ALENCAR, Rafael Silva. Estudo de fônons em nanotubos de carbono e dissulfeto de molibdênio: efeito do acoplamento entre camadas. 2016. 116 f. Tese (Doutorado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2016-07-04T18:55:57Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rsalencar.pdf: 15208196 bytes, checksum: 0879a7d3b08f7d02d899e3d78888e828 (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2016-07-04T18:56:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rsalencar.pdf: 15208196 bytes, checksum: 0879a7d3b08f7d02d899e3d78888e828 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-04T18:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rsalencar.pdf: 15208196 bytes, checksum: 0879a7d3b08f7d02d899e3d78888e828 (MD5) Previous issue date: 2016 / In this work we present the studies on Double (DWCNTs) and Triple Wall Carbon Nanotubes, on molybdenum disulfide in the bulk form and on few layer of MoS_2 under hydrostatic high pressure conditions. Theoretical calculations were performed in collaboration to support the experimental results. For the DWCNTs samples, changes in the G-band frequency vs. pressure plot and the disappearance of the radial breathing modes (RBM) between 2 GPa and 5 GPa indicate the beginning and ending of the radial collapse of the nanotubes. Theoretical calculations based on Density-Functional Tight-Binding (DFTB) shown that the collapse pressure (P_c) for DWCNTs follows a d^{-3}_{in} law, in excellent agreement with the experimental results. The P_c dependence on number of tube-walls and on the inter-wall distance is also investigated. For the TWCNTs samples, pressure screening effects are observed for the innermost tubes of TWCNTs similar to what has been already found for DWCNTs. However, using the RBM pressure coefficients in conjunction with the histogram of the diameter distribution, we were able to separate the RBM Raman contribution related to the intermediate tubes of TWCNTs from that related to the inner tubes of DWCNTs. By combining Raman spectroscopy and high pressure measurements, it was possible to identify these two categories of inner tubes even if the two tubes exhibit the same diameters, since their pressure response is different. Furthermore, it was possible to observe similar RBM profiles of the innermost tubes of TWCNTs using different resonance laser energies but also under different pressure conditions. This is attributed to changes in the electronic transition energies caused by small pressure-induced deformations. Theoretical calculations based on ab initio were performed for support the experimental results. By using Raman spectroscopy, it was possible to estimate the displacement of the optical energy levels with pressure. For the exfoliated MoS_2 samples, we studied the effect of the stacking on the E^1_{2g} and A_{1g} vibrational modes at high pressures. New components for both modes were observed with increasing pressure. It was also observed that the pressure coefficient of the E^1_{2g} mode decreases exponentially with MoS_2 thickness is increased, differently of the A_{1g} mode and the new components, which do not present a significant dependence on the variation of the number of layers. These results were attributed to deformations in the MoS_2 structure induced by a biaxial strain (dependent on the number of layers), resulting from the deformation of the SiO_2 substrate. Such adhesion decreases with the increasing of the MoS_2 thickness due to the increasing on the unbinding regions between MoS_2 and SiO_2. As result, a higher pressure is needed to improve the adhesion and consequently, a higher pressure is required to achieve the biaxial strain. For the MoS_2 microcrystalline powder, except for the B_{1u}, E^2_{2g}, E_{1g}, E^1_{2g} and A_{1g} modes, the behavior of all other modes was studied for the first time in high pressure conditions. For all modes, a linear variation of the Raman frequency and positive pressure coefficient was observed. Moreover, the differences in the behavior of the intensity profiles of the A_{1g}, 2LA(M) and A_{2u} modes in resonance and off-resonance were attributed to variations in the energy of direct optical transitions induced by pressure. / Nesta Tese apresentamos os estudos de espectroscopia Raman em condições extremas de pressão hidrostática realizados em nanotubos de carbono de parede dupla (DWCNTs) e tripla (TWCNTs), em dissulfeto de molibdênio na forma bulk e em poucas camadas. Cálculos teóricos foram usados para dar suporte aos resultados experimentais. Para as amostras de DWCNTs, as mudanças no coeficiente de pressão da banda G e o desaparecimento dos modos de respiração radial (RBMs) entre 2 GPa e 5 GPa foram interpretados como um indicativo do início e fim do colapso radial dos nanotubos de carbono (CNTs). Os cálculos teóricos usando Tight-Binding baseado no Funcional da Densidade (DFTB) mostraram que a pressão de colapso (P_c) para os DWCNTs segue uma lei de potência do tipo d^{-3}_{in}, em excelente acordo com os resultados experimentais. A dependência de P_c em relação ao número de paredes do tubo, como também a distância inter-paredes também foram investigadas. Para a amostra contendo TWCNTs, através da análise dos coeficientes de pressão dos modos RBMs em conjunto com o histograma da distribuição de diâmetros da amostra, foi possível separarmos as contribuições dos RBMs nos espectros Raman relacionados aos tubos internos dos TWCNTs e DWCNTs, embora possuam a mesma distribuição de diâmetro, a resposta das propriedades vibracionais à pressão são diferentes. Adicionalmente, foi possível observar perfis de intensidades semelhantes para os modos RBMs dos tubos mais internos dos TWCNTs usando diferentes energias de LASER, mas sob diferentes condições de pressão. Atribuímos este resultado à mudanças nas energias de transições eletrônicas causadas por pequenas deformações estruturais nos nanotubos induzidas pela pressão. Cálculos teóricos baseados em ab initio foram realizados para dar suporte às interpretações dos resultados experimentais. Para as amostras de MoS_2 esfoliadas, estudamos o efeito do empilhamento nos modos vibracionais E^1_{2g} e A_{1g} em altas pressões. Novas componentes para esses modos foram observadas com o aumento da pressão. Foi também observado que o coeficiente de pressão do modo E^1_{2g} diminui exponencialmente com o aumento do número de camadas, diferentemente do modo A_{1g} e das novas componentes, que não apresentam uma dependência significativa com a variação da espessura do MoS_2. Atribuímos estes resultados às deformações estruturais do MoS_2 induzidas por uma tensão biaxial (dependente da adesão entre SiO_2 e MoS_2) resultante da deformação do substrato de SiO_2. O aumento do número de camadas diminui a adesão entre o MoS_2 e o SiO_2 devido ao aumento da porcentagem de regiões em não-contato com o substrato, e como consequência, uma pressão mais elevada é necessária para aumentar a adesão, resultando no aumento da pressão para deformar a estrutura do MoS_2. Para o pó microcristalino de MoS2, com exceção dos modos B_{1u}, E^2_{2g}, E1g, E^1_{2g} e A_{1g}, o comportamento de todos os outros modos foi também estudado em condições de altas pressões hidrostáticas. Todos os modos apresentaram uma variação linear de suas frequências Raman com a pressão e coeficientes de pressão positivos. Além disso, as diferenças no comportamento dos perfis de intensidade dos modos A_{1g}, 2LA(M) e A_{2u} em ressonância e fora de ressonância foram interpretados como sendo devido às variações nas energias das transições ópticas direta induzidas pela pressão.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Petiveria alliacea L. é uma planta pertencente à família Phytolaccaceae, conhecida popularmente no país como guiné, erva-de-alho, erva-tipi ou amansa-senhor. Nativa da Região Amazônica tem sido cultivada em muitas áreas tropicais com propósito medicinal ou ritualístico. O objetivo desse trabalho foi (i) o desenvolvimento e a multiplicação de plantas de P. alliacea L. através de métodos de cultura de tecidos, e monitoramento fitoquímico das culturas, e (ii) avaliação comparativa das potencialidades genotóxica e antigenotóxica entre plantas coletadas no campo e produzidas in vitro. Exemplares de diferentes populações ocorrentes no estado do Rio de Janeiro foram utilizados como matrizes para a cultura. Foi estabelecido um protocolo para multiplicação das plantas em meio MS suplementado com BAP e ANA em diferentes concentrações e combinações, que forneceu como melhor resultado em média 8 plantas por explante na concentração de BAP 4,4 μM + ANA 0,54 μM. A análise fitoquímica foi baseada em métodos cromatográficos de diferentes extratos de plantas de campo e plantas in vitro das populações estudadas resultando em diferentes substâncias identificadas nas amostras analisadas por cromatografia em camada delgada. Os extratos foram também avaliados por cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massas, sendo identificadas diferentes substâncias, entre as quais o dibenzil dissulfeto, um produto de degradação de tiosulfinatos com importantes atividades biológicas na defesa das plantas. Os extratos aquosos das plantas de campo e daquelas estabelecidas in vitro foram submetidos à avaliação da potencialidade genotóxica e antigenotóxica, usando-se como modelo o DNA plasmidial pUC 9.1. Os resultados demonstraram que as concentrações utilizadas do extrato aquoso foram capazes de induzir alterações na conformação estrutural do DNA, indicando a ocorrência de quebras simples e duplas nesta molécula. Observou-se também que as lesões aumentaram, proporcionalmente ao aumento da concentração dos extratos, caracterizando-se, assim, um efeito dose-resposta. Os dados também apontaram para um efeito protetor do extrato aquoso, em relação aos danos oxidativos causados pelo cloreto estanoso, indicando, também, uma potencialidade antigenotóxica do extrato aquoso. / Petiveria alliacea L. popularly known in Brazil as Guiné, Amansa-senhor or Tipi belongs to the Phytolaccaceae family. Native from the Amazon region, it has been cultivated in many tropical areas for medicinal or ritualistic purposes. The aim of this study was: i) the development and multiplication of plants of P. alliacea L. through tissue culture methods as well as monitoring phytochemical cultures; ii) comparative assessment of genotoxic and antigenotoxic potentialities between field collected and in vitro grown plants. Specimens from different populations occurring in the state of Rio de Janeiro were used as matrices for the culture. It was established a protocol for propagation in MS medium supplemented with different BAP + ANA concentrations and combinations whose best result (BAP 4,4 μM + ANA 0,54 μM) provided 8 plants per explant in average. The phytochemical analysis was based on chromatographic methods of different extracts both of field and in vitro plant populations resulting in different substances identified through the Thin-layer chromatography analyzing samples. The extracts were also assayed by cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massas having identified various substances, including the dibenzyl disulfide, a degradation tiosulfinatos product with important function in plant defense and increasing use by the pharmaceutical industry. Field and in vitro plant aqueous extracts were evaluated for genotoxic and antigenotoxic potentialities using PUC 9.1 plasmid DNA. These results showed changes in the DNA structural conformation indicating the occurrence of single and double strand breaks induced by the extracts in a dose-response way. Finally, data also pointed to a protective effect of aqueous extract against stannous chloride oxidative damage, characterizing an antigenotoxic potentiality of aqueous extract.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Petiveria alliacea L. é uma planta pertencente à família Phytolaccaceae, conhecida popularmente no país como guiné, erva-de-alho, erva-tipi ou amansa-senhor. Nativa da Região Amazônica tem sido cultivada em muitas áreas tropicais com propósito medicinal ou ritualístico. O objetivo desse trabalho foi (i) o desenvolvimento e a multiplicação de plantas de P. alliacea L. através de métodos de cultura de tecidos, e monitoramento fitoquímico das culturas, e (ii) avaliação comparativa das potencialidades genotóxica e antigenotóxica entre plantas coletadas no campo e produzidas in vitro. Exemplares de diferentes populações ocorrentes no estado do Rio de Janeiro foram utilizados como matrizes para a cultura. Foi estabelecido um protocolo para multiplicação das plantas em meio MS suplementado com BAP e ANA em diferentes concentrações e combinações, que forneceu como melhor resultado em média 8 plantas por explante na concentração de BAP 4,4 μM + ANA 0,54 μM. A análise fitoquímica foi baseada em métodos cromatográficos de diferentes extratos de plantas de campo e plantas in vitro das populações estudadas resultando em diferentes substâncias identificadas nas amostras analisadas por cromatografia em camada delgada. Os extratos foram também avaliados por cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massas, sendo identificadas diferentes substâncias, entre as quais o dibenzil dissulfeto, um produto de degradação de tiosulfinatos com importantes atividades biológicas na defesa das plantas. Os extratos aquosos das plantas de campo e daquelas estabelecidas in vitro foram submetidos à avaliação da potencialidade genotóxica e antigenotóxica, usando-se como modelo o DNA plasmidial pUC 9.1. Os resultados demonstraram que as concentrações utilizadas do extrato aquoso foram capazes de induzir alterações na conformação estrutural do DNA, indicando a ocorrência de quebras simples e duplas nesta molécula. Observou-se também que as lesões aumentaram, proporcionalmente ao aumento da concentração dos extratos, caracterizando-se, assim, um efeito dose-resposta. Os dados também apontaram para um efeito protetor do extrato aquoso, em relação aos danos oxidativos causados pelo cloreto estanoso, indicando, também, uma potencialidade antigenotóxica do extrato aquoso. / Petiveria alliacea L. popularly known in Brazil as Guiné, Amansa-senhor or Tipi belongs to the Phytolaccaceae family. Native from the Amazon region, it has been cultivated in many tropical areas for medicinal or ritualistic purposes. The aim of this study was: i) the development and multiplication of plants of P. alliacea L. through tissue culture methods as well as monitoring phytochemical cultures; ii) comparative assessment of genotoxic and antigenotoxic potentialities between field collected and in vitro grown plants. Specimens from different populations occurring in the state of Rio de Janeiro were used as matrices for the culture. It was established a protocol for propagation in MS medium supplemented with different BAP + ANA concentrations and combinations whose best result (BAP 4,4 μM + ANA 0,54 μM) provided 8 plants per explant in average. The phytochemical analysis was based on chromatographic methods of different extracts both of field and in vitro plant populations resulting in different substances identified through the Thin-layer chromatography analyzing samples. The extracts were also assayed by cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massas having identified various substances, including the dibenzyl disulfide, a degradation tiosulfinatos product with important function in plant defense and increasing use by the pharmaceutical industry. Field and in vitro plant aqueous extracts were evaluated for genotoxic and antigenotoxic potentialities using PUC 9.1 plasmid DNA. These results showed changes in the DNA structural conformation indicating the occurrence of single and double strand breaks induced by the extracts in a dose-response way. Finally, data also pointed to a protective effect of aqueous extract against stannous chloride oxidative damage, characterizing an antigenotoxic potentiality of aqueous extract.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Nesta Tese apresentamos os estudos de espectroscopia Raman em condiÃÃes extremas de pressÃo hidrostÃtica realizados em nanotubos de carbono de parede dupla (DWCNTs) e tripla (TWCNTs), em dissulfeto de molibdÃnio na forma bulk e em poucas camadas. CÃlculos teÃricos foram usados para dar suporte aos resultados experimentais. Para as amostras de DWCNTs, as mudanÃas no coeficiente de pressÃo da banda G e o desaparecimento dos modos de respiraÃÃo radial (RBMs) entre 2 GPa e 5 GPa foram interpretados como um indicativo do inÃcio e fim do colapso radial dos nanotubos de carbono (CNTs). Os cÃlculos teÃricos usando Tight-Binding baseado no Funcional da Densidade (DFTB) mostraram que a pressÃo de colapso (P_c) para os DWCNTs segue uma lei de potÃncia do tipo d^{-3}_{in}, em excelente acordo com os resultados experimentais. A dependÃncia de P_c em relaÃÃo ao nÃmero de paredes do tubo, como tambÃm a distÃncia inter-paredes tambÃm foram investigadas. Para a amostra contendo TWCNTs, atravÃs da anÃlise dos coeficientes de pressÃo dos modos RBMs em conjunto com o histograma da distribuiÃÃo de diÃmetros da amostra, foi possÃvel separarmos as contribuiÃÃes dos RBMs nos espectros Raman relacionados aos tubos internos dos TWCNTs e DWCNTs, embora possuam a mesma distribuiÃÃo de diÃmetro, a resposta das propriedades vibracionais à pressÃo sÃo diferentes. Adicionalmente, foi possÃvel observar perfis de intensidades semelhantes para os modos RBMs dos tubos mais internos dos TWCNTs usando diferentes energias de LASER, mas sob diferentes condiÃÃes de pressÃo. AtribuÃmos este resultado à mudanÃas nas energias de transiÃÃes eletrÃnicas causadas por pequenas deformaÃÃes estruturais nos nanotubos induzidas pela pressÃo. CÃlculos teÃricos baseados em ab initio foram realizados para dar suporte Ãs interpretaÃÃes dos resultados experimentais. Para as amostras de MoS_2 esfoliadas, estudamos o efeito do empilhamento nos modos vibracionais E^1_{2g} e A_{1g} em altas pressÃes. Novas componentes para esses modos foram observadas com o aumento da pressÃo. Foi tambÃm observado que o coeficiente de pressÃo do modo E^1_{2g} diminui exponencialmente com o aumento do nÃmero de camadas, diferentemente do modo A_{1g} e das novas componentes, que nÃo apresentam uma dependÃncia significativa com a variaÃÃo da espessura do MoS_2. AtribuÃmos estes resultados Ãs deformaÃÃes estruturais do MoS_2 induzidas por uma tensÃo biaxial (dependente da adesÃo entre SiO_2 e MoS_2) resultante da deformaÃÃo do substrato de SiO_2. O aumento do nÃmero de camadas diminui a adesÃo entre o MoS_2 e o SiO_2 devido ao aumento da porcentagem de regiÃes em nÃo-contato com o substrato, e como consequÃncia, uma pressÃo mais elevada à necessÃria para aumentar a adesÃo, resultando no aumento da pressÃo para deformar a estrutura do MoS_2. Para o pà microcristalino de MoS2, com exceÃÃo dos modos B_{1u}, E^2_{2g}, E1g, E^1_{2g} e A_{1g}, o comportamento de todos os outros modos foi tambÃm estudado em condiÃÃes de altas pressÃes hidrostÃticas. Todos os modos apresentaram uma variaÃÃo linear de suas frequÃncias Raman com a pressÃo e coeficientes de pressÃo positivos. AlÃm disso, as diferenÃas no comportamento dos perfis de intensidade dos modos A_{1g}, 2LA(M) e A_{2u} em ressonÃncia e fora de ressonÃncia foram interpretados como sendo devido Ãs variaÃÃes nas energias das transiÃÃes Ãpticas direta induzidas pela pressÃo. / In this work we present the studies on Double (DWCNTs) and Triple Wall Carbon Nanotubes, on molybdenum disulfide in the bulk form and on few layer of MoS_2 under hydrostatic high pressure conditions. Theoretical calculations were performed in collaboration to support the experimental results. For the DWCNTs samples, changes in the G-band frequency vs. pressure plot and the disappearance of the radial breathing modes (RBM) between 2 GPa and 5 GPa indicate the beginning and ending of the radial collapse of the nanotubes. Theoretical calculations based on Density-Functional Tight-Binding (DFTB) shown that the collapse pressure (P_c) for DWCNTs follows a d^{-3}_{in} law, in excellent agreement with the experimental results. The P_c dependence on number of tube-walls and on the inter-wall distance is also investigated. For the TWCNTs samples, pressure screening effects are observed for the innermost tubes of TWCNTs similar to what has been already found for DWCNTs. However, using the RBM pressure coefficients in conjunction with the histogram of the diameter distribution, we were able to separate the RBM Raman contribution related to the intermediate tubes of TWCNTs from that related to the inner tubes of DWCNTs. By combining Raman spectroscopy and high pressure measurements, it was possible to identify these two categories of inner tubes even if the two tubes exhibit the same diameters, since their pressure response is different. Furthermore, it was possible to observe similar RBM profiles of the innermost tubes of TWCNTs using different resonance laser energies but also under different pressure conditions. This is attributed to changes in the electronic transition energies caused by small pressure-induced deformations. Theoretical calculations based on ab initio were performed for support the experimental results. By using Raman spectroscopy, it was possible to estimate the displacement of the optical energy levels with pressure. For the exfoliated MoS_2 samples, we studied the effect of the stacking on the E^1_{2g} and A_{1g} vibrational modes at high pressures. New components for both modes were observed with increasing pressure. It was also observed that the pressure coefficient of the E^1_{2g} mode decreases exponentially with MoS_2 thickness is increased, differently of the A_{1g} mode and the new components, which do not present a significant dependence on the variation of the number of layers. These results were attributed to deformations in the MoS_2 structure induced by a biaxial strain (dependent on the number of layers), resulting from the deformation of the SiO_2 substrate. Such adhesion decreases with the increasing of the MoS_2 thickness due to the increasing on the unbinding regions between MoS_2 and SiO_2. As result, a higher pressure is needed to improve the adhesion and consequently, a higher pressure is required to achieve the biaxial strain. For the MoS_2 microcrystalline powder, except for the B_{1u}, E^2_{2g}, E_{1g}, E^1_{2g} and A_{1g} modes, the behavior of all other modes was studied for the first time in high pressure conditions. For all modes, a linear variation of the Raman frequency and positive pressure coefficient was observed. Moreover, the differences in the behavior of the intensity profiles of the A_{1g}, 2LA(M) and A_{2u} modes in resonance and off-resonance were attributed to variations in the energy of direct optical transitions induced by pressure.

Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) M-1 s-1, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (Cys53 e Cys56 e Cys397 e Cys400). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDI eram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × 104 M-1 s-1, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a\' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (Cys53- Cys56 e Cys397- Cys400). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (Trp52 Trp396 e Tyr393). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) e hidroxilação (Trp52, Trp396) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas. / Protein disulfide isomerase (PDI) is a ubiquitous dithiol-disulfide oxidoreductase that performs an array of cellular functions, including in cellular signaling and responses to cell-damaging events. Nevertheless, PDI can become dysfunctional by post-translational modifications, including those promoted by biological oxidants. These oxidants are likely responsible for the oxidative post-translational modifications of PDI, which have detected under various conditions associated with oxidative stress, leading to protein dysfunction. However, the kinetics of the reactions of PDI with biological oxidants received limited studies and the products of these reactions were not characterized. Here, we examined whether the decrease in PDI fluorescence can be employed to follow the kinetics of the reaction of the full-length protein with biological oxidants. Also, we investigated the kinetics and products of the reaction between PDI and peroxynitrite. Our experiments showed that oxidation by excess hydrogen peroxide led to a decrease of PDI intrinsic fluorescence in a time- and concentration-dependent manner , permitting the determination of the second-order rate constant of the reaction (k = (17.3 ± 1.3 ) M1 s-1, pH 7.4, 25 ° C). The oxidation was reversed by DDT, indicating that hydrogen peroxide oxidizes mainly PDI dithiols (Cys53 and Cys56 and Cys397 and Cys400). Using the same approach to study PDI oxidation by peroxynitrite we noted that the decrease of the native PDI fluorescence was proportional to sub-stoichiometric or stoichiometric concentrations of the oxidant relative to that of PDI reactive thiols. Only under these conditions, PDI oxidation was reversed by DDT, indicating that PDI dithiols were the preferred target of peroxynitrite but that oxidation of other residues also occurred. The reaction of the active redox thiols of the PDI with peroxynitrite can be considered relatively fast (6.9 ± 0.6 × 104 M-1 s-1, pH 7.4, 25 ° C), and the reactive Cys residues of domains a and a\' were kinetically indistinguishable. Limited proteolysis experiments, kinetic simulations, and MS and MS/MS analyses confirmed that peroxynitrite preferentially oxidizes the redox-active Cys residues of PDI to the corresponding sulfenic acids, which subsequently react with the resolving thiols to produce disulfides (Cys53-Cys56 and Cys397-Cys400). However, a fraction of peroxynitrite decays to radicals leading to hydroxylation and nitration to other residues located close to the active site (Trp52 Trp396 and Tyr393). SDS-PAGE, western blotting and inhibition of the reductase activity experiments confirmed that excess peroxynitrite promotes further PDI oxidation, nitration, inactivation and aggregation in a concentration-dependent manner. MS and MS/MS analyzes showed that peroxynitrite in a ten times excess relative to PDI reactive thiols promote PDI nitration (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) and hydroxylation (Trp52, Trp396). In conclusion, our studies contribute to a better understanding of PDI oxidation by peroxynitrite and its possible biological consequences

O dengue e o dengue hemorrágico são considerados como as arboviroses mais importantes do ponto de vista da saúde pública além de serem também as mais disseminadas. O greening ou huanglongbing (HLB), por sua vez, é uma doença de difícil controle e rápida disseminação que afeta seriamente a produção de citros no mundo todo. É considerada a pior doença de citros da atualidade pois não tem cura e leva ao declínio e morte das árvores em alguns anos. O DMDS é um composto sulfúrico volátil derivado de plantas e que tem despertado um crescente interesse devido a sua comprovada atividade repelente e inseticida além de ação nematicida e disinfectante do solo. Visando oferecer uma alternativa para o controle de ambas as doenças, este trabalho teve como objetivo desenvolver um método de microencapsulação por spray drying e spray congealing para o dimetil dissulfeto (DMDS), visando a redução da sua volatilidade através de uma liberação controlada para o ambiente. Dessa forma, tornar-se-ia viável sua utilização como repelente, larvicida e inseticida no combate ao vetor do dengue além da sua utilização como repelente no controle do greening nas lavouras de citrus. Tentou-se a microencapsulação através de spray congealing utilizando enxofre como microencapsulante mas não se obteve sucesso devido as características térmicas do enxofre. Foram obtidas micropartículas de DMDS microencapsulado em goma arábica através da técnica de spray drying. As micropartículas e o processo de secagem foram caracterizados com relação ao rendimento de secagem, rendimento de microencapsulação, morfologia, teor de água residual, atividade de água, densidades aparente e compactada e propriedades de fluxo. Confirmou-se a possibilidade de microencapsulação de DMDS por spray drying e eficiência da goma arábica na retenção do mesmo. As partículas obtidas apresentaram boas propriedades de atividade de água, teor de água residual e densidade mas propriedades de fluxo que requerem melhoria. Foi feito também um estudo simplificado da viabilidade técnico-econômica da implantação de uma unidade de produção de DMDS microencapsulado. Esse estudo foi baseado no processo de microencapsulação estudado. Foram analisados diversos parâmetros econômicos e através destas análises verificou-se que a produção de DMDS microencapsulado pelo método utilizado seria economicamente viável. / Dengue fever and dengue hemorrhagic fever are not only considered the most important arboviruses from public health standpoint but also the most disseminated ones. Greening or huanglongbing (HLB) is a citrus disease of difficult control and fast dissemination that affects citrus production all over the world. It is considered the worst citrus disease nowadays since it does not have a cure and it causes the decline and death of the trees in a few years. Dimethyl disulfide is a volatile sulphur compound derived from plants and that has aroused growing interest due to its proved repellence and insecticidal activity, soil disinfection and nematocidal properties. Therefore, this work aimed at developing a DMDS microencapsulation method via spray drying and spray congealing in order to decrease DMDS\' volatility through a controlled release to the environment and offer a control alternative to both diseases. This would make DMDS use as a repellent, larvicide and insecticide of dengue fever\'s vector and also its use in greening control as a repellent viable. We tried to microencapsulate the DMDS through spray congealing using sulfur as a microenpsulating agent but it was unsuccessful due to the thermal characteristics of sulfur. DMDS was microencapsulated in Arabic gum through spray drying. Drying yield, microencapsulation yield, morphology of the particles, residual water percentage, water activity, bulk and tapped density and flow properties were used to characterize the microparticles and the drying process. Feasibility of DMDS microencapsulation and Arabic gum efficiency in DMDS retention were confirmed. The microparticles presented good bulk and tapped density, residual water percentage and water activity properties though its flow properties requiring further improvement. A simplified technical-economical evaluation of a DMDS microencapsulation factory was also done. This evaluation was based on the studied microencapsulation process. Many economical parameters were analysed and those analyses showed that DMDS microparticles production using the studied method would be economically viable.

Processos celulares que governam as NADPH oxidases vasculares em condições patológicas não estão claros ainda. Como os processos redox são parte intrínseca da resposta da célula ao estresse, temos investigado se o estresse oxidativo pode convergir com outros tipos de estresse via Nox(es). No presente estudo, focamos na inibição do proteasoma como uma condição relevante de estresse. A incubação de células musculares lisas com concentrações não apoptóticas de inibidores do proteasoma, MG132 e lactacistina, promoveu aumento na produção basal de superóxido e na atividade da NADPH oxidase, diminuição da atividade da SOD e da razão GSH/GSSG. Por outro lado, a inibição do proteasoma diminui a atividade da Nox após estímulo com Angiotensina II ou Tunicamicina, conhecido estressor do retículo endoplasmático. Em condições basais, MG132 induz a expressão de mRNA da Nox1, entretanto o aumento de Nox1 induzido por Angiotensina II foi diminuído na presença de MG132. O mesmo efeito ocorre com a indução de Nox4 pela Tunicamicina, que nesse caso foi drasticamente reduzida na presença de MG132. Além disso, tanto Angiotensina II quanto Tunicamicina induziram a atividade lítica do proteasoma 20S. A seguir, investigamos as conseqüências fisiológicas do MG132 na sinalização do estresse do RE, uma conhecida resposta mediada por Nox4. Células vasculares incubadas com MG132 induzem a expressão de marcadores do estresse do RE, GRP78 e XBP1, e também os marcadores mais tardios ATF4 e o próapoptótico CHOP/GADD153. Resultados similares ocorrem também com a Tunicamicina. Entretanto, a co-incubação de Tunicamicina e MG132 diminui e a sinalização do estresse do RE. AKT e p38 MAPK foram ativados por MG132, possivelmente como resposta ao estresse induzido pela inibição do proteasoma. Assim, a inibição do proteasoma bloqueia a NADPH oxidase, com aumento da atividade basal e expressão da Nox1 versus forte inibição da ativação e expressão da Nox4 frente ao estímulo. A inibição da Nox4 associa-se e pode contribuir para a inibição pelo MG132 da sinalização do estresse do RE. Portanto, o proteasoma parece exercer papel na integração de estresses celulares envolvendo a NADPH oxidase. A inibição do proteasoma pode ter papel na terapia de doenças associadas a estresse do RE. / Cellular processes governing vascular Nox family NADPH oxidases in disease conditions are unclear. Since redox processes are intrinsic to cell stress response, we asked whether oxidative stress merges with other types of stress via Nox(es). We focused on proteasome inhibition as a relevant stress condition. Vascular smooth muscle cells (VSMC) incubation with non-apoptotic concentrations of proteasome inhibitors MG132 or lactacystin promoted increased baseline superoxide generation (HPLC/DHE products) and NADPH oxidase activity, decreased SOD activity and GSH/GSSG ratio. Conversely, proteasome inhibitors decreased by Nox response to Angiotensin II (AngII) and abrogated Nox response to endoplasmic reticulum (ER) stressor tunicamycin. With MG132, basal Nox1 mRNA levels were increased, while Nox1 response to AngII was blunted. Moreover, MG132 abolished Nox4 mRNA levels TN-induced. Both AngII and TN (at 2 and 4 hs) promoted increased 20S proteasome lytic activity. We next assessed physiological consequences of MG132 in ER stress signaling, a known Nox4- mediated response. VSMC incubation with MG132 alone enhanced expression of the ER stress markers Grp78 and XBP1 and late markers such as ATF4 and proapoptotic CHOP/GADD153. Similar results occurred with the known ER stressor TN. However, co-incubation of TN and MG132 decreased Grp78, Grp94 and CHOP/GADD153, indicating that proteasome inhibition interrupts ER stress. AKT and p38 are activated by MG132 as response to stress and recover to survival. Thus, proteasome inhibition disrupts NADPH oxidase, with increased baseline activity and Nox1 expression vs. strong inhibition of stimulated Nox1 and Nox4 activation/expression. The later effect may underlie MG132-mediated inhibition of ER stress signaling. (Support: FAPESP, CNPq Milênio Redoxoma)

INTRODUÇÃO: A ativação da NADPH oxidase de neutrófilos requer o acoplamento das subunidades citosólicas p47phox, p67phox, p40phox e Rac2 ao componente de membrana citocromo b558. Em trabalhos anteriores, nós mostramos que as isoformas vasculares da oxidase são reguladas pela proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona redox. Neste trabalho, nós utilizamos um sistema cellfree semirecombinante como ferramenta para investigar o papel da PDI na ativação da NADPH oxidase do neutrófilo. RESULTADOS: Inibidores da PDI, scrambled RNAse (100g/mL) ou bacitracina (1mM), praticamente suprimiram a geração de superóxido. Para avaliação dos efeitos do estado redox da PDI sobre a atividade da oxidase, amostras de PDI foram previamente oxidadas (H2O2; 0,5 mM) ou reduzidas (DTT; 0,5 mM). A PDI oxidada (100 nM) aumentou a produção de superóxido em aproximadamente 30%, enquanto a mesma concentração de PDI reduzida promoveu efeito inverso, inibindo a atividade do complexo. A adição de um peptídeo contendo a seqüência peptídica do sítio ativo da PDI inibiu a produção de superóxido em 70%. Dados de imunolocalização e colocalização demonstraram que a interação da PDI com a subunidade p47phox parece ser intensificada pelo estímulo com PMA e envolvem modificações do estado redox de ambas as proteínas. CONCLUSÕES: Nossos dados confirmam a associação física e funcional entre a PDI e o complexo NADPH oxidase. Além disso, sugerem que a PDI exerça um importante papel como fator de regulação redox da ativação da oxidase. / Activation of the leukocyte NADPH oxidase requires the assembly of the cytosolic subunits p47phox, p67phox and p40phox and Rac2 with the membranebound cytochrome b558. We have previously shown that the vascular oxidase is regulated by the redox chaperone protein disulfide isomerase (PDI). Taking advantage of the semirecombinant cellfree system, we sought to investigate the role of PDI in the activation of neutrophil NADPH oxidase. The PDI thiol inhibitors scrambled RNase (100g/mL) or bacitracin (1mM), almost suppressed superoxide generation. In order to investigate if the redox status of PDI thiols could modulate superoxide generation, PDI was oxidized or reduced by treatment with H2O2 (0.5mM) or DTT (1mM), respectively. Oxidized PDI increased by 30% superoxide production, while reduced PDI diminished superoxide generation also in 30%. The addition of a peptide (1M) containing PDI´s exact active site sequence inhibited superoxide production by 70 %. Immuno and colocalization data demonstrated the interaction of PDI with the subunit p47phox to be intensified by PMA stimulation and to involve redox status exchange of both proteins. Our data confirm the physical and functional association between PDI and the oxidase complex. Moreover, we show a relevant role for PDI as a redoxdependent supportive factor for NADPH oxidase activation.

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

Orientador: Lázaro Aurélio Padilha Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-02T09:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nagamine_Gabriel_M.pdf: 6846623 bytes, checksum: 1daab6ac65771517c50786728dfce86e (MD5) Previous issue date: 2017 / Resumo: Pontos quânticos coloidais (QDs) ternários de CuInS2 (CIS) surgiram como uma alternativa não tóxica, altamente promissora, aos já bem estabelecidos QDs binários de CdX e PbX (X=Se,S). Além de não possuírem metais pesados em sua composição, esses novos materiais apresentam diversas características desejáveis, o que os torna fortes candidatos a serem aplicados em novas tecnologias, tanto em biologia quanto na geração de nova fontes de energia renovável. Além disso, esses QDs apresentam diversas propriedades ópticas que os diferem radicalmente dos QDs binários já conhecidos e ainda são pouco compreendidas. Dentre elas, podemos citar um largo espectro de fotoluminescência (PL), com decaimentos longos e multi-exponenciais e um espectro de absorção pouco definido, com uma longa cauda que vai para o infravermelho. Adicionalmente, esses nanomateriais apresentam um grande Stokes shift, de até 500 meV, cuja origem ainda é desconhecida e amplamente debatida na literatura. Com o intuito de desvendar os mecanismos por trás dessas propriedades distintas, nesse trabalho, realizamos uma série de estudos da sua dinâmica ultrarrápida e de espectroscopia não-linear para revelar a estrutura eletrônica desses QDs. Das medidas de dinâmica ultrarrápida, mostramos uma maneira alternativa de medir-se o tamanho dessas nanopartículas, por meio da sua seção de choque de absorção em 3,1 eV, que seria independente da variabilidade morfológica apresentada por elas. Adicionalmente, fazendo um estudo da dependência das interações multi-éxciton desses QDs com o tamanho, reportamos que esses nanomateriais apresentam interações Coulombianas reduzidas em relação aos QDs binários já conhecidos. Das medidas de espectroscopia não-linear, mostramos a primeira comprovação experimental de que a transição óptica entre os níveis fundamentais da banda de valência e condução é proibida por paridade em partículas esféricas. Além disso, comparando o espectro de absorção de 2 fótons das amostras estudadas com imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), mostramos que quebras na simetria das funções de onda dos portadores nesses QDs alteram as suas regras de seleção para transições ópticas. Adicionalmente, verificamos que, controlando a composição e tamanho desses QDs, é possível obter seções de choque de 2PA de até 13.500 GM dentro da janela de transparência óptica do tecido do corpo humano / Abstract: Ternary CuInS2 (CIS) Colloidal Quantum Dots (QDs) have emerged as a non-toxic promising alternative to the CdX and PbX (X=Se,S) binary QDs. Besides not having heavy metals on their composition, these new materials show several desirable features, which makes them strong candidates to be applied in new technologies, from biology to the new generation of renewable energy sources. Furthermore, these QDs present various optical properties that radically differs from the already well studied binary QDs and yet are not well understood. Among them, we can cite a large photoluminescence (PL) spectra, with long and multi-exponential decays and a poorly defined absorption spectra, with a long infrared tail. Additionally, these nanomaterials present large Stokes shift, up to 500 meV, whose origin is still not well understood and largely debated on the literature. To reveal the mechanism behind these distinguished properties, here, we perform a series of ultrafast spectroscopy and non-linear spectroscopy studies to reveal the electronic band structure of these QDs. From the ultrafast dynamics measurements, we show an alternative way to measure the size of these nanoparticles, through their absorption cross section in 3,1 eV, which would be independent from the morphologic variability presented by them. Additionally, by performing studies of the size dependent multi-exciton interactions, we report that these kind of nanomaterials present reduced Coulombic interactions in relation to de already known binary QDs. From the non-linear spectroscopy measurements, we show the first experimental confirmation that the optical transition between the electron and hole ground state are parity forbidden in the spherical particles. In addition, comparing the two-photon absorption (2PA) spectra of the studied samples with their transmission electron microscopy images, we show that symmetry breaking of the electronic wave functions in these QDs change their optical transition selection rules. Additionally, we verify that, by controlling the size and composition of these QDs, it is possible to obtain 2PA cross section as high as 13,500 GM inside the transparency window of the human tissue / Mestrado / Física / Mestre em Física / 1547612/2015 / 13/16911-2 / CAPES / FAPESP