'étude spectroscopique de molécules ou de complexes portant plusieurs centres chiraux en phase gazeuse, pour comprendre les effets de la stéréochimie sur leurs propriétés structurales. Des alcaloïdes dérivés de la Cinchonine ont été introduits intacts en phase gazeuse par ablation laser. Ils ont été étudiés en combinant un jet supersonique avec de la spectroscopie laser. Les deux pseudo-énantiomères Quinine et Quinidine ont montré des spectres électroniques et vibrationnels similaires, en accord avec leur structure similaire. Leurs propriétés en solution diffèrent davantage, comme le montrent les expériences de dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD). Cette différence est encore plus marquée dans l'Hydroquinine et l'Hydroquinidine. Enfin la reconnaissance chirale a été étudiée dans des complexes ioniques dans un piège à ions. La stabilité des complexes formés entre S-camphre et les R et S-Alanine protonées indique une préférence homochirale. Cependant, l'énergie d'interaction calculée ainsi que les spectres IRMPD dans la région des empreintes digitales sont identiques. Le rôle des conformères plus hauts en énergie dans la reconnaissance chirale a été discuté.

Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) est une protéine cytosolique dont le rôle est de réguler la concentration de fer intracellulaire chez les métazoaires par un mécanisme post-transcriptionnel. Elle interagit avec certains ARN messagers au niveau de motifs spécifiques appelés IRE (Iron Responsive Element) situés dans leurs régions non traduites et modifie la synthèse des protéines correspondantes. En présence de fer, IRP1 perd cette capacité de fixation, intègre un agrégat [4Fe-4S] et acquiert une activité aconitase. La régulation s'effectue donc par un processus d'assemblage et de désassemblage du centre fer-soufre.<br />La réactivité de la protéine recombinante IRP1 humaine, purifiée sous sa forme aconitase [4Fe-4S], a été étudiée vis à vis d'autres effecteurs que le fer capables de modifier l'activité des IRP. Ainsi des excès assez modestes de diverses espèces réactives de l'oxygène ne peuvent former que l'espèce [3Fe-4S] de la protéine. La doxorubicine, un composé cytostatique utilisé comme anti-cancéreux, a une action sur IRP1, mais elle dépend des conditions d'application et implique certainement des mécanismes multiples. In vitro, IRP1 est complètement activée pour la fixation d'ARN par un fort excès de 2-mercaptoéthanol. Parmi les diverses causes possibles de cet effet, les propriétés de solvant de ce produit (comme de l'éthanol) en sont responsables.<br />La recherche d'éventuels partenaires physiologiques de la protéine IRP1 a été entreprise par une étude double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae, mais les constructions utilisées n'ont pas permis de déterminer de candidats potentiels. L'utilisation d'autres constructions ainsi que d'autres systèmes double hybride est envisagée pour la poursuite de cette étude.<br />Une nouvelle méthode de dosage de l'activité de fixation au motif IRE a été envisagée par l'utilisation d'un substrat fluorescent et de l'électrophorèse capillaire. Les résultats préliminaires obtenus n'ont pas encore abouti, mais ils contribuent à donner des orientations pour le développement de cette méthode présentant de nombreux avantages.<br />Des changements de conformation entre les deux formes actives de IRP1 ont été analysés par deux méthodes structurales en solution. La formation de certains éléments de structure secondaire d'IRP1 dépend de l'état d'activité de la protéine et ils sont sensibles à la fixation des substrats. Les propriétés hydrodynamiques d'IRP1 varient aussi lors de ces différents changements. Faute de structure à haute résolution, ces informations permettent toutefois de se représenter le comportement structural d'IRP1 dans son rôle de régulateur.

La spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) est une des techniques fondamentales en biologie structurale qui permet la détermination du contenu en structures secondaires d'une protéine. Le rayonnement synchrotron a considérablement augmenté l’utilité de la méthode, car il permet de travailler avec une gamme spectrale étendue et à meilleure intensité. Le développement de modèles permettant d’établir une relation entre la structure d’une protéine et son spectre CD d’une manière efficace n’a pourtant pas suivi l’évolution technique et l’analyse de spectres CD de protéines entières reste un défi sur le plan théorique. Dans ce contexte, nous avons développé un modèle "minimaliste" pour la spectroscopie CD des protéines, où chaque atome C-alpha de la chaîne principale porte un oscillateur de Lorentz classique, i.e. une charge mobile qui est tenue par un potentiel quadratique. Les oscillateurs sont couplés par un potentiel coulombien et leurs déplacements suivent les tangentes locales respectives de la courbe spatiale décrite par les atomes C-alpha. Le système d'oscillateurs est couplé à une onde électromagnétique plane décrivant la source de lumière et le phénomène d'absorption est modélisé par des forces de friction. Nous montrons que le modèle reproduit correctement le phénomène CD d'une chaîne polypeptidique hélicoïdale et en particulier son signe en fonction de l'orientation de la chaîne. Comme première application, nous présentons l'ajustement du modèle au spectre CD d'un polypeptide composé de 15 résidus qui se plie sous forme d'une hélice alpha. La transférabilité de ces paramètres est ensuite évaluée pour la myoglobine, une protéine de 153 résidus contenant 8 hélices alpha. / Circular dichroism (CD) spectroscopy is one of the fundamental techniques in structural biology that allows us to investigate the secondary structure of proteins. Synchrotron radiation has considerably increased the usefulness of the method because it allows to work with a wider range of spectrum and much greater signal-to-noise ratios. The development of a theoretical model to establish a relationship between the structure of a protein and its CD spectra in an efficient manner proved to be a complex task. The calculation of the CD spectra of large molecules, such as protein, remains a challenge, due to the size and flexibility of the molecules. In this context, we have developed a “minimal” model to explain the CD spectroscopy of proteins, which associates each C-alpha position on the protein backbone with a classical Lorentz oscillator i.e. a mobile charge attaches to a corresponding atom by a quadratic potential. The coupling between charges is through the Coulomb potential and their displacements follow the direction of the respective local tangents to the Calpha space curve. This system is coupled to a planar electromagnetic wave describing the light source and the absorption phenomenon is modeled by frictional forces. We show that the model correctly reproduces the CD phenomenon of a helical polypeptide chain and in particular its sign depending on the orientation of the chain. At first, we have fitted a model to CD spectra of a polypeptide chain of 15 residues folded into alpha helix. The transferability of these parameters is then evaluated with myoglobin, a protein of 153 residues containing eight alpha helices.

Les cryptophanes constituent une famille de molécules chirales qui comportent une cavité dans laquelle elles peuvent accueillir des espèces invitées de taille et de nature variables (halogénométhanes, xénon, cations). Nous nous sommes intéressés aux propriétés d’encapsulation présentées par trois espèces solubles dans l’eau : le cryptophane-A hexa-hydroxyle, le cryptophane-A penta-hydroxyle et le cryptophane-A hexa-acide carboxylique. La chiralité de ces systèmes a été utilisée pour en étudier les propriétés de complexation au moyen de techniques chiroptiques : la polarimétrie, le dichroïsme circulaire électronique (ECD) et le dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD), cette dernière technique étant associée à des calculs de chimie théorique. Les effets de différents paramètres, tels que le pH de la solution et la nature des contre-ions, sur la complexation de molécules invitées ont été analysés. Les modifications conformationnelles induites sur les cryptophanes lors de l'encapsulation ont également été déterminées. De plus, des propriétés d'énantiodiscrimination de ces cryptophanes hydrosolubles énantiopurs vis-à-vis de petites molécules invitées chirales ont été mises en évidence. Enfin, ces cryptophanes ont montré une affinité exceptionnelle pour le cation césium Cs+ en solution aqueuse. Ces deux derniers résultats permettent d’envisager des applications intéressantes de ces systèmes en chromatographie chirale d’une part, et en chimie de l’environnement pour la détection de césium radioactif d’autre part. / Cryptophanes derivatives are a family of chiral molecules containing a cavity which enables them to encapsulate guest species with variable size and nature (halogenomethanes, xenon, cations). We have been interested in the encapsulation properties of three different water soluble cryptophanes: hexa-hydroxyl cryptophane-A, penta-hydroxyl cryptophane-A and hexa-carboxylic acid cryptophane-A. The chirality of these systems have been exploited to study their complexation properties using chiroptical techniques: polarimetry, electronic circular dichroism (ECD) and vibrational circular dichroism (VCD), the latter being associated with theoretical calculations. The effects of different parameters such as the pH of the solution and the nature of the counter-ions on the complexation of guest molecules have been analyzed. The conformational changes induced on the cryptophanes upon encapsulation have been also determined. In addition, enantiodiscrimination properties of these enantiopure water soluble cryptophanes toward small chiral guest molecules have been evidenced. Finally, these cryptophanes have shown an exceptional affinity for the cesium cation Cs+ in aqueous solution. These last two results allow to consider interesting applications of these systems in chiral chromatography and environmental chemistry, in particular for the detection of radioactive cesium, respectively.