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Prostate cancer is the most common non-skin cancer for men in America. The androgen receptor exerts transcriptional activity and plays an important role for the proliferation of prostate cancer cells. Androgen receptor ligands bind the androgen receptor and inhibit its transcriptional activity effectively. However, prostate cancer can progress to hormone refractory prostate cancer (HRPC) to avoid this effect. Chemotherapies are currently the primary treatments for HRPC. Unfortunately, none of the available chemotherapies are curative. Among them, paclitaxel and docetaxel are two of the most effective drugs for HRPC. More importantly, docetaxel is the only form of chemotherapy known to prolong survival in the HRPC patients. We hypothesized that the conjugation of paclitaxel or docetaxel with an androgen receptor ligand will overcome the resistance mechanism of HRPC. Eleven conjugates were designed, synthesized and biologically evaluated. Some of them were active against androgen-independent prostate cancer, but they were all less active than paclitaxel and docetaxel. Discodermolide is a microtubule interactive agent, and has a similar mechanism of action to paclitaxel. Interestingly, discodermolide is active against paclitaxel-resistant cancer cells and can synergize with paclitaxel, which make it an attractive anticancer drug candidate. Understanding the bioactive conformation of discodermolide is important for drug development, but this task is difficult due to the linear and flexible structure of discodermolide. Indirect evidence for the orientation of discodermolide in the tubulin binding pocket can be obtained from fluorescence spectroscopy of the discodermolide tubulin complex. For this purpose, we designed and synthesized a simplified fluorescently labeled discodermolide analog, and it was active in the tubulin assembly bioassay. In addition, a conformationally constrained discodermolide was designed to mimic the bioactive conformation according to computational modeling. The synthetic effort was made, but failed during one of the final steps. / Ph. D.

O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity

O PAWR (Prostate apoptosis response- 4) também conhecido como PAR-4 é um gene pró-apoptótico identificado em células de câncer de próstata quando expostas a estímulos apoptóticos. A expressão de PAR-4 pode aumentar a sensibilidade da célula a apoptose, incluindo células de câncer de mama. Ensaios de expressão gênica por transcriptoma foram realizados em nosso laboratório (dados ainda não publicados), com o objetivo de analisar genes diferencialmente expressos associados à quimiossensibilidade ao docetaxel em células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão para PAR-4 (MCF7pcPAR4) e o com vetor vazio (MCF7pcNEO) antes e após o tratamento com docetaxel. Para avaliar a interação entre os genes diferencialmente expressos foram geradas redes gênicas funcionais utilizando o programa IPA- Ingenuity®. Dentre as diversas redes gênicas geradas destacaram-se as que continham genes relacionados direta ou indiretamente com a via de sinalização WNT (Wingless-Type MMTV Integration 1). O presente estudo visa validar genes diferencialmente expressos identificados em células MCF-7 com diferenças de expressão de PAR-4 antes e após a exposição de docetaxel. Através da anotação manual dos genes mais diferencialmente expressos, foram selecionados os genes EGR1, XAF1, TARP e WNT5A para validação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). A plataforma Human WNT Signaling Pathway RT2 Profiler(TM) PCR Array (PCR Array) foi utilizada para avaliar o efeito da overexpressão de PAR-4 e do tratamento de docetaxel na expressão de genes das vias canônica e não canônica do WNT. A expressão positiva do gene WNT5A nas células MCF7pcPAR4 em relação a MCF7pcNEO foi confirmada por qRT-PCR na ausença e presença do tratamento com docetaxel. O gene EGR1 apresentou regulação positiva significativa na técnica de qRT-PCR na ausência de tratamento, porém não apresenta o mesmo perfil de expressão observado no ensaio de transcriptoma. O gene XAF1 apresentou regulação negativa nas células MCF7pcPAR4 quando comparadas com as células MCF7pcNEO na ausência e presença de docetaxel, com tendência a validação na ausência de tratamento e de não validação na presença de docetaxel. Foi observado o aumento significativo da expressão de TARP nas células MCF7pcPAR4 por qRT-PCR na ausência e presença de docetaxel, porém esses achados não confirmam os resultados obtidos no transcriptoma. Em nossos dados de PCR Array na comparação MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO antes do tratamento, encontramos diferença de expressão significativa (p < 0,005) em 9 genes. Sendo que, os genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 e TWIST apresentaram expressão positiva e os genes NTRK2, SOX2, SOX9 e WISP1 tiveram expressão negativa. Na comparação na presença de docetaxel observamos que os genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 e TWIST apresentaram regulação positiva e FST apresentou regulação negativa com significância estatística (p < 0,005). Dos 84 genes da plataforma PCR array foram observados 21 e 14 genes comuns entre ambas às técnicas na ausência e presença de docetaxel, respectivamente. Na ausência de docetaxel 16 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão, dentre estes a regulação positiva de GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 e TWIST, associadas á regulação negativa de CDH1, JAG1, NTRK2 sugerem ativação da via WNT/?-catenina. Enquanto, a expressão de DAB2, WNT5A, FZD7 e RUNX2 indica inativação dessa via. Na presença do tratamento 6 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão. Dentre estes, a regulação positiva de CTGF, DAB2 e EGR1 sugerem inativação da via WNT/beta-catenina. Por outro lado, a expressão positiva de FGF20, LEF1 e PDGFRA sugerem que via WNT/beta-catenina estaria ativa. Neste estudo, podemos mostrar que PAR-4 modula genes da via de sinalização WNT. Porém, mais experimentos serão necessários para verificar quais mecanismos estão envolvidos e de que forma isso reflete na quimiossensibilidade a drogas / PAWR (Prostate Apoptosis Response-4) also known as PAR-4 is a pro-apoptotic gene identified in prostate cancer cells when exposed to apoptotic stimuli. PAR-4 expression can increase sensitivity of cells to apoptosis, including breast cancer cells. Our laboratory performed transcriptome profiling (unpublished data), with the aim of analyzing differentially expressed genes associated with chemosensitivity to docetaxel in transfected MCF-7 cells with PAR-4 expression plasmid (MCF7pcPAR4) and with empty vector (MCF7pcNEO) before and after treatment with docetaxel. To assess the interaction between the differentially expressed genes functional gene networks were generated using the IPA Ingenuity® software. Networks generated containing genes directly or indirectly related with the WNT signaling pathway (Wingless-Type MMTV Integration 1) were highlighted. The present study aims to validate the differentially expressed genes identified in MCF-7 cells with different PAR-4 expression before and after exposure of docetaxel. By manual annotation of the genes most differentially expressed, the genes EGR1, XAF1, TARP and WNT5A were selected to be validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR). The platform WNT Signaling Pathway Human RT2 Profiler (TM) PCR Array (Array PCR) was used to evaluate the effect of PAR-4 overexpression and docetaxel treatment in gene expression of canonical and noncanonical WNT pathways. The positive expression of WNT5A in MCF7pcPAR4 cells relative to MCF7pcNEO was confirmed by qRT-PCR in the presence and absence of docetaxel. The EGR1 gene showed significant upregulation in the qRT-PCR in the absence of treatment, but showed a different expression profile of the one observed in the transcriptome assay. The XAF1 showed a negative regulation in MCF7pcPAR4 cells when compared with MCF7pcNEO cells in the absence and presence of docetaxel, showing a similar trend in the absence of treatment but opposed trend in the presence of docetaxel. It was observed a significant increase in TARP expression in MCF7pcPAR4 cells by qRT-PCR in the absence and presence of docetaxel, but these findings do not confirm the results of the transcriptome. PCR Array data of MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO comparison before treatment, showed a significant expression difference in nine genes (p < 0.005). The genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 and TWIST showed positive expression and the genes NTRK2, SOX2, SOX9 and WISP1 had negative expression. In the presence of docetaxel it was observed that the genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 and TWIST showed upregulation and FST downregulation with statistical significance (p < 0.005). From 84 genes of the platform PCR array we observed 21 and 14 common genes between both techniques in the absence and presence docetaxel, respectively. In the absence of docetaxel 16 genes showed similar expression profile, among them the upregulation of GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 and TWIST, together with downregulation of CDH1, JAG1, NTRK2 suggest activation of the WNT/beta-catenin pathway. While the expression of DAB2, WNT5A, FZD7 and RUNX2 indicates inactivation of this pathway. In the presence of treatment six genes showed the same expression profile. Among these, the upregulation of CTGF, DAB2 EGR1 suggest the inactivation of Wnt/beta-catenin pathway. On the other hand, positive expression of FGF20, LEF1 and PDGFRA suggests that Wnt/beta-catenin would be active. In this study, we show that PAR-4 modulates genes of the WNT signaling pathway. However, more experiments are needed to clarify the role of WNT canonical and non-canonical pathways and how this reflects on drug chemosensitivity

O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity

O PAWR (Prostate apoptosis response- 4) também conhecido como PAR-4 é um gene pró-apoptótico identificado em células de câncer de próstata quando expostas a estímulos apoptóticos. A expressão de PAR-4 pode aumentar a sensibilidade da célula a apoptose, incluindo células de câncer de mama. Ensaios de expressão gênica por transcriptoma foram realizados em nosso laboratório (dados ainda não publicados), com o objetivo de analisar genes diferencialmente expressos associados à quimiossensibilidade ao docetaxel em células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão para PAR-4 (MCF7pcPAR4) e o com vetor vazio (MCF7pcNEO) antes e após o tratamento com docetaxel. Para avaliar a interação entre os genes diferencialmente expressos foram geradas redes gênicas funcionais utilizando o programa IPA- Ingenuity®. Dentre as diversas redes gênicas geradas destacaram-se as que continham genes relacionados direta ou indiretamente com a via de sinalização WNT (Wingless-Type MMTV Integration 1). O presente estudo visa validar genes diferencialmente expressos identificados em células MCF-7 com diferenças de expressão de PAR-4 antes e após a exposição de docetaxel. Através da anotação manual dos genes mais diferencialmente expressos, foram selecionados os genes EGR1, XAF1, TARP e WNT5A para validação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). A plataforma Human WNT Signaling Pathway RT2 Profiler(TM) PCR Array (PCR Array) foi utilizada para avaliar o efeito da overexpressão de PAR-4 e do tratamento de docetaxel na expressão de genes das vias canônica e não canônica do WNT. A expressão positiva do gene WNT5A nas células MCF7pcPAR4 em relação a MCF7pcNEO foi confirmada por qRT-PCR na ausença e presença do tratamento com docetaxel. O gene EGR1 apresentou regulação positiva significativa na técnica de qRT-PCR na ausência de tratamento, porém não apresenta o mesmo perfil de expressão observado no ensaio de transcriptoma. O gene XAF1 apresentou regulação negativa nas células MCF7pcPAR4 quando comparadas com as células MCF7pcNEO na ausência e presença de docetaxel, com tendência a validação na ausência de tratamento e de não validação na presença de docetaxel. Foi observado o aumento significativo da expressão de TARP nas células MCF7pcPAR4 por qRT-PCR na ausência e presença de docetaxel, porém esses achados não confirmam os resultados obtidos no transcriptoma. Em nossos dados de PCR Array na comparação MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO antes do tratamento, encontramos diferença de expressão significativa (p < 0,005) em 9 genes. Sendo que, os genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 e TWIST apresentaram expressão positiva e os genes NTRK2, SOX2, SOX9 e WISP1 tiveram expressão negativa. Na comparação na presença de docetaxel observamos que os genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 e TWIST apresentaram regulação positiva e FST apresentou regulação negativa com significância estatística (p < 0,005). Dos 84 genes da plataforma PCR array foram observados 21 e 14 genes comuns entre ambas às técnicas na ausência e presença de docetaxel, respectivamente. Na ausência de docetaxel 16 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão, dentre estes a regulação positiva de GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 e TWIST, associadas á regulação negativa de CDH1, JAG1, NTRK2 sugerem ativação da via WNT/?-catenina. Enquanto, a expressão de DAB2, WNT5A, FZD7 e RUNX2 indica inativação dessa via. Na presença do tratamento 6 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão. Dentre estes, a regulação positiva de CTGF, DAB2 e EGR1 sugerem inativação da via WNT/beta-catenina. Por outro lado, a expressão positiva de FGF20, LEF1 e PDGFRA sugerem que via WNT/beta-catenina estaria ativa. Neste estudo, podemos mostrar que PAR-4 modula genes da via de sinalização WNT. Porém, mais experimentos serão necessários para verificar quais mecanismos estão envolvidos e de que forma isso reflete na quimiossensibilidade a drogas / PAWR (Prostate Apoptosis Response-4) also known as PAR-4 is a pro-apoptotic gene identified in prostate cancer cells when exposed to apoptotic stimuli. PAR-4 expression can increase sensitivity of cells to apoptosis, including breast cancer cells. Our laboratory performed transcriptome profiling (unpublished data), with the aim of analyzing differentially expressed genes associated with chemosensitivity to docetaxel in transfected MCF-7 cells with PAR-4 expression plasmid (MCF7pcPAR4) and with empty vector (MCF7pcNEO) before and after treatment with docetaxel. To assess the interaction between the differentially expressed genes functional gene networks were generated using the IPA Ingenuity® software. Networks generated containing genes directly or indirectly related with the WNT signaling pathway (Wingless-Type MMTV Integration 1) were highlighted. The present study aims to validate the differentially expressed genes identified in MCF-7 cells with different PAR-4 expression before and after exposure of docetaxel. By manual annotation of the genes most differentially expressed, the genes EGR1, XAF1, TARP and WNT5A were selected to be validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR). The platform WNT Signaling Pathway Human RT2 Profiler (TM) PCR Array (Array PCR) was used to evaluate the effect of PAR-4 overexpression and docetaxel treatment in gene expression of canonical and noncanonical WNT pathways. The positive expression of WNT5A in MCF7pcPAR4 cells relative to MCF7pcNEO was confirmed by qRT-PCR in the presence and absence of docetaxel. The EGR1 gene showed significant upregulation in the qRT-PCR in the absence of treatment, but showed a different expression profile of the one observed in the transcriptome assay. The XAF1 showed a negative regulation in MCF7pcPAR4 cells when compared with MCF7pcNEO cells in the absence and presence of docetaxel, showing a similar trend in the absence of treatment but opposed trend in the presence of docetaxel. It was observed a significant increase in TARP expression in MCF7pcPAR4 cells by qRT-PCR in the absence and presence of docetaxel, but these findings do not confirm the results of the transcriptome. PCR Array data of MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO comparison before treatment, showed a significant expression difference in nine genes (p < 0.005). The genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 and TWIST showed positive expression and the genes NTRK2, SOX2, SOX9 and WISP1 had negative expression. In the presence of docetaxel it was observed that the genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 and TWIST showed upregulation and FST downregulation with statistical significance (p < 0.005). From 84 genes of the platform PCR array we observed 21 and 14 common genes between both techniques in the absence and presence docetaxel, respectively. In the absence of docetaxel 16 genes showed similar expression profile, among them the upregulation of GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 and TWIST, together with downregulation of CDH1, JAG1, NTRK2 suggest activation of the WNT/beta-catenin pathway. While the expression of DAB2, WNT5A, FZD7 and RUNX2 indicates inactivation of this pathway. In the presence of treatment six genes showed the same expression profile. Among these, the upregulation of CTGF, DAB2 EGR1 suggest the inactivation of Wnt/beta-catenin pathway. On the other hand, positive expression of FGF20, LEF1 and PDGFRA suggests that Wnt/beta-catenin would be active. In this study, we show that PAR-4 modulates genes of the WNT signaling pathway. However, more experiments are needed to clarify the role of WNT canonical and non-canonical pathways and how this reflects on drug chemosensitivity

Objective: Epithelioid sarcoma (ES) presents unique clinical features in comparison to other sarcoma subtypes. Data regarding the benefits of chemotherapy are very limited. Combination regimens using gemcitabine and docetaxel (Gem/Doce) have proven to be effective, especially in uterine and nonuterine leiomyosarcoma. Yet, there is no available data on the efficacy of Gem/Doce in ES. Methods: A retrospective analysis of the three participating institutions was performed. Twenty-eight patients with an ES diagnosis presented at one of the participating institutions between 1989 and 2012. Of this group, 17 patients received chemotherapy. Results: Patients’ median overall survival (OS) after the beginning of palliative chemotherapy was 21 months, and the 1-year OS was 87%. Twelve patients received Gem/Doce with a clinical benefit rate of 83%. The median progression-free survival (PFS) was 8 months for all patients receiving Gem/Doce. The best response was complete remission in 1 patient and partial remission in 6 patients. All 6 patients receiving Gem/Doce as a first-line treatment showed measurable responses with a median PFS of 9 months. Conclusions: In this retrospective study, Gem/Doce was an effective chemotherapeutic regimen for ES. Prospective studies are needed to better assess the effects of this combination drug therapy.

O câncer de próstata é o tipo de câncer mais incidente no sexo masculino, sendo estimados 68.220 novos casos no Brasil para cada ano do biênio 2018-2019. Embora tenha-se observado um enorme progresso no tratamento do câncer de próstata nas últimas décadas, esta doença continua sendo a segunda maior causa de mortes relacionadas ao câncer em homens. Entre os fármacos indicados para o seu tratamento, o docetaxel aparece como escolha de primeira-linha dada sua grande eficácia terapêutica. Entretanto, efeitos adversos severos estão relacionados ao uso deste fármaco. Para superar estes problemas, a veiculação de quimioterápicos em sistemas de liberação nanoestruturados vem sendo amplamente estudada nos últimos anos, dados os diversos benefícios que oferece. Deste modo, o presente trabalho visou desenvolver, caracterizar e avaliar biologicamente nanopartículas poliméricas a base de um copolímero de policaprolactona-DL-?-tocoferol-polietilenoglicol-1000 (PCL-TPGS) contendo docetaxel para uso na terapia do câncer de próstata. As nanopartículas foram obtidas pela técnica de nanoprecipitação e caracterizadas por suas características físico-químicas, morfológicas e biológicas. Os sistemas foram obtidos com sucesso e possuem distribuição de tamanhos adequada para os objetivos propostos (PSD 130 ± 18 nm, PDI 0,10 ± 0,04 e ZP -30,1 ± 2,3 mV), alto rendimento, eficiência de encapsulação e capacidade de carga (98,7 ± 3,2%, 96,2 ± 1,1% e 5,01 ± 0,32%, respectivamente). Os estudos calorimétricos e espectroscópicos permitiram avaliar o estado físico do fármaco na nanopartícula e sugerir a encapsulação. Ensaios biológicos demonstraram elevada capacidade dos nanocarreadores contendo docetaxel em causar dano celular em linhagem de câncer de próstata (PC-3), atingindo EC50 de 0,4760 ± 0,092 nM. A avaliação da internalização celular resultou em 97,64 ± 1,21%, coerentes com os resultados de citotoxicidade. Estudos in vivo demonstraram eficácia do sistema desenvolvido em modelo animal, cuja capacidade de redução tumoral foi superior à formulação comercial de docetaxel. O sistema desenvolvido tem potencial para o aprimoramento da terapia citotóxica convencional em humanos, sendo necessários estudos posteriores para a assegurar sua segurança clínica. / Prostate cancer is the most common type of cancer in men, with an estimated 68,220 new cases in Brazil for each year of the 2018-2019 biennium. Although tremendous progress has been made in the treatment of prostate cancer in recent decades, this disease remains the second leading cause of cancer-related deaths in men. Among the drugs indicated for its treatment, docetaxel appears as a first-line choice given its great therapeutic efficacy. However, severe adverse effects are related to the use of this drug. To overcome these problems, the delivery of chemotherapy in nanostructured release systems has been widely studied in recent years, given the several benefits it offers. Thus, the present work aimed to develop, characterize and biologically asses polymeric nanoparticles based on a copolymer of polycaprolactone- DL-?-tocopherol-polyethylene glycol-1000 (PCL-TPGS) containing docetaxel for use in prostate cancer therapy. The nanoparticles were obtained by the nanoprecipitation technique and characterized by their physical-chemical, morphological and biological characteristics. The systems were successfully obtained and have suitable size distribution for the proposed objectives (PSD 130 ± 18 nm, PDI 0.10 ± 0.04 and ZP- 30.1 ± 2.3 mV), high yield, encapsulation efficiency and loading capacity (98.7 ± 3.2%, 96.2 ± 1.1% and 5.01 ± 0.32%, respectively). Calorimetric and spectroscopic studies allowed the evaluation of drug physical state within the nanoparticle and suggest the encapsulation. Biological assays demonstrated a high ability of docetaxel-containing nanocarriers to cause cell damage in prostate cancer cell line (PC-3), reaching EC50 of 0.4760 ± 0.092 nM. The evaluation of the cellular internalization resulted in 97.64 ± 1.21%, consistent with the results of cytotoxicity. In vivo studies demonstrated efficacy of the system developed in an animal model, whose tumor reduction capacity was superior to the commercial formulation of docetaxel. The developed system has potential for the improvement of conventional cytotoxic therapy in humans, and further studies are needed to ensure its clinical safety.

Recent advancements in pharmaceutical technology based on principles of nanotechnology, polymer chemistry, and biomedical engineering have resulted in the creation of novel drug delivery systems with the potential to revolutionize current strategies in cancer chemotherapy. In oncology, realization of significant improvements in therapeutic efficacy requires minimization of drug exposure to healthy tissues and concentration of the drug within the tumor. As such, encapsulation of chemotherapeutic agents inside nanoparticles capable of enhancing tumor-targeted drug delivery is a particularly promising innovation. Yet, initial investigations into the intratumoral fate of nanomedicines have suggested that they may be heterogeneously distributed and achieve limited access to cancer cells located distant from the tumor vasculature. As such, uncovering the determinants of nanoparticle transport at the intratumoral level is critical to the development of optimized delivery vehicles capable of fully exploiting the therapeutic potential of nanomedicines. In this work, the chemotherapeutic agent, docetaxel (DTX), was incorporated into nano-sized, biocompatible PEG-b-PCL block copolymer micelles (BCMs). Encapsulation of DTX in micelles via chemical conjugation or physical entrapment resulted in a dramatic increase in drug solubility and customizable drug release rate. The use of multicellular tumor spheroids (MCTS) was established as a viable platform for assessing the efficacy and tumor tissue penetration of nanomedicines in vitro. A series of complementary assays was validated for analysis of DTX-loaded micelle (BCM+DTX) toxicity in monolayer and spheroid cultures relative to Taxotere®. Cells cultured as spheroids were less responsive to treatment relative to monolayer cultures due to mechanisms of drug resistance associated with structural and microenvironmental properties of the 3-D tissue. Computational, image-based methodologies were used to assess the spatial and temporal penetration of BCMs in spheroids and corresponding human tumor xenografts. Using this approach, the tumor penetration of micelles was found to be nanoparticle-size-, tumor tissue type- and time- dependent. Furthermore, spheroids were found to be a valuable platform for the prediction of trends in nanoparticle transport in vivo. Overall, the results reported herein serve to demonstrate important determinants of nanoparticle intratumoral transport and to establish computational in vitro and in vivo methodologies for the rational design and optimization of nanomedicines.