Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Érika Rayanne Carvalho (carvalho.erika@ymail.com) on 2009-12-01T01:14:58Z No. of bitstreams: 1 Janaina%20do%20Nascimento%20Lima%20Matias%20de%20Paula%20Dissertacao.pdf: 938650 bytes, checksum: ceb07c334e0caf8cec361835356eb0c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2009-12-04T21:19:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Janaina%20do%20Nascimento%20Lima%20Matias%20de%20Paula%20Dissertacao.pdf: 938650 bytes, checksum: ceb07c334e0caf8cec361835356eb0c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-04T21:19:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Janaina%20do%20Nascimento%20Lima%20Matias%20de%20Paula%20Dissertacao.pdf: 938650 bytes, checksum: ceb07c334e0caf8cec361835356eb0c4 (MD5) Previous issue date: 2006-10-25 / Inibidores de α-amilase de plantas apresentam um grande potencial para uso biotecnológico, através de tranformação de plantas visando resistência a insetos- praga. Neste contexto, estudou-se o potencial inseticida do inibidor de α-amilase 0.53 sobre os insetos-praga de grãos armazenados de feijão, visando sua utilização em programas de melhoramento genético. Plantas de trigo foram escolhidas como fonte vegetal devido a presença de inúmeras isoformas de inibidores de α-amilases em suas sementes. Os inibidores de α-amilases, presentes em sementes de trigo (Triticum aestivum), foram purificados e caracterizados e o gene para o inibidor 0.53 foi isolado utilizando técnicas de RT-PCR, utilizando cDNAs como molde. A sequência para o inibidor 0.53 foi então subclonada no vetor de expressão pPICZαA (pFSP-pPICZαA-0.53) e a expressão da proteína recombinante foi realizada em células de levedura metilotrófica Pichia pastoris. Após estabelecimento das condições de expressão, a proteína recombinante, expressa e secretada no meio de cultura, foi purificada por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance). Ensaios in vitro utilizando as α-amilases dos insetos-praga: Acanthocelides obtectus, Zabrotes subfasciatus, Callosobruchus maculatus e a α-amilase pancreática de Porco (PPA), mostraram que a atividade desse inibidor é altamente dependente das condições de pH. Em pH 4,5, o inibidor 0.53 foi capaz de inibir unicamente as α-amilases dos diferentes insetos, não apresentando nenhuma atividade para a amilase de mamífero PPA. Porém, em pH 7,2, o inibidor recombinante 0.53 atuou unicamente sobre a PPA, inibindo cerca de 90% de sua atividade, não sendo ativo para α-amilases dos diferentes insetos alvo testados. Desta forma, o inibidor recombinante 0,53 poderá ser utilizado em diversos estudos de toxicidade em mamíferos, estudos complementares de interação molecular, a fim de verificar sua segurança alimentar e potencial uso biotecnológico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / α-Amylase plant inhibitors exhibit a great potential for biotechnological use, using plants of transformation aiming resistance against insects-pest. This work studies the potential insecticidal effects of α-amylases inhibitor 0.53 against insects-pest in stored bean grains, and also the possibility of its use for the plant genetic improvement. Seeds from wheat plants were chosen as a vegetable source due to their presence of several α-amylases inhibitors isoforms. Firstly, the α-amylases inhibitors synthesized in wheat seeds (Triticum aestivum), were isolated, characterized and the gene encoding the 0.53 inhibitor isolated by RT-PCR techniques, using cDNAS as template. The 0.53 inhibitor coding sequence was then subcloned into the expression vector pPICZαA (pFSP-pPICZαA-0.53) and the recombinant protein expression was carried by metilotrofic yeast Pichia pastorisI cell. After the establishment expression conditions, the recombinant protein, secreted in the culture, medium was purified by HPLC (High Performance Liquid Chromatography). In vitro assays using α-amylases from the insect-pest: Acanthocelides obtectus, Zabrotes subfasciatus, Callosobruchus maculatus and α-amylase from pancreatic porcine (PPA), had shown that the activity of this inhibitor is highly dependent of the pH conditions. In pH 4,5, the 0.53 inhibitor was able capable to inhibit solely insects α-amylases, but showed no activity for PPA. Otherwise, in pH 7,2, 0.53 recombinant inhibitor act only against PPA, inhibiting about 90%, not being active for insects α-amylases tested. Due to the characteristics described above the 0.53 recombinant inhibitor could be used in several studies in mammals toxicity tests, complementary studies of molecular interaction, in order to verify its alimentary security and potential biotechnological use.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-02T16:30:42Z No. of bitstreams: 1 2010_PabloRogerioPereiraMeloOliveira.pdf: 1561420 bytes, checksum: 7972668b4ea8cd2c3fb695e6ef39738e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-21T14:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_PabloRogerioPereiraMeloOliveira.pdf: 1561420 bytes, checksum: 7972668b4ea8cd2c3fb695e6ef39738e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-21T14:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_PabloRogerioPereiraMeloOliveira.pdf: 1561420 bytes, checksum: 7972668b4ea8cd2c3fb695e6ef39738e (MD5) / A soja é a oleaginosa mais cultivada no mundo e possui um papel importantíssimo na alimentação humana. Além da importância direta na nutrição da população mundial, esse grão é também utilizado de diversas outras formas como, por exemplo, na produção de óleo, ração animal e biocombustíveis. Devido a esses aspectos a soja tornou-se muito importante na economia mundial e é o produto agrícola mais exportado no Brasil. Dentre os aspectos limitantes para a cultura estão as doenças, entre elas, a podridão vermelha da raiz (PVR) que é responsável por grandes perdas na produtividade da soja. Como agentes causais dessa doença são consideradas quatro espécies de Fusarium: F. brasiliense, F. cuneirostrum, F. tucumaniae e F. virguliforme. Através de uma coleção de isolados de Fusarium spp. oriundos de diversas regiões produtoras de soja no Brasil, foi desenvolvido esse projeto, que teve como objetivo verificar a variabilidade genética desses isolados, bem como a severidade causada pela PVR em cultivares de soja moderadamente resistente e suscetível a essa doença. Através dos testes de severidade ficou comprovado que todos isolados causaram danos significativos no sistema radicular das plântulas. Para avaliação da variabilidade genética dos isolados, foram realizados análises de polimorfismos de DNA amplificado ao acaso (RAPD). Onde se constatou uma grande diversidade genética entre os isolados e uma tendência clara de separação em dois grupos principais das duas espécies prevalecentes no Brasil, F. tucumaniae e F. brasilense. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Soybean is the crop most widely grown in the world and has an important role in human nutrition. Besides the direct importance in the nutrition of the world population, this grain is also used in many other ways, such as in oil production, animal feed and production of biofuels. Due to these factors, soybean became important in the global economy and is the most exported agricultural product in Brazil. The diseases are among the limiting factors on soybean production. One of these diseases is the sudden death syndrome (SDS) that is responsible for losses on crop yield. As causative agents of disease, four species of Fusarium are considered pathogens: F. brasiliense, F. cuneirostrum, F. tucumaniae and F. virguliforme. This work was conducted by studing a collection of Fusarium spp. from different soybean-producing regions in Brazil. The main objective of the research was to determine the genetic variability of these isolates as well as the severity caused by the SDS on cultivars moderately resistant and susceptible to the disease. The tests of disease severity, throughout artificial inoculation, have shown that all isolates caused significant damage in the seedling root system. To assess the genetic variability of isolates were carried out analysis of polymorphisms of DNA randomly amplified (RAPD). RAPD analysis demonstrated a great genetic diversity among the isolates and a clear tendency to split into two main species-groups, F. tucumaniae and F. brasilense, both species prevalent in Brazil.

Tese (doutorado)-Univesidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Luiza Moreira Camargo (luizaamc@gmail.com) on 2011-07-04T17:19:28Z No. of bitstreams: 1 2010_KeizePereiraJunqueira.pdf: 2134625 bytes, checksum: f7f542cc5f4066574249a15daa22ab10 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-07-06T12:20:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KeizePereiraJunqueira.pdf: 2134625 bytes, checksum: f7f542cc5f4066574249a15daa22ab10 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-06T12:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KeizePereiraJunqueira.pdf: 2134625 bytes, checksum: f7f542cc5f4066574249a15daa22ab10 (MD5) / A bacteriose do maracujazeiro causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae é uma doença de grande expressão econômica em todo o território nacional. Os métodos atuais de controle não oferecem resultados satisfatórios. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo analisar fontes de resistência genética, o efeito de fertilizantes foliares e indutores de resistência no controle da bacteriose do maracujazeiro em campo e casa de vegetação e a influência destes produtos sobre as características físico-químicas de frutos e produtividade. Para tanto, o trabalho foi dividido em duas etapas: estudo da resistência genética e da resistência induzida. Inicialmente, confirmaram-se, por meio de marcadores moleculares, a natureza híbrida de 17 cruzamentos entre espécies de Passiflora indicando possibilidades do uso destas em programas de melhoramento. Os marcadores RAPD permitiram verificar a ocorrência ou não da fecundação cruzada no gênero Passiflora. Um segundo experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar a reação de P. caerulea, P. mucronata, P. vitifolia, P. gibertii, P. cerradense, P. edulis, P. caerulea x P. edulis, P. caerulea x P. mucronata, P. vitifolia x P. edulis e P. mucronata x P. edulis a oito isolados de X. axonopodis pv. passiflorae procedentes de diferentes municípios do Sudeste, Centro-oeste, Norte e Nordeste do Brasil. Cada isolado foi inoculado mecanicamente em plantas com 90 dias e os sintomas foram avaliados aos 5, 10 e 15 dias após a inoculação, medindo-se o diâmetro transversal e longitudinal das necroses formadas em torno do orifício circular. Maiores valores de área abaixo da curva de progresso da lesão (AACPL) para a espécie P. edulis foram constatados quando se inoculou o isolado procedente de Piratininga-SP. Em relação aos isolados, em todas as procedências estudadas, com exceção de “Brasília-DF”, maiores valores de AACPL foram observados na espécie P. edulis. Em seguida, com o propósito de estudar os efeitos da resistência nos diferentes genótipos, inoculou-se cada isolado em plantas com idade de 90 dias, sendo as avaliações realizadas conforme o experimento anterior. Na análise dos dados, utilizou-se o modelo de dialelo parcial. A significância da Capacidade Específica de ii Interação indicou a existência de resistência vertical em pelo menos um patossistema. O efeito significativo da resistência horizontal e da agressividade evidenciaram diferenças entre os materiais genéticos (espécies e híbridos interespecíficos) e também entre os isolados utilizados. Para estudar a resistência induzida, realizaram-se outros experimentos utilizando-se a cultivar BRS Gigante Amarelo. Em uma primeira etapa, avaliaram-se os efeitos de indutores de resistência, fertilizantes foliares e extratos vegetais no controle da bacteriose em casa de vegetação. Determinaram-se também o período de indução, as concentrações mais adequadas para a cultura do maracujazeiro, e o efeito in vitro desses produtos no crescimento da bactéria. Não houve crescimento bacteriano nos meios contendo fosetyl-Al, CPAC-GEG, CPAC-GE, Cuprozeb®, Agrimaicin®, Agro-mos® e fosfito de cobre. As aplicações dos produtos CPAC-GE, extrato de P. gibertii, ASM e CPAC-GEG antes da inoculação reduziram o tamanho das lesões provocadas pela bactéria em até 57,42%. O tratamento com o Agrimaicin®, antes da inoculação proporcionou um dos menores níveis de controle da bacteriose em relação à testemunha (24,36 %). O gesso agrícola e CPAC-GE pulverizados aos 3 ou 6 dias antes da inoculação e o Agrimaicin® aos 3 ou 6 dias após a inoculação proporcionaram resultados semelhantes, indicando efeito indutor de resistência do gesso agrícola e CPAC-GE e efeito curativo do Agrimaicin®. As aplicações do fosfito de potássio, ASM e Agro-mos aos 6 dias antes da inoculação promoveram redução no tamanho das lesões. Em outro experimento, realizado em campo, com um clone da cv. BRS Gigante Amarelo, avaliou-se a severidade da bacteriose e de outras doenças comuns no maracujazeiro (antracnose, virose e verrugose) e determinaram-se a produtividade e as características físicas e químicas de frutos de plantas tratadas com aplicações quinzenais de indutores de resistência e fertilizantes foliares durante um ano. A menor incidência da bacteriose em folhas foi constatada quando se utilizou ASM e gesso agrícola. No ano seguinte, todos os tratamentos provocaram redução na incidência da bacteriose em relação à testemunha. Em relação à bacteriose em frutos, os produtos não diferiram estatisticamente entre si. Nenhum produto controlou a antracnose em frutos. Em relação à virose em frutos, o Cuprozeb® e o ASM não diferiram estatisticamente da testemunha enquanto os demais tratamentos foram eficazes no controle dessa doença. Para o controle da verrugose nos frutos, os produtos avaliados não diferiram estatisticamente entre si. Frutos com maior massa fresca foram obtidos com aplicações de gesso agrícola (236,83g), fosetyl-Al (233,79g), fosfito de potássio (230,64g), Agro-mos® (221,15g), CPAC-GE (234,10g) e Cuprozeb® (194,12g). O maior valor para peso da polpa foi iii observado no tratamento com Agro-mos® (72,80g). Não houve diferenças significativas entre tratamentos para diâmetro longitudinal e espessura de casca. Quanto às características químicas, com exceção do Cuprozeb®, todos os produtos testados proporcionaram incremento no teor de sólidos solúveis dos frutos. A maior acidez total titulável (ácido cítrico) foi obtida nos frutos cujas plantas foram tratadas com Cuprozeb®, gesso agrícola, Agro-mos®, fosetyl-Al e ASM. Maiores quantidades de frutos por planta foram obtidas com aplicações de fosfito de potássio (162,38), seguido pelo gesso agrícola (111,13), sendo que este último não diferiu estatisticamente do CPAC-GE (102,50 frutos) e do fosetyl-Al (74,88 frutos). As maiores produtividades (kg/ha), considerando 1600 plantas/ha, foram alcançadas com fosfito de potássio (40,19 t/ha), seguido pelo gesso agrícola (30,48 t/ha) e CPAC-GE (29,04 t/ha). Assim, indutores de resistência e fertilizantes foliares, como o fosfito de potássio e gesso agrícola podem ser produtos alternativos eficazes no controle de doenças do maracujazeiro, exceto para a antracnose. Esses produtos também podem contribuir para aumentar a produtividade e melhorar a qualidade dos frutos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The bacterial disease of passion fruit caused by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is a disease with a high economic expression throughout the national territory. Current control methods do not provide satisfactory results. Thus, this study aimed to analyze sources of genetic resistance, the effect of foliar fertilizers and resistance inducers to control the bacterial disease of passion fruits under field and greenhouse conditions and the influence of these products on the physical-chemical characteristics of fruits and yield. The work was divided into two stages: a study of genetic resistance and induced resistance. Initially, it was confirmed by molecular markers, the origin of interspecific hybrids from 17 crosses between species of Passiflora indicating the possibility of the use of these in breeding programs. The RAPD markers were effective to verify the presence or absence of outcrossing in the genus Passiflora. A second experiment was carried out to evaluate the reaction of P. caerulea, P. mucronata, P. vitifolia, P. gibertii, P. cerradense, P. edulis, P. caerulea x P. edulis, P. caerulea x P. mucronata, P. vitifolia x P. edulis and P. mucronata x P. edulis to eight strains of X. axonopodis pv. passiflorae from different area of the Southeast, Midwest, North and Northeast of Brazil. Each isolate was inoculated on hurted leaves of 90 day old plants and symptoms were evaluated at the 5th, 10th and 15th days after inoculation, by measuring the transverse and longitudinal diameter of necrosis formed around the circular hole. Higher area under the progress curve of the lesion (AUPCL) for the species P. edulis were observed when the bacterial isolate from Piratininga-SP was inoculated. Regarding the isolates from all origins studied, except for "Brasilia-DF," higher AUPCL values were observed for the species P. edulis. Then, with the purpose of studying the effects of resistance in different genotypes, each isolate was inoculated on 90 day old plants, and the evaluations were performed according to the above experiment. In the data analysis, it was used the partial diallel model. The significance of the Specific Interaction Capacity indicated the existence of vertical resistance in at least one pathosystem. The significant effect of horizontal v resistance and aggressiveness showed differences among the genotypes (species and interspecific hybrids) and also among the isolates used. To study the induced resistance, experiments using the BRS Gigante Amarelo cultivar were performed. Initially, the effects of resistance inducers, foliar fertilizers and plant extracts in the control of the bacterial disease in greenhouse were evaluated. The induction period, the most suitable product concentrations for using on passion fruit and in vitro effect of these products on development of bacterial colonies also were determined. There was no bacterial growth in the media containing fosetyl-Al, CPAC- GEG, CPAC-GE, Cuprozeb®, Agrimaicin®, Agro-mos ® and copper phosphite. The applications of the products CPAC-GE, extract of P. gibertii, ASM and CPAC-GEG before the inoculation reduced the size of the lesions caused by the bacteria up to 57.42%. Treatment with Agrimaicin®, before the inoculation provided one of the lowest levels of bacterial control compared to the control (24.36%). The gypsum and the CPAC-GE sprayed at the 3rd or the 6th days before the inoculation and Agrimaicin® at the 3rd or the 6th days after inoculation provided similar results, indicating an inducing effect of resistance of the gypsum and the CPAC-GE and a curative effect of the Agrimaicin®. The applications of potassium phosphite, ASM and Agro-mos® at the 6th day before the inoculation caused a reduction in the lesions size. In another experiment, carried out in the field with a clone of the BRS Gigante Amarelo cultivar, were evaluated the severity of the bacterial disease and other common diseases on passion fruit plants (anthracnose, scab and viral disease) and it was determined the productivity and the physical and chemical characteristics of fruits of plants treated biweekly with the resistance inducers and foliar fertilizer for one year were determined. The lowest incidence of bacterial disease on leaves was observed when using ASM and gypsum. In the following year, all treatments caused reduction in the incidence of bacterial disease compared to the control. Regarding bacterial disease in fruits, the products did not differ statistically. No product controlled the anthracnose on fruits. Regarding virus in fruits, Cuprozeb® and ASM did not differ statistically from the control while the other treatments were effective in controlling this disease. For the control of scab on fruits, the sprayed products did not differ statistically. Fruits with higher fresh weight were obtained with applications of gypsum (236.83 g), fosetyl-Al (233.79 g), potassium phosphite (230.64 g), Agro-mos® (221.15 g), CPACGE (234.10 g) and Cuprozeb® (194.12 g). The highest value of pulp weight was observed in the treatment with Agro-mos® (72.80 g). There were no significant differences among treatments for longitudinal diameter and bark thickness. For chemical characteristics, except for Cuprozeb®, all vi products tested provided an increase in fruit soluble solids. The highest total titrable acidity (citric acid) was obtained in the fruits which the plants were treated with Cuprozeb®, gypsum, Agromos ®, fosetyl-Al and ASM. Larger amounts of fruits per plant were obtained with applications of potassium phosphite (162.38), followed by gypsum (111.13), and the last did not differ statistically from the CPAC-GE (102.50 fruits) and the fosetyl -Al (74.88 fruits). The highest yield (kg / ha), considering 1600 plants / ha was achieved with potassium phosphite (40.19 t / ha), followed by gypsum (30.48 t / ha) and CPAC-GE (29.04 t / ha). Thus, resistance inducers and foliar fertilizers such as potassium phosphite and gypsum may be effective as alternative products to control of passion fruit diseases, except anthracnose. They can also to contribute to increasing yield of passion fruit plantations and improve the fruit quality.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Pós-Graduação em Fitopatologia, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-11-21T12:16:16Z No. of bitstreams: 1 2011_ClaudeniaFerreiraSilva.pdf: 1164226 bytes, checksum: b696c656980ba30ad870d5eac1dfde5b (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-14T14:27:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ClaudeniaFerreiraSilva.pdf: 1164226 bytes, checksum: b696c656980ba30ad870d5eac1dfde5b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-14T14:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ClaudeniaFerreiraSilva.pdf: 1164226 bytes, checksum: b696c656980ba30ad870d5eac1dfde5b (MD5) / Erwinia psidii é o agente causal da seca dos ponteiros da goiabeira (Psidium guajava) no Brasil, sendo uma das doenças mais importantes para a cultura no país. Essa bactéria afeta ramos e brotações das plantas, o que reduz significativamente a produtividade da cultura. As medidas de controle existentes são ineficientes e a disseminação do patógeno ocorre com freqüência através de material propagativo assintomático. Considerando a necessidade de um método sensível para detecção do patógeno em mudas de goiabeira, os objetivos deste trabalho foram: desenvolver iniciadores específicos para a detecção de E. psidii por PCR, comparar três métodos (IC-PCR, BIO-PCR e PCR convencional) com os iniciadores selecionados quanto ao seu potencial para detecção da bactéria em folhas de goiabeira e, finalmente, avaliar a BIO-PCR e PCR convencional para detecção em plantas inoculadas em casa de vegetação e em plantas sintomáticas e assintomáticas de pomares do Distrito Federal. A sequencia de 355 pb de um fragmento amplificado do gene da recombinase A (recA) do isolado tipo IBSBF 435 foi usada para desenhar os iniciadores que foram testados quanto à sua especificidade com DNA de 59 isolados de E. psidii, 20 isolados de outras bactérias fitopatogênicas, 17 isolados endofíticos/epifíticos de goiabeira, bem como com o DNA de folhas de goiabeira e de Colletotrichum gloeosporioides, fungo patogênico à goiabeira. A sensibilidade foi testada com DNA purificado e suspensões bacterianas. O par de iniciadores Ep 2L/2R detectou 0, 000001 pg de DNA de E. psidii e até o limite de 10 ufc/mL. BIO-PCR e PCR convencional foram mais sensíveis e mais rápidos do que a IC-PCR. Os limites de detecção em extratos de folhas misturados com suspensão bacteriana em diferentes concentrações foram de 10 e 102 ufc/mL, para BIO-PCR e PCR convencional, respectivamente. Em seguida, ambos os métodos foram testados em casa de vegetação com mudas de goiabeiras inoculadas com o isolado IBSBF 1576 (a 107 ufc/mL). Os tecidos inoculados foram coletados e analisados por PCR aos 0, 5, 10 e 15 dias após a inoculação. Os sintomas começaram a ser visualizados aos 5 dias e todas as amostras foram positivas para BIO-PCR e PCR convencional em todos os tempos amostrados. Em um segundo ensaio, 40 amostras foram coletadas de cada um dos três pomares de goiabeiras visitados em Brazlândia, DF, sendo 20 amostras com sintomas e 20 assintomáticas. Amostras de brotações jovens foram testadas por BIO-PCR com os iniciadores específicos. Das 60 amostras sintomáticas, 58 foram positivas (96,7 %), enquanto apenas quatro foram positivas entre as assintomáticas (6,7%), domonstrando que o método pode ser aplicado para detecção da bactéria nos estágios iniciais da infecção. Este método representa uma valiosa ferramenta para o monitoramento da sobrevivência e disseminação de E.psidii e de novos registros da doença em pomares. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Erwinia psidii causes bacterial disease of guava (Psidium guajava) in Brazil, which is one of the most important phytosanitary problems of this crop in the country. The bacterium affects branches and twigs of guava trees, causing dieback, thus reducing yield significantly. Control measures are not effective and pathogen dissemination often occurs through contaminated but asymptomatic propagating plant material. Considering the need for a reliable and sensitive method for detecting the pathogen in plant material, the objectives of this study were to design E. psdii-specific PCR primers, to compare three methods, IC-PCR, BIO-PCR and conventional PCR with the selected primers, to evaluate the use of these primers in BIO-PCR and conventional PCR assays to detect E. psidii in inoculated guava plants grown in a greenhouse and to detect the pathogen by PCR in symptomatic and asymptomatic trees from guava orchards in Brasília, DF. A 355 bp fragment of the recombinase A gene (rec A) amplified from the type E. psidii strain IBSBF435 was used for designing primers that were further tested for specificity with DNA from 59 E. psidii isolates, 20 isolates of other plant pathogenic bacteria, 17 isolates of epiphytic/endophytic bacteria from guava, as well as with DNA form guava leaves and DNA from Colletotrichum gloeosporioides pathogenic to guava. Sensitivity was tested with purified DNA and bacterial suspensions. Primer pair Ep2L/2R detected 0,000001 pg DNA and 10 cfu/mL and only amplified DNA from E. psidii. BIO-PCR and conventional PCR were more sensitive and less time-consuming than IC-PCR. The detection limit on extracts of macerated guava leaves mixed with bacterial suspensions at different concentrations were 10 and 102 cfu/ml for BIO-PCR and conventional PCR, respectively. In the greenhouse young guava shoots were inoculated with E. psidii strain IBSBF 1576 (107 cfu/mL) and plant tissue was analyzed by PCR at 0, 5, 10, and 15 days after inoculation. Symptoms were recorded after 5 days and all inoculated shoots were PCR positive at all times, by both BIO-PCR and conventional PCR. In a second assay, forty samples were collected from each of three guava orchards, 20 showing symptoms and 20 asymptomatic. Samples were tested by BIO-PCR with specific primers. PCR was positive for 58 out of 60 symptomatic samples (96.7%) and for 6.7% of asymptomatic samples, showing that the method can be used to detect the pathogen at early stages of infection. This specific PCR method represents also a valuable tool which can be used to monitor bacterial survival, dissemination and new disease outbreak.

Orientador : Mohamed E. M. Habib / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CarlosFernandoSalgueirosade_M.pdf: 10743870 bytes, checksum: d0cd1677b810eebb5fc0f6627a8fe171 (MD5) Previous issue date: 1981 / Resumo: No presente trabalho foi detectada e avaliada a ocorrência natural da virose poliedro-nuclear (VPN) em populações de Alabama argillacea (curuquerê do algodão), nas regiões de Campinas/SP e Mogi-Guaçú/SP. Os parasitos de A. argillacea principalmente os Tachinidae, mostraram ter papel fundamental na dispersão do vírus e na manutenção da doença. Tais parasitos, junto com outros fatores bióticos de mortalidade determinaram altos níveis de controle natural dessa praga. No laboratório, quando infectadas experimentalmente, as larvas de A. argillacea mostraram uma típica seqüência de sinais patológicos, caracterizada por várias etapas. O tempo de duração das fases pré-mortais dependeu de vários fatores como dose, idade e condições pré-infecção. Os estudos histopatológicos revelaram alterações a nível dos órgãos, tecidos e células, nas larvas infectadas pelo vírus. Tais alterações resultaram nas disfunções e degenerações observadas determinando a morte do inseto. Os tecidos mais afetados foram: adiposo, epiderme, matriz traqueal e sistema nervoso. Nucleocapsídeos sem envelope (297,54 por 63,07 nm) citoplasmas das células infectadas. Os com envelope (311,35 por 102,02 nm) foram encontrados somente nos núcleos. Poliedros em formação, estromas virais e elemento fibrilares também foram detectados nas células atacadas. Poliedros desenvolvidos (1,6?um'm de diâmetro) foram abundantes na hemolinfa e tecidos decompostos das larvas mortas pela doença... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / bstract: Natural occurence of NPV in populations of Alabama argillacea was detected and evaluated several times, during the present work, in cotton fields (Campinas, SP. and Mogi-Gúaçú,SP) and laboratory. Some entomophagous insects, principally tachinid parasites, was shown to have an important role as agents responsible for disperssion and maintenance of the virus. Populations of this insect pest suffered high natural mortalities due to the combined action of entomophagous insects and pathogen. Typical symptoms caracterized by morphological and behavioral alterations were described. The duration of different pre-mortal stages varied according to dose, age and stress conditions. System, tissues and cells suffered disturbances, disintegration and total mal-function resulting in death to the infected larvae. Nervous system, fat tissue, epidermal cells and tracheal matrix suffered more effects than in other sites. Nucleocapsids, as well as polyhedra, were measured in purified material and its presence in the diseased cells was detected. Some physiological disturbances were evaluated through responses of ocelli as well as fore-gut activities in diseased larvae, utilizing electrographic records. The activities of these two organs in infected larvae, when compared with healthy ones, was significantly associated with many external symptoms. The susceptibility tests revealed how the response of the larvae to the pathogen is related to many factors, such as dose, age and experimental conditions. Within the modern criteria of insect pest control, it is suggested that NPV of A. argillacea could be easily utilized in integrated control of this insect species / Mestrado / Ecologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Herculano Penna Medina Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T10:11:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GuerreiroFilho_Oliveiro_M.pdf: 4517251 bytes, checksum: 030aed9774b78c8536dbbf97638e1f30 (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: Desenvolveu-se um método de avaliação da resistência apresentada por diversos genótipos de Coffea spp à Perileucoptera coffeella através da exposição de discos de folhas a insetos. 2 Discos de 3,14 cm são mantidos em caixas plásticas sobre espuma plástica umedecida encobertas com vidro por onde incide luz artificial. As caixas no laboratório são mantidas a temperatura de 22+- 2 º C e fotoperíodo de 12 horas. Em caixas de 144 discos uma distribuição uniforme da infestação é obtida com uma população de insetos oriunda de 150 crisálidas. Observou-se em laboratório que não houve preferência do inseto pelo par de folhas amostrado. Ao contrário, a nível de campo o primeiro e segundo pares foram menos atacados. A nervura central não exerceu influência no desenvolvimento das lesões. Parcelas formadas por discos com ou sem nervura central foram igualmente destruídas. Verificou-se que as espécies C. stenophylla, C. salvatrix, C. liberica e C. brevipes são extremamente resistentes ao inseto. Essa reação foi observada tanto em testes de livre escolha como em testes onde os insetos foram confinados sobre cada genótipo, portanto, sem chance de escolha. Nessas espécies as lesões pouco ou nada se desenvolvem. Segundo os parâmetros nota visual, discos lesionados por parcela, área foliar danificada e consumo de uma lagarta, as espécies C. stenophylla, C. salvatrix, C. brevipes e C. liberica foram classificadas como muito resistentes; c kapakata, C.eugenioides, C. racemosa e C. dewevrei, foram classificadas como resistentes C. canephora e C. congensis como suscetíveis e os cultivares Catuai e Mundo Novo de C. arabica como suscetíveis ou muito suscetíveis. Derivado da hibridação interespecifica entre C. arabica e C. racemosa o cafeeiro Cl195-5-6-2 mostrou-se altamente resistente tanto em laboratório como a nível de campo. Essa resistência do cafeeiro C1195-5-6-2 pode ser observada em alguns representantes oriundos de cruzamentos dessa planta com indivíduos suscetíveis, indicando a transferência dessa característica a gerações segregantes. Nas gerações F1, F2 e RC1 observou-se haver segregação para resistência nos descendentes do C1195-5-6-2, em proporções compatíveis com a hipótese de herança simples dominante para resistência. A confiabilidade do método de laboratório desenvolvido, evidenciada pela correlação com dados de campo, associada às grandes vantagens da sua utilização, sugerem o seu emprego rotineiro em programas de melhoramento para resistência ao bicho mineiro. E sugerida uma estratégia prática para a seleção em populações segregantes / Abstract: A leaf disk method was developed to evaluate resistance of Coffea germplasm to coffee leaf miner (Perileucoptera coffeella) described as follows: leaf discs 3,14 cm diameter are kept on moist sponge inside plastic boxes closed with a glass lid. The boxes are maintained under artificial light at 22 +- 2ºC with photoperiod of 12 hours. Each box fits 144 leaf discs. Uniform disk infestation is obtained by the introduction of 150 pupes. Contrarily to the field conditions, where the first and second leaf pairs are the least infested, it was not observed insect preference for any leaf pair, in the laboratory. Presence of mid rib in the discs not influence lesion development. According to subjective visual ratings, number of discs with lesions, damaged foliar area and caterpillar consumption, c. stenophylla, c. salvatrix, C. liberica and C. brevipes can be considered as extremely resistant to the insect, with small or no lesions at alI. C. Kapakata, C. eugenioides, C. racemosa and C. devewrei can be classified as resistant, C. canephora and C.congenesis as susceptible and C arabica cv's Catuai and Mundo Novo as susceptible or very susceptible. Both in field or lab conditions, the C. racemosa x C. arabica derivate C1195-5-6-2 showed high resistance. The genetic resistance of this plant was expressed in F1, F2 and BC1 generations of crosses with susceptible cultivars. In these generations, segregation occurred in ratios compatible with the hypotesis of resistance being inherited as single dominant trait. The reliability of the devised lab method evidenced by high correlations with field tests in addition to its advantages, claim for- its routine use as a screening method in breeding programs. A practical strategy for evaluation of large segregant populations is also suggested. / Mestrado / Mestre em Biologia

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2016-02-05T13:05:53Z No. of bitstreams: 1 2015_AlaersonMaiaGeraldine_Parcial.pdf: 11895274 bytes, checksum: 0a59c54f104d2e95f8af0824dd15d853 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-02-05T13:52:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AlaersonMaiaGeraldine_Parcial.pdf: 11895274 bytes, checksum: 0a59c54f104d2e95f8af0824dd15d853 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-05T13:52:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AlaersonMaiaGeraldine_Parcial.pdf: 11895274 bytes, checksum: 0a59c54f104d2e95f8af0824dd15d853 (MD5) / Apesar do grande número de estudos sobre doenças causadas por Sclerotiniasclerotiorum, os processos componentes do ciclo das doenças nos diferentes hospedeiros são quase sempre estudados independentemente. O ciclo das doenças causadas por Sclerotiniaé bastante complexo, e pode ser dividido em quatro fases, correspondendo a estruturas típicas do ciclo de vida do patógeno. Essas fases correspondem à formação e função biológica de quatro tipos de propágulos: (1) escleródios, (2) apotécios e ascósporos, (3) pétalas infectadas, e (4) hifas infecciosas. Um etográfico serve para sintetizar o conhecimento relevante sobre a epidemiologia de uma doença. No primeiro capítulo, versões sucessivas de um etográfico são usadas para discutir a fenomenologia do mofo-branco do feijoeiro, enfatizando as relações entre propágulos de S. sclerotiorum, os sucessivos estágios da doença e os estágios de desenvolvimento do hospedeiro. O etográfico descreve a fenomenologia do mofo-branco do feijoeiro através do exame dos vários estágios do ciclo da doença em maior detalhamento do que geralmente é apresentado, e leva em consideração a concatenação de eventos pertinente ao ciclo. O método é útil em identificar os estágios-chave do ciclo e em explicitar as relações entre os estágios da doença, os quatro tipos de propágulos e os fatores que afetam seus respectivos processos de infecção. A abordagem também é útil como primeiro passo para modelagem quantitativa do mofo-branco do feijoeiro. No capítulo 2, foram analisados os estágios sucessivos (fases das epidemias), bem como seus processos de regulação e fatores envolvidos. Foram estudadas epidemias em lavouras de feijão, em condições ambientais naturais prevalecentes no período de inverno no Brasil Central. Os conjuntos de epidemias experimentais objetivaram promover uma série de epidemias de mofo branco. Cinquenta e sete epidemias, representando uma grande variação em níveis de severidade e formas de progresso da doença foram monitorados com atenção específica para os quatro tipos de propágulos considerados. As epidemias foram analisadas por diferentes técnicas estatísticas e três grupos (A, B e C) de epidemias foram identificados. O Grupo A inclui epidemias de lento estabelecimento, desenvolvidas em uma baixa taxa de infecção e levaram a incidências e severidades finais muito baixas. As epidemias no Grupo C tiveram um início precoce, progrediram muito rapidamente com uma taxa de infecção inicialmente elevada, seguida de estabilização. As epidemias no Grupo B apresentaram um comportamento intermediário, inicialmente com baixa taxa de progresso da doença, seguido por um forte aumento da taxa de infecção da folhagem em fases posteriores. Supõe-se que a infeção planta-a-planta (infecção secundária) ocorre raramente em epidemias do grupo A devido menor frequência de contatos efetivos, resultando em um pequeno número de lesões na folhagem e baixa incidência de plantas doentes (média de 12% de incidência). Por outro lado, presume-se que, em epidemias do Grupo C, infecções planta-a-planta ocorrem com frequência, devido maior frequência de contatos efetivos, que conduz a um número muito maior de lesões e maior incidência de plantas doentes (média de 81% de plantas doentes). Portanto, mesmo considerando a relevância do inóculo primário na forma de escleródios e a subsequente formação de apotécios, o papel das infecções subsequentes por outros propágulos em epidemias de mofo-branco deve ser levado em conta. No capítulo 3 é descrita a estrutura de um modelo de epidemias de mofo-branco em feijão que enfatiza os sucessivos tipos de propágulos do patógeno e sua interação com plantas hospedeiras. Um etográfico descrevendo o ciclo de infecção em feijão mofo-branco foi desenvolvido utilizando símbolos e conceitos desenvolvidos para análise de sistemas. Em seguida um modelo simplificado foi construído utilizando o programa STELLA® 10,6 (Isee system, EUA). Em seguida, oito parâmetros do modelo foram ajustados para variar em quatro níveis. Análises de sensibilidade e métodos estatísticos foram então conduzidos a fim de identificar lacunas, quais parâmetros mais contribuem para variabilidade dos resultados e quais parâmetros são altamente correlacionados com as saídas do modelo. A análise de sensibilidade do sub-modelo de germinação de escleródios mostrou que mudanças na taxa relativa de escleródios germinados (RRGSC) causou variação na área abaixo da curva de progresso da doença (AUDPC), que foram menores do que os causados pela variação no número de inicial de escleródios (SC). A análise de sensibilidade do sub-modelo de infecção de flor mostrou que alterações nos valores da taxa relativa de senescência floral (RRFS) causou menor variação na AUDPC do que mudanças na taxa relativa de infecção floral (RRFI). No terceiro sub-modelo de simulação de infecção da folhagem de feijão, a taxa relativa de infecção primária na folhagem (RRP) teve o mais forte efeito sobre os valores AUDPC. Diferentes análises (análise de variância e análise de componentes principais) indicam que SC, RRGS, RRFI, RRP e RRS foram os parâmetros mais importantes do modelo de simulação de epidemias de mofo-branco. Três grupos de epidemias foram estabelecidas utilizando os resultados do modelo (valores de AUDPC) como um critério para a formação de grupos. Como resultados, os três grupos de epidemias foram confirmados pela análise de discriminante envolvendo uma combinação de parâmetros do modelo de simulação mofo branco. Claramente, o patossistemaPhaseolusvulgaris - Sclerotiniasclerotiorum é muito mais complexo do que o modelo teórico geral para doenças "de juros simples", mesmo que a quantidade de inóculo inicial (na forma de propágulo 1, escleródios) permaneça como um dos mais importantes parâmetros, como mostrado por análise de sensibilidade. / Despite the large number of studies on Sclerotiniadiseases on several hosts, the processes composing disease cycles are almost always studied separately.The cycle of Sclerotiniadiseases is complex, and can be divided in four broad phases, corresponding to typical structures of the pathogen life cycle. These phases correspond to the formation and the biological functions of four different types of propagules: (1) sclerotia, (2) apothecia and ascospores, (3) infected petals, and (4) infectious hyphae. An ethograph graphically synthesizes knowledge relevant to epidemiology of a disease. In the first chapter, successive versions of an ethograph are used to discuss the phenomenology of the bean white mould cycle and to highlight relationships among S. sclerotiorum propagules, successive stages of the disease and bean developmental stages. The ethograph describe the phenomenology of bean white mould through the examination of the several stages of the disease cycle in more detail than it is usually attempted and taking into account the concatenation of events. The method is useful to identify key stages and to explicit the relationships among disease stages of the disease cycle, the four types of propagules, and the factors that affect their respective processes of infection. It constitutes an initial step to for the development of a quantitative, simulation model. In Chapter 2 we analysed these successive stage (phases), as well as their regulating processes and factors. Sets of experimental epidemics were created in bean fields under natural environmental conditions prevailing in the winter season in Central Brazil. The sets of experimental epidemics aimed to promote a range of white mould epidemics. Fifty-seven epidemics, representing a wide variation in severity levels and in disease progress shapes, were monitored, with specific attention paid to the four considered propagule types. Epidemics were analysed by different statistical techniques and three groups (A, B, or C) of epidemics were distinguished. Group A includes epidemics which were slow to establish, developed at a low rate, and led to very low terminal incidence and severity. Epidemics in Group C had an earlier onset, progressed very rapidly with an initially high rate of increase, followed by stabilization. Epidemics in Group B displayed an intermediate behaviour, with an initially low rate of disease increase, followed by a strong increase of the rate of foliage infection at later stages. It is assumed that plant-to-plant spread (secondary infection) occurs rarely in Group A epidemics because of the lower frequency of effective contacts, resulting into a small number of lesions on the foliage and low incidence of diseased plants (average 0.12% of incidence). By contrast, it is assumed that, in epidemics of Group C, plant-to-plant spread occurs frequently, because of the higher frequency of effective contacts, leading to a much higher number of lesions and higher incidence of diseased plants (average 0.81% of incidence). Therefore, even if the primary inoculum in the form of sclerotia and the subsequent formation of apothecia are, in part, relevant, the role of subsequent infections by other propagules on white mould epidemics must be taken into account. In chapter 3 we described the structure of a model for bean white mould epidemics that emphasizes on the successive types of pathogen propagules and their interaction with host plants. An ethograph describing the infection cycle in bean white mould was developed using symbols and concepts developed for system analysis and a simplified model was built using the STELLA® 10.6 programme (Isee systems, USA). Next, eight model parameters were set to vary in four levels for model evaluation. Sensitivity analyses and statistical methods were then conducted in order to identify gaps, which inputs contribute most to output variability and which parameters are most highly correlated with the outputs. Sensitivity analysis of the sclerotia germination sub-model showed that changes in the relative rate of germinated sclerotia (RRGSC) caused variation in the area under disease progress curve (AUDPC) that were smaller than those caused by variation in the parameter initial number of sclerotia (SC). Sensitivity analysis of the flower infection sub-model showed that changes in values of the relative rate of flower senescence (RRFS) caused narrower AUDPC variation than changes in the relative rate of flower infection, RRFI. In the third sub-model simulating infection of bean foliage, the relative rate of primary infection on foliage, RRP, had the strongest effect on AUDPC values. Different analyses (analyses of variance and principal component analysis) indicate that SC, RRGS, RRFI, RRP and RRS were the most important parameters of the white mould epidemic simulation model. Three epidemics groups were established using the outputs of the model (AUDPC values) as a criterion for group formation. As a result three epidemic groups were defined by discriminant analysis involving a combination of parameters of the white mould simulation model. Clearly, the bean (Phaseolus vulgaris) - Sclerotiniasclerotiorumpathosystem is much more complex than the theoretical general “simple interest” diseases model, even if the amount of initial inoculum (in the form of propagule 1, sclerotia) remains as one of the most important parameters, as shown by sensitivity analysis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-04-13T14:02:07Z No. of bitstreams: 1 2017_MoanaLimaTavares.pdf: 3476137 bytes, checksum: 86b634a5033a3276f2eeb85ebea21d18 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-18T23:03:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MoanaLimaTavares.pdf: 3476137 bytes, checksum: 86b634a5033a3276f2eeb85ebea21d18 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T23:03:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MoanaLimaTavares.pdf: 3476137 bytes, checksum: 86b634a5033a3276f2eeb85ebea21d18 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais hortaliças cultivadas no mundo. O cultivo de tomateiro representa uma importante atividade econômica e social no Brasil. As viroses representam um grande desafio fitossanitário para as principais regiões produtoras desta hortaliça, sendo que os begomovírus, tospovírus e crinivírus destacam-se pela importância e alta incidência. Recentemente, houve relatos de ocorrência de um tobravírus em tomateiro no Brasil e a carência de informações sobre essa virose justifica uma alta demanda para a realização de estudos sobre esse importante grupo de vírus de plantas. Representantes do gênero Tobravirus apresentam o genoma constituído por RNA senso positivo e bipartido (RNA1 e RNA2). Os tobravírus são transmitidos planta a planta por nematoides de solo e raízes dos gêneros Paratrichodorus e Trichodorus (Família Trichodoridae), considerados seus vetores naturais. Este gênero é representado por apenas três espécies, Tobacco rattle virus (TRV), Pea early-browning virus (PEBV) e Pepper ringspot virus (PepRSV). Conhecido como vírus da mancha anelar do pimentão ou vírus da faixa amarela do tomateiro, o PepRSV foi descrito somente no Brasil, causando doenças nas culturas de pimenta, alcachofra, patchuli e tomate. O primeiro isolado a ser caracterizado foi proveniente de pimenta e é conhecido como isolado CAM (Campinas-SP). Em 2012, a ocorrência de dois isolados de PepRSV foi relatada em tomateiro rasteiro em Luziânia, GO, denominados LAV e Pivo4. O objetivo geral deste trabalho foi estudar a interação de PepRSV com plantas hospedeiras e construir clones infecciosos de PepRSV (isolado CAM e LAV). Dois isolados foram utilizados, CAM de pimentão e LAV, isolado de tomateiro. Inicialmente, estes isolados foram caracterizados biologicamente e um antissoro foi produzido (cap. 2). Adicionalmente, clones infecciosos foram construídos (cap. 3). No capítulo 2, o círculo de hospedeiro foi analisado a partir inoculação mecânica em plantas indicadoras e cultivares de tomateiro. Partículas virais foram purificadas visando a produção de anticorpos em coelhos. A presença das partículas purificadas foi confirmada em microscópio eletrônico de transmissão e o antissoro anti-CP foi produzido. No capítulo 3, descreve-se a construção de clones infeciosos de PepRSV isolado CAM e LAV através da extração de RNA total, seguido por uma RT-PCR do RNA1 e RNA2 que foram inseridos no vetor de clonagem pJL-89 por Gibson Assembly. Os clones de PepRSV (isolado CAM e LAV) gerados foram agroinfiltrados em plantas de N. benthamiana. Conclui-se com esse trabalho que foi possível a produção do antissoro policlonal anti-CP que foi utilizado como técnica de detecção sorológica para determinar o círculo de hospedeiros do isolado CAM de PepRSV (infectou sistemicamente 16 plantas distintas); PepRSV isolado CAM se transloca para o sistema radícular quando inoculado na parte aérea das hospedeiras Nicotiana tabacum ‘Samsun’, N. tabacum ‘TNN’, N. rustica, Capsicum chinense PI159236, C. annuum ‘Ikeda’, S. lycopersicum cv. Santa Clara, Chenopodium quinoa e Gomphrena globosa; as cultivares de tomateiro Santa Clara, AP533, N901, U2006, Money Maker e Gaucho são suceptíveis à infecção por PepRSV isolado CAM; foi detectado um novo isolado de PepRSV denominado Ag1. Finalmente, os clones infeciosos de dois isolados construídos se mostraram infectivos em plantas de N. benthamiana, viabilizando a realização de estudos aprofundados de replicação, transmissão e translocação. / The tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the main vegetables grown in the world. The cultivation of tomato represents an important economic and social activity in Brazil. Viruses represent a major phytosanitary problem for the major growing regions of this vegetable, being the begomovirus, tospovirus and crinivirus the ones with great importance and high incidence. Recently, there were reports of the occurrence of a tobravirus in Brazil and the lack of information about this virus disease justifies a high demand on starting a research on this important virus group. Members of the genus Tobravirus have the genome constituted by positive sense RNA in a bipartite genome (RNA1 and RNA2). Tobraviruses are transmitted plant-by-plant by soil nematodes of the genus Paratrichodorus and Trichodorus (family Trichodoridae), considered as their natural vectors. This genus is represented by only three species, Tobacco rattle virus (TRV), Pea early-browning virus (PEBV) and Pepper ringspot virus (PepRSV). Known as ‘vírus da mancha anelar do pimentão’ or ‘vírus da faixa amarela’, PepRSV is only described in Brazil, causing diseases in pepper, artichoke, patchuli and tomato plants. The first isolate characterized was from pepper and is known as isolate CAM (Campinas-SP). In 2012, the occurrence two isolates of PepRSV was reported in processing tomatoes in Luziânia, GO, denominated LAV and Pivo4 . The general objective of this work was to study the interaction of PepRSV with the host. Two isolates were used, CAM from pepper and LAV, collected in tomato in 2012. Initially, these isolates were characterized biologically and an antibody was produced (Chapter 2). Furthermore, infectious clones were constructed (Chapter 3). In the chapter 2, the host range was analyzed afer mechanical inoculation in indicator plants, and tomato cultivars. Viral particles were purified for the production of antibodies in rabbits. The presence of the purified particles was confirmed by transmission electron microscopy, and an atibody with good specificity was produced. In the chapter 3, PepRSV infectious clones were constructed by extracting total RNA, followed by an RNA-1 and RNA2 RT-PCR that were inserted into the pJL-89 cloning vector by Gibson Assembly and later were agro-infiltrated into susceptible plants. It was concluded that it was possible to produce anti-CP polyclonal antibody; the PepRSV CAM isolate infects 16 different plants systemically; PepRSV isolate CAM translocates to the root system when inoculated on the aerial part of the hosts Nicotiana tabacum 'Samsun', N. tabacum 'TNN', N. rustica, Capsicum chinense PI159236, C. annuum 'Ikeda', S. lycopersicum cv. Santa Clara, Chenopodium quinoa and Gomphrena globosa; the tomato cultivars AP533, N901, U2006, Money Maker and Gaucho were susceptible to infection by PepRSV isolated CAM; a new PepRSV isolate named Ag1 was detected; and finally the clones of PepRSV were infectious to N. benthamiana plants.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-02-27T19:26:39Z No. of bitstreams: 1 2017_BrunoFerreiradeOliveira.pdf: 2786370 bytes, checksum: 3fa18978b4cfb5fb94da7811b2a7dc70 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-03-02T21:18:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BrunoFerreiradeOliveira.pdf: 2786370 bytes, checksum: 3fa18978b4cfb5fb94da7811b2a7dc70 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-02T21:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BrunoFerreiradeOliveira.pdf: 2786370 bytes, checksum: 3fa18978b4cfb5fb94da7811b2a7dc70 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / A antracnose, uma das principais doenças de pós-colheita em jiló (Solanum aethiopicum L.), tem sido pouco investigada em vários aspectos, principalmente no que se refere a etiologia e controle que foram os objetivos desse trabalho. Para que estes estudos fossem conduzidos nas referidas áreas foi necessário que se dispusesse, inicialmente, de uma metodologia adequada que permitisse a reprodução dos sintomas da doença em condições de laboratório. Estabeleceu-se, portanto, um método de inoculação utilizando o isolado Coll-265 dentre os quatro procedimentos: 1) ferimento no fruto com um furo utilizando uma agulha de metal de 1,25 mm de diâmetro + deposição de 15 μL do inóculo (M1); 2) apenas deposição de 15 μL do inóculo sobre o epicarpo do fruto sem ferimento (M2); 3) ferimento no fruto com um furo utilizando uma agulha de metal de 1,25 mm de diâmetro + deposição de um disco de 0,5 cm de diâmetro de BDA com cultivo do fungo (M3) e 4) apenas deposição de um disco de 0,5 cm de diâmetro de BDA com cultivo do fungo sobre o epicarpo do fruto (M4). A concentração estimada do inóculo foi de 2 x 105 conídios/mL. Nas testemunhas foram depositadas água destilada esterilizada e disco de BDA sem cultivo do fungo. Avaliou-se a incidência e o diâmetro médio da lesão por tratamento. Os dados de diâmetro da lesão foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey a 0,05 de probabilidade. Após, quinze isolados de Colletotrichum obtidos de antracnose em jiló foram testados quanto à virulência em frutos da cultivar Tinguá. Avaliou-se incidência de antracnose, diâmetro médio da lesão, períodos de incubação e latência. Os dados de diâmetro médio da lesão foram submetidos à ANOVA e testes de média Tukey e Dunnet ao nível de 5 % de significância. Em seguida, um isolado, dentre os mais virulentos, foi identificado com base em sequências de regiões genômicas gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), actina (ACT) e beta-tubulina (TUB2), enquanto que os demais isolados virulentos foram identificados com base apenas na região genômica GAPDH. Duas árvores filogenéticas foram geradas por ‘Máxima Verossimilhança’, uma para análise multigene utilizando as sequências concatenadas e outra para GAPDH. In vitro foi observado o crescimento micelial do isolado Coll-265 em meio com quitosana nas seguintes condições: 1) batata-dextrose-ágar com quitosana a 0,1 %; 2) batata-dextrose-ágar com quitosana a 0,2 %; 3) batata-dextrose-ágar com quitosana a 0,3 % e 4) batata-dextrose-ágar com quitosana a 0,4 %. Como testemunha, apenas batata-dextrose-ágar. Todas as placas foram armazenadas em BOD a 25°C e fotoperíodo de 12 h. Iniciou-se a avaliação 48 h após a implantação do experimento pela medição do crescimento radial do fungo em dois sentidos opostos, repetindo-se a medição a cada 48 h até completar 10 dias. A taxa de crescimento micelial e a porcentagem de inibição do crescimento micelial foram calculadas. Repetiu-se uma vez o experimento adotando as mesmas condições. Para análise estatística, fez-se ANOVA, teste F e regressão. Para controle in vivo, jilós foram submetidos aos tratamentos: T1 – não revestidos e não inoculados; T2 – não revestidos e inoculados; T3 – revestidos com quitosana a 0,1 % e inoculados; T4 – revestidos com quitosana a 0,2 % e inoculados e T5 – revestidos com quitosana a 0,3 % e inoculados. Os tratamentos T1 e T2 serviram como testemunhas. Analisou-se perda de massa fresca; incidência média da doença e severidade da doença. Repetiu-se uma vez o experimento adotando as mesmas condições. Os valores de severidade da doença de cada tratamento foram utilizados para o cálculo da AACPD. Para análise estatística, fez-se ANOVA, teste F e regressão. Utilizou-se DIC para todos os experimentos. Concluiu-se que M1 foi o mais efetivo para reprodução de sintomas de antracnose em laboratório sendo utilizado nos experimentos posteriores, quando necessário. Os isolados Coll-182, Coll-265, Coll-266, Coll-297, Coll-586 e Coll-588 foram os mais virulentos, com destaque para Coll-265 e Coll-266 que apresentaram as maiores médias de diâmetro da lesõe e 100 % de incidência de antracnose. Todos os isolados virulentos foram identificados molecularmente como Colletotrichum tamarilloi. In vitro, a quitosana em todas as concentrações testadas inibiu o crescimento micelial do fungo. In vivo, o revestimento de quitosana a 0,2 % (T4) reduziu a severidade da antracnose em jiló pós-colheita, mas não impediu a sua incidência. / Anthracnose, a major post-harvest disease in scarlet eggplant fruit (Solanum aethiopicum L.), has been little investigated in several aspects, mainly regarding etiology and control, which were the objectives of this work. For these studies to be conducted it was necessary initially to have an adequate methodology that would allow the reproduction of the symptoms of the disease under laboratory conditions. A method of inoculation using the Coll-265 isolate was therefore established among the four procedures: 1) injury in the fruit with a metal needle bore of 1.25 mm diameter + deposition of 15 μL of the inoculum (M1); 2) only deposition of 15 μL of the inoculum on the epicarp of the uninjured fruit (M2); 3) injury in the fruit with a metal needle hole of 1.25 mm diameter + deposition of a 0.5 cm diameter BDA disc with fungus culture (M3) and 4) only deposition of a 0.5 cm diameter BDA disc with fungus culture on the epicarp of the fruit (M4). The estimated concentration of the inoculum was 2 x 105 conidia/ mL. Sterilized distilled water and BDA disc without culture of the fungus were deposited in the controls. The incidence and mean diameter of the lesion in each treatment were evaluated. The data of mean diameter of the lesion were submitted to ANOVA and Tukey's test at 0.05 probability. Fifteen isolates of Colletotrichum obtained from anthracnose in scarlet eggplant fruit were tested for virulence in Tinguá fruits. The incidence of anthracnose, mean lesion diameter, incubation and latency period were evaluated. The data of mean diameter of the lesion were submitted to ANOVA and Tukey’s and Dunnet’s mean tests at the 5% level of significance. The most virulent isolates were identified based on genomic sequences of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), actin (ACT) and beta-tubulin (TUB2), whereas the other virulent isolates were identified based only on the GAPDH genomic region. Two phylogenetic trees were generated by ‘Maximum Likelihood’, one for multigene analysis using the concatenated sequences and another for GAPDH. In vitro, the mycelial growth of the Coll-265 isolate in chitosan medium was observed under the following conditions: 1) potato-dextrose-agar with 0.1% chitosan; 2) potato-dextrose-agar with 0.2% chitosan; 3) potato-dextrose-agar with 0.3% chitosan and 4) potato-dextrose-agar with 0.4% chitosan. As a control, only potato-dextrose-agar. All plates were stored in BOD at 25°C and photoperiod of 12 h. The evaluation was iniciated 48 h after the implantation of the experiment by measuring radial growth of the fungus in two opposite directions, repeating the measurement every 48 h until completing 10 days. The mycelial growth rate and percent inhibition of mycelial growth were calculated. The experiment was repeated once under the same conditions. For statistical analysis, we performed ANOVA, F test and regression. For the in vivo control test, scarlet eggplant fruits were submitted to treatments: T1 - uncoated and uninoculated; T2 - uncoated and inoculated; T3 - coated with 0.1% chitosan and inoculated; T4 - coated with 0.2% chitosan and inoculated and T5 - coated with 0.3% chitosan and inoculated. The T1 and T2 treatments served as controls. Loss of fruit fresh mass was analyzed; mean incidence of disease and severity of the disease. The experiment was repeated once under the same conditions. The disease severity values of each treatment were used to calculate AACPD. For statistical analysis, we performed ANOVA, F test and regression. DIC was used for all experiments. It was concluded that M1 was the most effective for reproduction of anthracnose symptoms in the laboratory and, therefore, it was used in later experiments when necessary. Coll-265, Coll-266, Coll-266, Coll-297, Coll-586 and Coll-588 isolates were the most virulent, with Coll-265 and Coll-266 showing the highest lesion diameter means and 100% incidence of anthracnose. All virulent isolates were molecularly identified as Colletotrichum tamarilloi. In vitro, chitosan at all concentrations tested inhibited fungal mycelial growth. In vivo, the 0.2% chitosan coating (T4) reduced the severity of anthracnose in post-harvest jelly but did not prevent its incidence.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-01-05T14:35:38Z No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-08T21:24:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T21:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / A murcha bacteriana, atualmente reconhecida como sendo causada por um complexo de espécies do gênero Ralstonia (Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum e R. syzygii) apresenta uma ampla diversidade, podendo ser dividida em raças, biovares, filotipos e sequevares. O objetivo deste trabalho foi: (i) ampliar os conhecimentos sobre o importante complexo de espécies de Ralstonia por meio da caracterização biológica, bioquímica e molecular do isolado CNPH-RS 488, que se mostrou capaz de suplantar a resistência da linhagem ‘Hawaii 7996’; (ii) gerar um novo protocolo de identificação de biovares por meio de técnicas moleculares, visando aumentar a eficiência do processo e reduzir os custos associados com o teste de biovar; (iii) identificar novas fontes de resistência em tomateiro à murcha bacteriana em germoplasma selvagem de Solanum, considerando o melhoramento antecipatório contra possíveis novos variantes do patógeno, como o isolado CNPH-RS 488; (iv) gerar informações sobre o patossistema Coffea – Ralstonia. No presente estudo, o isolado CNPH-RS 488 foi classificado quanto ao biovar e filotipo, e foram caracterizados o seu perfil de virulência, a capacidade de suplantar de resistência da linhagem ‘Hawaii 7996’, a produção de EPS e de biofilme, bem como a sensibilidade a antibióticos e sua gama de hospedeiras. Os sistemas de marcadores RAPD/SCAR em associação com a estratégia de bulk segregant analysis foram inicialmente empregados visando o desenvolvimento de primers específicos para identificação de biovares. Para a busca por novas fontes de resistência avaliou-se uma coleção de 75 genótipos de Solanum peruvianum em comparação com as linhagens controle ‘Hawaii 7996’ (resistente) e ‘L390’ (suscetível). Os genótipos foram inoculados com os isolados CNPH-RS 488 (biovar 2A) e CNPH-RS 489 (biovar 1). O status do cafeeiro como hospedeira do complexo de espécies de Ralstonia foi demonstrado em bioensaios com nove isolados em três cultivares de Coffea arabica, comparando com a resposta do tomateiro suscetível ‘San Vito’. A confirmação da capacidade de suplantação da resistência do ‘Hawaii 7996’ pelo CNPH-RS 488 não pôde ser explicada pelos testes de produção de exopolissacarídeo e biofilme. Foi também constatado que o isolado apresenta uma maior virulência sobre espécies mais resistentes como jiló e berinjela. Onze primers RAPD foram selecionados com potencial valor diagnóstico para identificação de biovares. Amplicons obtidos com quatro primers que geraram marcadores estáveis foram clonados e a informação de sequência foi utilizada para o desenho dos primers do tipo SCAR. Os primers J1-B1-B e SCAR-i18-B2A apresentaram especificidade parcial para isolados de biovar 1 e 2A, respectivamente. Para a biovar 3, foi empregada uma estratégia de subtração in silico que permitiu o desenho de um par de primers específico para a região do gene polS (codificador da enzima sorbitol desidrogenase). Sete genótipos dos 75 de S. peruvianum foram considerados como promissoras fontes para o melhoramento do tomateiro visando à resistência à murcha bacteriana. O cafeeiro se mostrou suscetível exclusivamente a isolados de R. pseudosolanacearum, indicando os potenciais riscos que a murcha bacteriana pode apresentar para a cafeicultura brasileira. O presente trabalho destaca que a existência de isolados capazes de suplantar a resistência do tomateiro, como o CNPH-RS 488, e isso implica em potenciais riscos da disseminação dos mesmos pelo país, podendo inviabilizar as cultivares de tomateiro atualmente disponíveis no mercado e que usam a linhagem ‘Hawaii 7996’ como parental. Estudos adicionais sobre esse variante do patógeno serão necessários bem como o desenvolvimento de programas de melhoramento com novas fontes de resistência efetivas contra isolados com um perfil de virulência similar ao apresentado pelo CNPH-RS 488. / The bacterial wilt is currently recognized as being caused by a complex of three species: Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum, and R. syzygii. The causal agents of the bacterial wilt display a wide diversity, being classified in races, biovars, phylotypes, and sequevars. The objective of the present thesis was: (i) add new information about this important bacterial complex via biological, biochemical and molecular characterization of the isolate R. solanacearum CNPH-RS 488, which was found to be able to break down the resistance of the tomato (Solanum lycopersicum) inbred line ‘Hawaii 7996’; (ii) develop a new protocol for molecular characterization of biovars, focusing on making a faster and cheaper biovar identification test; (iii) search for new sources of resistance to bacterial wilt disease within a germplasm collection of wild Solanum (section Lycopersicon) species, using the preemptive breeding and developing new resistant cultivar to new and atypical strains like the CNPH-RS 488; (iv) study and characterize a new pathosystem: Coffea – Ralstonia. Studies with the isolate R. solanacearum CNPH-RS 488 involved different approaches: (1) determination of its biovar and phylotype; (2) determination of its virulence profile, including the capability of breaking down the resistance of ‘Hawaii 7996’; (3) production of exopolysaccharides (EPS) and biofilm; (4) antibiotic sensitivity, and (5) host range. The RAPD/SCAR marker systems in association with bulk segregant analysis was the strategy initially employed aiming to develop biovar-specific PCR-based markers. The search for new sources of resistance to bacterial wilt was carried using 75 Solanum peruvianum accessions and two standard lines ‘Hawaii 7996’ (resistant) and ‘L390’ (susceptible). Bioassays were carried out with two isolates, CNPH-RS 488 (biovar 2A) and CNPH-RS 489 (biovar 1). For the study of coffee as a host of the Ralstonia species complex, plants of three C. arabica cultivars were inoculated with a collection of nine isolates and their reactions were compared with that of the susceptible standard (tomato ‘San Vito’). The ‘Hawaii 7996’-resistant breaking ability of the isolate CNPH-RS 488 could not be explained by EPS and biofilm production. In addition, it was found that this isolate displayed a wider virulence profile being also able to infect accessions of scarlet eggplant and eggplant (which are naturally more tolerant to bacterial wilt). Eleven RAPD primers with potential diagnostic value for biovar were selected. Four stable amplicons (generated by four RAPD primers) were gel-purified and cloned. The sequence information was used for the design of SCAR-like primers. The primers J1-B1-B and SCAR-i18-B2A displayed partial specificity to isolates biovar 1 and 2A, respectively. For the biovar 3, it was employed the in silico subtraction technique, which allowed the design of a polS (sorbitol dehydrogenase) gene-specific primer. Seven out of the 75 S. peruvianum accessions were considered as promising sources for future use in tomato breeding programs to bacterial wilt resistance. Coffee accessions were susceptible exclusively to R. pseudosolanacearum isolates, indicating the potential risk of the bacterial wilt for the Brazilian coffee production. The present work emphasizes the existence of isolates (such as the CNPH-RS 488), which are able to break down the major sources of resistance available in tomato breeding programs. The present work also points out the potential risks of the spread of isolates with similar virulence profile across the country, which may preclude the employment of ‘Hawaii 7996’ as parental material. More studies on these variants will be necessary aiming to help the tomato breeding programs in the search for new sources of resistance to isolates with virulence profiles similar to CNPH-RS 488.