Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-09-22T13:02:53Z No. of bitstreams: 1 2008_RafaelSilvaMenezes_reduzida.pdf: 20654763 bytes, checksum: 4423ec3685c8657fc6746894fe8ac460 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2010-10-11T10:42:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RafaelSilvaMenezes_reduzida.pdf: 20654763 bytes, checksum: 4423ec3685c8657fc6746894fe8ac460 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-11T10:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RafaelSilvaMenezes_reduzida.pdf: 20654763 bytes, checksum: 4423ec3685c8657fc6746894fe8ac460 (MD5) / Este trabalho teve como objetivo selecionar e caracterizar através de métodos bioquímicos e moleculares estirpes de B. thuringiensis tóxicas contra Agrotis ipsilon. Bioensaios seletivos foram realizados com 71 estirpes selecionadas pela sua atividade contra insetos da ordem Lepidoptera. As estirpes que causaram mortalidade de 100% pertencem aos sorotipos galleriae (S597), sotto (S615), aizawiai (S616) e kurstaki (S1450) descritos na literatura como tóxicos a Lepidopteros. As estirpes denominadas S907 e S1168 também causaram 100% de mortalidade. As estirpes S906, S234 e S844 causaram 75%. Testes moleculares foram realizados com as estirpes S597, S615 e S844, as quais não haviam ainda sido caracterizadas, enquanto as demais já tinham sua caracterização bioquímica e molecular descritas. Os resultados dos testes moleculares obtidos com a estirpe S615 identificaram a presença dos genes cry1Ab, cry1Ac e cry2. A estirpe S844 mostrou a presença dos genes cry2 e cry11. Na estirpe S597 nenhum gene cry foi indentificado, de acordo com a metodologia empregada. Objetivando a identificação da atividade tóxica individual de proteínas Cry foram conduzidos bioensaios para determinação da dose letal necessária para causar mortalidade em 50% da população (CL50) de lagartas de S. frugiperda. Utilizou-se para isso, as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2A presentes no B. thuringiensis subespécie kurstaki HD-1 (Btk). Adicionalmente, foram conduzidos experimentos para verificação da ligação dessas proteínas a receptores de membrana de lagartas de S. frugiperda. Três estirpes recombinantes de B. thuringiensis e uma estirpe nativa foram utilizadas nesse trabalho para a produção das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2A. Bioensaios de dose com lagartas de segundo instar de S. frugiperda apresentaram CL50 de 12,416 ng/cm2, 13.434 ng/cm2, 108,773 ng/cm2 e 164,350 ng/cm2, respectivamente, evidenciando diferentes atividades tóxicas. Os resultados dos ensaios de ligação realizados com VMMAs de S. frugiperda demonstraram ligações de diferentes intensidades a receptores de membrana com as proteínas Cry1Aa e Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2A marcadas com biotina. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work aimed to select and characterize through bioassays and biochemical and molecular methods, strains of B. thuringiensis which are toxic for Agrotis ipsilon. Selective bioassays were done with 71 strains, selected according to toxic activity against Lepdopteran insects. Some Bt strains caused 100% of mortality to A. ipsilon larvae. These strains belonged to serotypes galleriae (S597), sotto (S615), aizawiai (S616), kurstaki (S1450) described as toxic against Lepdopteran insects. The strains named S906, S234 and S844 caused mortality of 75% to A. ipsilon larvae. Molecular analysis were conduced using the strains S597, S615 and S844, which have no characterization described, while all others strains had biochemical and molecular characterization described. The results from molecular tests obtained with strain S615 identified the presence of genes cry1Ab, cry1Ac and cry2. The strain S844 showed the presence of genes cry2 and cry11. On strain S597 wasn’t identified any gene cry, according to methodology employed. Aiming the identification of individual toxic activity of Cry proteins were conduced bioassays for determination of lethal dosis necessary to causes mortality in 50% of population (LC50) of S. frugiperda larvae. Were used the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A present in B. thuringiensis subspecies kurstaki HD- 1 (Btk). Additionally, experiments to verify the binding of these proteins to membrane cell receptors of S. frugiperda larvae were conduced. Three recombinant strains of B thuringiensis and one wild type strain were utilized at this work to produce of proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A. Bioassays with S. frugiperda larvae of second instar showed LC50 of 12.416 ng/cm2, 13.434 ng/cm2, 108.773 ng/cm2 and 164.350 ng/cm2, respectively, evidencing different toxic activity. The results of binding assays done with BBMV (brush border membrane vesicles) of S. frugiperda showed binding with membrane cell receptors of proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A marked with biotin.

Orientador: Norberto da Silva / Resumo: Com objetivo de avaliar a reação ao oídio de onze linhagens F5Rc1 de ervilha de vagens comestíveis e avaliar o impacto da doença nas características comerciais, realizou-se um experimento na Fazenda Experimental São Manuel / UNESP Botucatu. Juntamente com as linhagens, foram avaliadas as cultivares Torta de Flor Roxa e Triofin, como padrões de suscetibilidade e resistência ao oídio, respectivamente. Metade das plantas foram tratadas com fungicida fenarimol e a outra metade foi conduzida sem nenhum tipo de controle da doença Para quantificação da severidade do oídio, foram desenvolvidas escalas diagramáticas que se mostraram de fácil e rápida utilização. Todas as linhagens de ervilha de vagens comestíveis avaliadas apresentaram um bom nível de resistência ao oídio, quando comparadas com a cultivar Torta de Flor Roxa, sendo que a doença não afetou o peso total e o comprimento de vagens. / Abstract: An experiment was set out under vinil house conditions to evaluate eleven pod pea breeding lines to powdery mildew caused by Erysiphe pisi and to check the impact of the disease on pod production. Resistant cultivar Triofin and susceptible cultivar Torta de Flor Roxa were utilized as control and the disease was evaluated by a diagramatic key basead on percentage of affected leaves. Area under the disease progress curve (AUDPC) and percentage of disease were utilized for comparing diferent progenies and checks. It's observed that progenies were as resistant as Triofin when AUDPC was utilized as a evaluation parameter and that powdery mildew did not affected pod yield and lenght. / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Danyelle Mayara Silva (danielemaiara@gmail.com) on 2009-09-08T11:38:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_KennyBonfim.pdf: 2688589 bytes, checksum: 124b1b3f0d729f713ef58718c23aa640 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-09-10T16:01:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_KennyBonfim.pdf: 2688589 bytes, checksum: 124b1b3f0d729f713ef58718c23aa640 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-10T16:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_KennyBonfim.pdf: 2688589 bytes, checksum: 124b1b3f0d729f713ef58718c23aa640 (MD5) Previous issue date: 2007 / A produção mundial de feijão, compreendendo os gêneros Phaseolus e Vigna, é superior a 18 milhões de toneladas e o Brasil ocupa o segundo lugar na produção mundial e o primeiro quando se trata apenas do gênero Phaseolus. Entretanto, sua produção ainda está aquém do necessário para suprir a demanda interna. Dentre os principais problemas relacionados com a baixa produção de feijão no Brasil estão a competição com plantas daninhas, estresse hídrico e o ataque de pragas e doenças como mosaico dourado do feijoeiro causado por um geminivírus. O Bean golden mosaic virus (BGMV), é transmitido por mosca-branca (Bemicia tabaci) de uma forma persistente, circulativa, causando mosaico dourado em feijão comum (Phaseolus vulgaris). Os sintomas característicos são: mosaico verde amarelado nas folhas, nanismo e vagens distorcidas. A doença é largamente disseminada nas regiões de produção de feijão no Brasil e América Latina causando perdas severas (40 -100%). Neste trabalho, a tecnologia de RNA interferente foi explorada usando uma seqüência do gene viral AC1 para gerar plantas transgênicas de feijão comum altamente resistentes a geminivírus. Desta maneira o gene viral (AC1) foi escolhido para a construção do vetor de transformação uma vez que a proteína Rep exerce uma função essencial no ciclo de infecção viral. Rep não é uma replicase porém é a única proteína requerida para a replicação do genoma viral. O vetor pBGMVRNAiAHAS foi construído a partir de um fragmento de DNA de 411 pb do gene AC1 do BGMV (_1836-2247, acesso no GeneBank No. M88686). Dezoito linhagens de feijão foram obtidas com a construção de interferência, as quais poderão induzir o silenciamento pós-transcricional do gene AC1. Uma linhagem (denominada 5.1) apresentou alta resistência (aproximadamente 93% das plantas não apresentaram sintomas) após alta pressão de inoculação (mais de 300 moscas-brancas virulíferas por planta). Os siRNAs específicos foram detectados nas plantas transgênicas, ambas inoculadas e não inoculadas. Uma análise de PCR semiquantitativo revelou a presença do DNA viral nas plantas transgênicas expostas a moscas-brancas virulíferas por um período de 6 dias. Entretanto, após a retirada dos insetos, não foi detectado DNA viral após um período adicional de seis dias. Devido à importância social e econômica do feijão na América Latina e à falta de genes para resistência a doenças nos bancos de germoplasma, faz-se necessário o desenvolvimento de um programa de melhoramento associado à engenharia genética para o lançamento de novas variedades, que possibilitará a diminuição dos principais problemas relacionados a esta cultura. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Production of beans, including the genus Phaseolus and Vigna, is superior to 18 million tons. Brazil is the secondlargest producer of both species genus and the major world producer of Phaseolus. However, its production is still below the necessary to supply the internal demand. Competition with weeds, abiotic stress and the occurrence of diseases as bean golden mosaic are some of the main problems related to its low production. Bean golden mosaic virus (BGMV), is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci in a persistent, circulative manner, and causes the golden mosaic of common bean (Phaseolus vulgaris) which characteristic symptoms are yellow-green mosaic of leaves, stunting, and fruit distortion. The disease is the largest constraint on bean production in Brazil and Latin America and causes severe yield losses (40 to 100%). Here we explored the RNAi concept to silence the AC1 viral gene and generate high resistant transgenic common bean plants. Since the Rep protein performs an essential function in the viral infecting cycle, the AC1 gene was chosen to construct the transformation vector. Rep is not the replicase, but the only protein required for the replication of the viral genome. The vector pBGMVRNAiAHAS was constructed using the 411 bp fragment from the AC1 gene (_1836-2247, GeneBank accession No. M88686). Eighteen transgenic common bean lines were obtained with the construction to induce post-transcriptional gene silencing against AC1 gene. One line (named 5.1) presented high resistance (approximately 93% of plants free of symptoms) upon inoculation at high pressure (more than 300 viruliferous whiteflies per plant). Transgene-specific siRNA were detected in both inoculated and noninoculated transgenic plants. A semi-quantitative PCR analysis revealed the presence of virus DNA in transgenic plants exposed to viruliferous whiteflies for a period of six days. However, when insects were removed, no virus DNA could be detected after an additional period of six days. Due to its social and economical importance in Latin America and to the lack of genes for resistence, it is necessary to develop an improving program associated to genetic engineering in order to generate new varieties. It Shall allow the decreasing to the production of beans

FREITAS, C. D. T. Proteínas do látex de Calotropis procera (Ait.)R.Br. e seus efeitos sobre pragas agrícolas. 2006. 118 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-24T19:40:31Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_cdtfreitas.pdf: 775346 bytes, checksum: 9b054b28e167e8aa04f9d5d7aed273a8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-15T21:19:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_cdtfreitas.pdf: 775346 bytes, checksum: 9b054b28e167e8aa04f9d5d7aed273a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-15T21:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_cdtfreitas.pdf: 775346 bytes, checksum: 9b054b28e167e8aa04f9d5d7aed273a8 (MD5) Previous issue date: 2006 / The plant Calotropis procera belonging to Asclepiadaceae is found around a vast extension of the Northeast from Brazil. It is a lactifers plant and its endogenous production of latex is admirable. Despite continuous reports appearing in the literature give mention to the medicinal properties of different parts of the plant, including the latex, there is not scientific approaches comprising biochemical of functional aspects of the latex from C. procera. The aims this work was determine the presence of endogenous enzymatic activities and inhibitory activity against different proteases and a-amylase, to evaluate insecticidal properties against different crop pests and to correlate enzymatic content and insecticidal action with possible role of the latex in protecting the plant to insect pathogens. The major soluble protein fraction from the latex was prepared following the protocol previously defined that includes centrifugations and dialysis steps. The protein fraction devoided of rubber and low molecular mass molecules was assayed to the presence of endogenous proteolytic activities as well as a-amylase activity. Even, the presence of inhibitor of such activities was investigated. Additionally the latex proteins were submitted to proteolysis by digestive content of different insects. Bioassays base on artificial diets with different contents of native, pronase digested or heated treated (98 °C) latex proteins were performed against six insects belonging to 4 different orders. Increment in bodyweight of larvae, time of development and percentage of survive were the parameters considered to analyze detrimental effects of latex proteins upon insects. The effect of latex proteins upon Callosbruchus maculatus insects by continuous exposure until F-6 generation was reached was performed. It was found strong endogenous proteolytic activity and latex proteins were resistent to proteolysis by insect digestive extracts. In addition chitinolytic activity was also detected. The latex exhibited insecticidal activity against different insect groups and this effect may be correlated to the presence of a cysteine protease inhibitor associated to its proteolytic properties and chitinolytic activity. It is suggested that the protein fraction of the latex from Calotropis procera plays a relevant role in defending the plant against pathogens. / A planta Calotropis procera pertencente à família Asclepiadaceae é encontrada em vasta extensão do Nordeste Brasileiro. É uma planta laticífera e sua produção endógena de látex é extraordinária. Embora haja na literatura científica diversas publicações que relatam o potencial medicinal de diversas partes da planta, principalmente de seu látex, não há ainda uma abordagem bioquímica e funcional de seu fluido laticífero. Esta pesquisa foi desenvolvida no sentido de proceder a um estudo bioquímico parcial de atividades endógenas da fração protéica majoritária do látex e de avaliar seus efeitos inseticidas sobre diferentes modelos de pragas agrícolas. A fração protéica majoritária do látex foi preparada a partir de um protocolo previamente desenvolvido no laboratório em que são envolvidas etapas de centrifugação e diálise. A fração protéica isenta de borracha e de moléculas de baixa massa molecular foi testada para atividades enzimáticas endógenas proteolíticas, quitinásicas e a-amilásica e atividades inibitórias para proteases e a-amilase. Ensaios enzimáticos de digestão das proteínas do látex por extratos digestivos de insetos foram também realizados. Bioensaios utilizando-se dietas artificiais contendo diferentes proporções das proteínas do látex íntegras, digeridas por pronase ou aquecidas a 98 °C foram realizados com seis insetos pertencentes a quatro ordens. Nos bioensaios foram avaliados parâmetros tais como desenvolvimento, sobrevivência, tempo de emergência dos indivíduos além de ser avaliado o efeito cumulativo de proteínas do látex na dieta por sucessivas gerações. Na fração protéica do látex foram encontradas atividades proteolíticas do tipo cisteínica e serínica, além de atividade quitinolítica. Não foi detectada atividade a-amilásica. Soluções de proteínas do látex não exibiram atividade inibitória do tipo a-amilásica e tripsínica ou quimiotripsínica. Após tratamento térmico, proteínas do látex ainda solúveis foram capazes de inibir a atividade da papaína. Posteriormente esta atividade inibitória foi capaz de inibir as atividades proteolíticas de Callosobruchus maculatus e Dysdercus peruvianus. As proteínas do látex foram inseticidas para C. maculatus, Zabrotes subfasciatus, Anticarsia gemmatalis e Ceratitis capitata enquanto que não foram para Spodoptera frugiperda e D. peruvianus. Não houve efeito deletério acumulativo em insetos submetidos a uma dieta contendo proteínas do látex durante seis gerações. Quando digeridas por pronase e aquecidas por 30 min a 98 °C, a ação inseticida das proteínas do látex ainda foi mantida sobre o C. maculatus. As proteínas do látex foram completamente resistentes à proteólise por enzimas digestivas de Dysdercus peruvianus e Callosobruchus maculatus. Entretanto, a ação proteolítica endógena do látex promoveu a proteólise do extrato enzimático de C. maculatus embora isto não tenha ocorrido no extrato intestinal de D. peruvianus. O látex de C. procera apresenta forte atividade proteolítica e resistência à proteólise por enzimas digestivas de insetos. Atividade quitinolítica foi também observada. O látex possui atividade inseticida para diferentes pragas agrícolas e esta atividade parece estar associada à presença de um inibidor de atividade proteolítica do tipo cisteínica, além da presença de quitinases e elevada atividade proteolítica endógena. Assim, a fração protéica do látex pode ser considera como parte constituinte da defesa da planta contra insetos.

Orientador : Prof. Dr. Álvaro Figueredo dos Santos / Co-orientador : Prof. Dr. Dauri José Tessmann / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Defesa: Curitiba, 28/02/2016 / Inclui referências : f. 56-64 / Área de concentração: Produção vegetal / Resumo: A área plantada com pupunheira (Bactris gasipaes Kunth var. gasipaes Henderson) para a produção de palmito tem aumentado nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Tocantins, São Paulo, Paraná e Santa Catarina. Nestas regiões, os plantios dessa palmeira são atacados pela doença conhecida como podridão da base do estipe (PBE), associada ao oomiceto Phytophthora. As plantas doentes apresentam amarelecimento da primeira e segunda folha aberta e da folha bandeira seguido de morte da touceira. Há poucos trabalhos sobre a etiologia desta doença. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar com base em características morfológicas, fisiológicas e moleculares, os isolados de Phytophthora provenientes de plantios de pupunheira visando a sua identificação específica. Utilizou-se 31 isolados de Phytophthora oriundos de plantios de pupunheira dos estados de São Paulo (Eldorado, Cajati e Registro), Paraná (Paranaguá e Morretes) e Santa Catarina (Massaranduba, Garuva e Joinville). Avaliou-se o crescimento micelial dos isolados de Phytophthora sp. em oito temperaturas (8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 e 36 °C), o aspecto das colônias, a produção de esporângios, clamidósporos e oósporos. Foram realizadas medições de 50 estruturas de cada isolado. Procedeu-se análise molecular dos isolados com base nas regiões ITS1 e ITS2 e Cox1 e Cox2. Foram observados três padrões de colônia classificados em ligeiramente estrelado, estrelado e cotonoso, sendo o ligeiramente estrelado mais frequente. Não houve crescimento micelial nas temperaturas de 8 °C e 36 °C, sendo a temperatura ótima de 23,7 °C. Os esporângios foram caracterizados como papilados e caducos, elipsoides, em sua maioria, com medidas entre 21,1 - 84,8 ?m de comprimento e 17,4 - 41,7 ?m de largura, com pedicelos curtos, entre 0,4 - 6,6 ?m formados em ontogenia simpodial. A relação comprimento/largura (C/L) variou de 1,3 - 1,9. As papilas mediram entre 0,9 - 11,2 ?m de profundidade e 0,5 - 11,4 ?m de largura. Clamidósporos mediram de 20,0 - 53,6 ?m de diâmetro e 0,3 - 4,4 ?m de espessura de parede, apresentaram-se globosos, terminais e intercalares. Todos os isolados tiveram natureza heterotálica, pertencentes ao tipo A1. Os oósporos globosos, apleróticos e sem ornamentações nas paredes mediram de 26,0 - 63,6 ?m, com anterídios anfígenos e oogônios medindo entre 32,2 - 72,4 ?m. Com base nas características morfofisiológicas e moleculares, os isolados de pupunheira foram enquadrados na espécie Phytophthora palmivora (Butler) Butler. Palavras-chave: Taxonomia, Oomiceto, Bactris gasipaes, Patologia Florestal, etiologia. / Abstract: The area planted with peach palm (Bactris gasipaes) for palm heart production has increased in Brazil, especially in the states of Bahia, Espirito Santo, Rio de Janeiro, Tocantins, São Paulo, Paraná and Santa Catarina. In these regions, both young and adult plantations of this palm tree are attacked by several diseases, standing out the disease known as stem base rot (SBR), which is associated to the oomycete Phytophthora. Diseased plants are characterized by yellowing of the first and second open leaf and the flag leaf followed by the death of the clump. There are few studies on the etiology of this disease. Thus, the main objective of this study was to characterize the Phytophthora isolates from peach palm and thirty one isolates of Phytophthora originated from peach palm plantations from the states of São Paulo (Eldorado, Cajati and Registro), Paraná (Paranaguá and Morretes) and Santa Catarina (Massaranduba and Joinville) were used in order to obtain their specific identification. It was evaluated the mycelial growth of Phytophthora sp. isolates in eight temperatures (8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 e 36 °C), the aspect of the colonies and the production of sporangia, chlamydospores and oospores. Also, measurements of the each structure were taken being 50 structures per isolate. It was proceeded the molecular analysis of the isolates based on the analysis of the ITS1 and ITS2 and Cox1 and Cox2 regions. It was observed three colony patterns classified into slightly starry, starry and cottony, being the slightly starry the most frequent. There was no mycelial growth at 8 °C and 36 °C and the optimum temperature range for growth was 23.7 °C. Sporangia presented, mostly ellipsoid, measurements between 23.7 - 84.8 ?m long and 17.4 - 41.7 ?m wide and were characterized as papillate, caducous, with pedicels long to short, measuring between 0.4 - 6.6 ?m, formed in simpodial ontogeny. The length/width ratio (L / W) ranged from 1.3 - 1.9. The papillae measured between 0.9 - 11.2 ?m deep and 0.5 - 11.4 ?m wide. Chlamydospores measuring between 20.0 - 53.6 ?m in diameter and 0.3 - 4.4 ?m of wall thickness, were globular, terminals and intermediate. All isolates were classified as heterothallic, belonging to A1 type. Oospores measuring between 26.0 - 63.6 ?m were globose, aplerotic and with unornamented walls, with amphigenous antheridia and oogonia measuring between 32.2 - 72.4 ?m. Based on the morphological, physiological and molecular characteristics, the peach palm isolates belong to the specie Phytophthora palmivora Butler. Key-words: Taxonomy, oomycete, Bactris gasipaes, Forest Patology, etiology.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-08T15:32:15Z No. of bitstreams: 1 2012_EderMarques_Parcial.pdf: 5107444 bytes, checksum: 349073f1d914e332ff3eeb2b86f6289a (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-10T12:08:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_EderMarques_Parcial.pdf: 5107444 bytes, checksum: 349073f1d914e332ff3eeb2b86f6289a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-10T12:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_EderMarques_Parcial.pdf: 5107444 bytes, checksum: 349073f1d914e332ff3eeb2b86f6289a (MD5) / A murcha bacteriana do eucalipto é causada por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi, biovares 1 e 3. Entretanto, em 2009, foi descrita a biovar 2 em cultivo do campo de híbrido "urograndis" de eucalipto no município de Alexânia GO, Brasil. O controle dessa bacteriose é dificultado devido a natureza sistêmica da infecção e pela eficiente sobrevivência do patógeno. Além disso, pouco se conhece a cerca da ecologia, evolução, resistência genética e de fontes de controle da doença. Dessa forma, torna-se necessário um maior conhecimento do patógeno e a busca por formas de controle, tais como: o controle biológico e o emprego de fontes de resistência genética. Este trabalho teve como objetivos: 1) caracterizar isolados de R. solanacearum de eucalipto com o uso de testes bioquímicos, além da avaliação de diferentes plantas hospedeiras e identificação por PCR com oligonucleotídios iniciadores para espécie, biovar e filótipo; 2) realizar a prospecção de bactérias isoladas em condições extremas de temperatura, pH e salinidade, de cinco diferentes tipos de solo com potencial no controle in vitro e in vivo de R. R3bv2T solanacearum da, 3) avaliar a interação entre R. solanacearum da R3bv2T e cinco diferentes tipos de solo, no desenvolvimento de miniestacas do híbrido urograndis; 4) avaliar a suscetibilidade, in vitro através do teste de microbiolização de sementes, de dezessete espécies de Eucalyptus a duas estirpes de R. solanacearum (R3bv2T e R1bv1) e 5) avaliar bactérias extremófilas facultativas com potencial na promoção do crescimento do eucalipto. De acordo com os testes, os isolados são pertencentes à biovar 2T, filótipo II de R. solanacearum e foram capazes de induzir sintomas da doença e de serem recuperados de: eucalipto, batata, berinjela, tomate, datura, nabo, gerânio, girassol, beterraba, capuchinha, feijão, mostarda, cravo-de-defunto, moringa e caju. A partir dos solos coletados foram obtidos 61 isolados bacterianos nas diferentes condições extremas, sendo que 30 tiveram ação in vitro, contra a fitobactéria. As 10 estirpes selecionadas foram identificadas, com base no sequenciamento de parte do gene do 16S rDNA, como Bacillus sp. e Enterobacter sp. e dentre elas, a UnB 1370 (Enterobacter sp.) se destacou ao mostrar uma maior atividade contra a bactéria no solo, permitindo maior desenvolvimentos das plantas. No estudo da interação de R. solanacearum versus tipos de solos, de maneira geral, a presença da bactéria no solo prejudicou o desenvolvimento das plantas, com exceção do peso seco da raiz no cambissolo onde o tratamento com a bactéria mostrou média maior que a testemunha e diferença estatisticamente significativa. O organossolo se destacou no peso seco da parte aérea e raízes, diferindo-se estatisticamente dos demais tratamentos, ao garantir melhores condições para as plantas resistirem ao ataque da bactéria. Os latossolos, mais utilizados para plantio de eucalipto no Brasil, foram considerados, neste estudo, conducivos ao patógeno. Nas espécies de Eucalyptus analisadas, a suscetibilidade variou e foi maior devido a estirpe UnB 1359 (biovar 2T), quando comparada a UnB 575 (biovar 1), ambas de eucalipto. A primeira estirpe levou a morte de mais 50% das sementes em 13 das 17 espécies analisadas, enquanto a segunda estirpe somente em 8 espécies. O híbrido urograndis e as espécies E. deanei, E. pilularis e E. robusta foram consideradas tolerantes a ambas as estirpes. Ao contrário E. cloeziana, E. paniculata, E. exserta, E. acmenoides, E. botryoides, E. pellita, E. propinqua e E. resinifera exibiram baixa tolerância. Nos testes de promoção do crescimento, a avaliação do peso seco da parte aérea revelou que todas as estirpes bacterianas levaram a ganhos quando comparados à testemunha, variando entre 11,3 e 78,0%. Entretanto, as estirpes UnB 1366, UnB 1371, UnB 1375, UnB 1370 e UnB 1373, foram as que se diferiram significativamente da testemunha. Em contrapartida, a estirpe UnB 1368 (Bacillus sp.) se destacou individualmente no incremento (130,0%) da biomassa massa radicular. Pôde-se observar também, aparentemente, que algumas estirpes induziram uma germinação precoce das sementes, em destaque a UnB 1366 (Bacillus sp.). __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacterial wilt of eucalyptus is caused by Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi, biovars 1 and 3. However, in 2009, biovar 2 was described in a cultivated field of the hybrid "urograndis" of the eucalyptus in the municipality of Alexânia-Goiás state, Brazil. It is difficult to control this bacterial disease because of the infection's systemic nature and the pathogen's ability to survive. Moreover, little is known about the ecology, evolution, genetic resistance and sources of control of this disease. To this end, it is necessary to carry out a more thorough knowledge of the pathogen and to search for ways to control it, such as the use of biological control and use of sources of genetic resistance. This work had the following objectives: 1) to characterize isolates of R. solanacearum from eucalyptus with the use of biochemical tests, and to carry out evaluation of various host plants and identification by PCR primers for species, biovar and phylotype; 2) to prospect for bacteria isolated in extreme temperature, pH and salinity conditions, from five different types of soil with potential for use for in vitro and in vivo control of R. solanacearum; 3) to evaluate the interaction between R. solanacearum and five different types of soil, in the development of mini-cuttings of the hybrid urograndis; and 4) to evaluate the susceptibility, in vitro, of 17 species of Eucalyptus, by means of the seed microbiolization test to two strains of R. solanacearum and 5) evaluate a potential of extremophile bacteria in promoting eucalyptus growth. According to the tests, the isolates belong to biovar 2T, phylotype II of R. solanacearum, and were capable of inducing symptoms of the disease and being recovered from, the following plants: eucalyptus, potato, eggplant, tomato, datura, turnip, geranium, sunflower, beetroot, nasturtium, bean, mustard, tagetes minuta, moringa and cashew. From the collected soils 61 bacterial isolates were obtained under different extreme conditions, and among them 30 showed in vitro action against the plant bacterium. The 10 selected strains were identified, based on sequencing some of the 16S rDNA genes, as Bacillus sp. and Enterobacter sp. Among these, UnB 1370 (Enterobacter sp.) stood out by showing a higher activity against the bacteria in the soil, allowing for greater plants development. The organosol stood out in terms of dry weight of the aerial part and roots, differing statistically from the other treatments, in that it provided better conditions for the plants to resist bacterial attack. The latosols, most xxiii used for planting eucalyptus in Brazil, were considered in this study to be conducive to the pathogen. In the species of Eucalyptus analyzed, suscetibility varied and was greatest due to the UnB 1359 strain (biovar 2T), when compared to the UnB 575 (biovar 1), both from eucalyptus. The former presented more than 50% of dead seeds in 13 of the 17 species analyzed, while the latter did so in only 8 species. The hybrid E. deanei, E. pilularis and E. robusta were considered tolerant to both strains, while E. cloeziana, E. paniculata, E. exserta, E. acmenoides, E. botryoides, E. pellita, E. propinqua and E. resinifera exhibited low tolerance. In tests for growth promotion, the evaluation of the dry weight of the aerial part revealed that all the bacterial strains led to gains compared to the control, varying from 11.3 to 78.0%. However, strains UnB 1366, UnB 1371, UnB 1375, UnB 1370 and UnB 1373 were the ones that differed significantly compared to the control. In contrast, the UnB 1368 strain (Bacillus sp.) stood out in the increase (130,0%) it showed in root biomass. It could also be observed that some strains apparently induced early seed germination, especially UnB 1366 (Bacillus sp.). In the study on interaction of R. solanacearum with types of soil, the presence of the bacterium in the soil generally hampered plant development, apart from the root dry weight in cambisol, where the treatment with the bacterium showed a higher mean weight than the control and a statistically significant difference.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-06-11T15:08:55Z No. of bitstreams: 1 2015_JoaoGilbertoAlvesVillela.pdf: 1346201 bytes, checksum: 67224c4a62d1c57b75781b5b2d771431 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-06-11T15:11:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JoaoGilbertoAlvesVillela.pdf: 1346201 bytes, checksum: 67224c4a62d1c57b75781b5b2d771431 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-11T15:11:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JoaoGilbertoAlvesVillela.pdf: 1346201 bytes, checksum: 67224c4a62d1c57b75781b5b2d771431 (MD5) / A Murcha de Curtobacterium, causada pela bactéria Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), é um importante problema para o cultivo do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) no Brasil. A principal forma de disseminação da bactéria é por sementes contaminadas. No presente trabalho avaliou-se a eficiência de diferentes tratamentos de sementes no controle da Murcha de Curtobacterium em feijoeiro. Inicialmente se avaliou “in vitro” a sensibilidade de Cff a fungicidas e bactericidas cúpricos, casugamicina, cloretos de benzalcônio e ácido peracético. Os tratamentos de sementes realizados foram: imersão em solução de cobre, casugamicina, cloretos de benzalcônio e ácido peracético, exposição a vapor de etanol e metanol, e ozonização. Na avaliação da eficiência dos tratamentos na erradicação de Cff, sementes inoculadas foram tratadas e submetidas ao processo de extração, verificando posteriormente a incidência de sementes contaminadas e número de células bacterianas. Foram realizados experimentos em condições de campo e casa de vegetação. No ensaio em campo foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a qualidade fisiológica das sementes, e em casa de vegetação avaliou-se o efeito dos tratamentos na qualidade fisiológica das sementes, no desenvolvimento vegetativo da planta, na incidência e severidade da Murcha de Curtobacterium, produção de grãos, além da transmissão de Cff via planta – semente. Hidróxido de cobre (30 µg/mL), oxicloreto de cobre (50 µg/mL), óxido cuproso (20 µg/mL), sulfato de cobre (20 µg/mL), casugamicina (100 µg/mL), cloretos de benzalcônio (20 µg/mL) e ácido paracético (200 µg/mL) inibiram o crescimento da Cff “in vitro”. Os tratamentos com cloretos de benzalcônio e vapor de metanol foram os mais eficientes na redução da incidência de sementes contaminadas e do número de células bacterianas em sementes de feijão. Em campo os tratamentos com ácido peracético e ozônio reduziram significativamente a emergência e velocidade de emergência das plântulas. Os resultados obtidos em casa de vegetação mostraram que os tratamentos não interfiram na qualidade fisiológica das sementes, e plantas oriundas de sementes inoculadas tratadas ou não, apresentaram menor desenvolvimento vegetativo e produção de grãos. Nenhum tratamento de sementes foi eficiente na redução da incidência e severidade da Murcha de Curtobacterium. A taxa de transmissão de Cff das plantas para as sementes foi de aproximadamente 24%. / Bacterial Wilt, caused by Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, is an important disease for bean (Phaseolus vulgaris L.) production in Brazil. Seeds are the major way of spread this bacterium. The objective of this study was to evaluate the efficiency of different seed treatments to control bacterial wilt in bean. First an “in vitro” test was conductive to evaluate the sensitivity of Cff to copper formulations, kasugamycin, benzalkonium chlorides and peracetic acid. The seed treatments performed were: immersion in solution of copper, kasugamycin, benzalkonium chlorides and peracetic acid, exposure to vapor ethanol and methanol, and ozonation. In the evaluation of treatments efficiency in eradicating of Cff, inoculated seeds were treated and subjected to extraction process, then checking the incidence of contaminated seeds and number of bacterial cells. Experiments were carried in field conditions and greenhouse conditions. In field experiment was evaluated the effects of treatments on seed physiological quality, and greenhouse was measured the effect of treatments on seed physiological quality, in vegetative plant development, in incidence and severity of bacterial wilt, in production, beyond the transmission of Cff via plant - seed. The products copper hydroxide (30 µg/mL), copper oxychloride (50 µg/mL), cuprous oxide (20 µg/mL), copper sulfate (20 µg/mL), kasugamycin (100 µg/mL), chlorides benzalkonium (20 µg/mL) and peracetic acid (200 µg/mL) inhibited the growth of Cff “in vitro”. Treatments with benzalkonium chloride and vapor methanol were the most effective in reducing the incidence of contaminated seeds and the number of bacterial cells in bean seeds. Under field conditions the treatments with peracetic acid and ozone significantly reduced emergence and seedling emergence speed. The results obtained in the greenhouse showed that the treatments do not interfere in seed physiological quality, and plants grown from seeds inoculated, treated or not, showed lower vegetation development and grain production. The Cff transmission rate of the plants for seeds was approximately 24%.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulos 3. Material e Métodos, 4. Resultados, 5. Discussão e 6. Conclusão. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-08T16:29:19Z No. of bitstreams: 1 2017_WilliamRosadeOliveiraSoares -PARCIAL.pdf: 1538532 bytes, checksum: 354ee29a5621a5fd17f76e08f9d418a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-08T21:45:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_WilliamRosadeOliveiraSoares -PARCIAL.pdf: 1538532 bytes, checksum: 354ee29a5621a5fd17f76e08f9d418a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-08T21:45:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_WilliamRosadeOliveiraSoares -PARCIAL.pdf: 1538532 bytes, checksum: 354ee29a5621a5fd17f76e08f9d418a2 (MD5) Previous issue date: 2018-02-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). / Este trabalho visou caracterizar a diversidade de táxons do gênero Colletotrichum que estão associados às plantas de goiaba no Brasil, por meio de estudos moleculares, morfológicos, culturais e de patogenicidade. São relatadas a prevalência de cada espécie de Colletotrichum e sua respectiva distribuição geográfica. Esses tópicos não se encontram suficientemente compreendidos, mas são de grande interesse para a indústria da goiaba, pois a antracnose é geralmente considerada um dos fatores limitantes da produção de frutos de goiaba, causando elevadas perdas de produção. Apesar dos elevados danos econômicos ligados ao patossistema goiaba-antracnose, a etiologia da doença não é bem conhecida, embora essa informação seja muito importante para a recomendação de medidas de manejo eficientes. Portanto, o objetivo final é esclarecer a posição taxonômica dos isolados de Colletotrichum associados à antracnose da goiaba no Brasil em todas as regiões geográficas. O trabalho reuniu amostras de frutos (principalmente), folhas e flores de goiaba, e algumas outras Myrtaceae, de 13 unidades federativas do Brasil, cobrindo a maior parte do território nacional. Cento e setenta e um isolados (161 de goiaba) foram avaliados para patogenicidade e agressividade a frutos de duas variedades de goiaba (Cortibel SLG e Cortibel RM). Os isolados foram também estudados in vitro para características culturais e morfológicas, em diferentes temperaturas. Principalmente, toda coleção foi submetida a um estudo molecular detalhado, usando sequências parciais das regiões genômicas do rDNA-ITS, TUB2 e GAPDH. Os principais resultados estão listados a seguir: (a) Os isolados brasileiros de Colletotrichum em goiaba foram encontrados em quatro complexos e uma espécie conhecida, a saber, complexo C. gloeosporioides, complexo C. acutatum, complexo C. boninense, complexo C. gigasporum e na espécie C. cliviae; (b) O viii complexo mais prevalente na amostragem foi C. gloeosporioides (85,4%), seguido pelo complexo C. acutatum (9,4%); (c) um total de 16 espécies de Colletotrichum foram encontradas naturalmente associadas à antracnose da goiaba, uma das quais (dentro do complexo C. acutatum), possivelmente nova para a ciência: C. nymphaeaeae, C. melonis, C. paranaense, Colletotrichum sp., C. siamense, C. gloeosporioides, C. syzygiicola, C. asianum, C. fructicola, C. tropicale, C. theobromicola, C. musae, C. aeschynomenes, C. cliviae, C. gigasporum e C. karstii. Dessas, 12 espécies são aqui registradas pela primeira vez em P. guajava; (d) as espécies do complexo C. gloeosporioides incluíram as espécies mais agressivas à frutos de goiaba; (e) C. siamense foi a espécie mais prevalente, em todas as regiões geográficas, seguida por C. fructicola; (f) dentre todas as espécies, C. siamense, C. fructicola, C. syzygiicola e C. tropicale se destacaram como as mais agressivas, em ambas as variedades de goiaba; (g) frutos da variedade Cortibel SLG foram consistentemente mais resistentes à antracnose que frutos da variedade Cortibel RM. Adicionalmente, C. pseudoacutatum foi encontrada pela primeira vez causando antracnose em jambo-amarelo, Syzygium jambos. / This work aims to characterize the diversity of taxa in the genus Colletotrichum that are associated to the guava plant in Brazil, by molecular, morphological, cultural, and pathogenicity studies. The prevalence of each Colletotrichum species and respective geographic distribution are also described. These topics are yet poorly understood, and are of great interest to the domestic guava production, since anthracnose is generally considered one of the main disease limiting factors for guava production, causing important yield losses. In spite of the large economic losses linked to the guava anthracnose pathosystem, disease aetiology is insufficiently understood and this information is key to the recommendation of efficient management practices. Thus, the fundamental aim is to clarify the taxonomic positioning of the Colletotrichum isolates associated to guava anthracnose from all the Brazilian geographic regions. The work assembled fruit (mainly), leaf, and flower samples of guava, and some other Myrtaceae, from 13 states, covering most of the Brazilian territory. One hundred, seventy-one isolates of such samples (161 from guava) were evaluated as to their pathogenicity and aggressiveness to fruits of two guava varieties (Cortibel SLG and Cortibel RM). Isolates were also characterized in vitro as for cultural and morphological traits and growth in different temperatures. Especially, the collection was submitted to a detailed molecular study using partial sequences of the rDNA-ITS, TUB2 and GAPDH genomic regions. The main results are as follows: (a) Brazilian isolates of Colletotrichum were found to belong to four complexes and one known species, complex C. gloeosporioides, complex C. acutatum, complex C. boninense, complex C. gigasporum and the species C. cliviae; (b) Complex C. gloeosporioides was the most prevalent (85.4%), followed by the C. acutatum complex (9.4%); (c) a total of sixteen Colletotrichum species were found naturally associated to guava anthracnose, one of them x possibly a new species in the complex C. acutatum: C. nymphaeaeae, C. melonis, C. paranaense, Colletotrichum sp., C. siamense, C. gloeosporioides, C. syzygiicola, C. asianum, C. fructicola, C. tropicale, C. theobromicola, C. musae, C. aeschynomenes, C. cliviae, C. gigasporum, and C. karstii. Of these, 12 species are here reported to the first time in P. guajava; (d) species of the complex C. gloeosporioides included the most aggressive species; (e) C. siamense was found to be the most prevalent species in all Brazilian regions, followed by C. fructicola; (f) among all species, C. siamense, C. fructicola, C. syzygiicola and C. tropicale were the most aggressive to fruits of both guava varieties; (g) fruits of variety Cortibel SLG were found to be more consistently more resistant to anthracnose than fruits of variety Cortibel RM. Additionally, C. pseudoacutatum was found for the first time, causing anthracnose in Syzygium jambos.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-16T15:51:30Z No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Tomato spotted wilt virus (TSWV) bem como outras espécies de tospovírus (Família Bunyaviridae) é responsável por perdas substanciais na produção de vegetais ao redor do mundo. Tospovírus são transmitidos de maneira circulativa e propagativa por tripes (Ordem Thysanoptera). Como para outros patógenos, ações contra tospovírus exigem um olhar holístico, envolvendo uma combinação de táticas culturais, fitosanitárias, químicas e biológicas, quando apropriadas, além do uso de cultivares resistentes. Entretanto, o controle de doenças causadas por tospovírus tem se mostrado difícil, dado o grande espectro de hospedeiros desses vírus e a grande eficiência dos tripes vetores em transmiti-los. Além disso, a dependência e o aumento no uso de inseticidas de baixo custo tem exacerbado a presença de tospovírus pela forte pressão de seleção sobre os tripes vetores que se tornam resistentes a diferentes inseticidas. Para solucionar de forma simples todas as questões financeiras e ambientais associadas ao uso abusivo de inseticidas para o controle de tripes, esforços têm aumentado para a obtenção de cultivares geneticamente resistentes como um componente integral das estratégias de controle de doenças. Até o momento existem duas fontes de resistência disponíveis para o melhoramento genético de hortaliças à TSWV. Uma dessas fontes é o cluster genético Sw-5, o qual foi encontrado em Solanum peruvianum L., uma espécie de tomate selvagem do Peru, e tem sido introduzido em cultivares de S. lycopersicum L. (tomate comercial). Após mapeamento gênico, pelo menos cinco parálogos compõem o cluster genético Sw-5 em S. peruvianum, os quais foram nomeados de Sw-5a a Sw-5e. Esses parálogos codificam receptores do tipo NB-LRR, uma classe de proteínas citoplasmática que ativam resistência após reconhecimento direto ou indireto de patógenos que tenham ultrapassado as primeiras barreiras de defesa do sistema imune vegetal. Transformação de plantas de tabaco com os parálogos Sw-a e Sw-5b revelou que somente o último ativa resistência contra isolados de TSWV. Com a disponibilidade do genoma do tomate, genes ortólogos também foram mapeados em S. lycopersicum. Esta tese inicia-se com uma descrição detalhada do sistema imune vegetal e descobertas anteriores sobre o cluster genético Sw-5 (Capítulo 1). Como parte da introdução, os problemas causados por tospovírus e suas características são descritas. Tendo essas informações como ponto de partida, esta tese focou no entendimento de pontos-chaves da resistência mediada pela proteína Sw-5b contra tospovírus com uma atenção especial nos eventos moleculares e celulares envolvidos atrás desse mecanismo de resistência. Análises funcionais foram realizadas para esclarecer as delimitações genéticas entre os ortólogos funcionais e não funcionais do cluster Sw-5 no reconhecimento de tospovírus e ativação de resistência. Já que transformantes de N. tabacum com o gene Sw-5b feitos anteriormente não apresentaram resposta hipersensitiva (HR) após inoculação com TSWV, plantas de N. benthamiana foram transformadas com o gene Sw-5b buscando linhas transgênicas que poderiam responder com HR e assim facilitar a identificação do determinante de avirulência (Avr) de TSWV (Capítulo 2). Enquanto N. tabacum foi transformada com o gene Sw-5b sob controle de seus próprios elementos regulatórios, N. benthamiana foi transformada com o gene Sw-5b sob controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV). De forma interessante, as plantas transformadas de N. benthamiana apresentaram forte HR após inoculação de suas folhas com TSWV e outras quatro espécies de tospovírus: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Capítulos 2 e 7). Para identificação do Avr, os genes de TSWV foram clonados e expressos individualmente em folhas de N. benthamiana expressando Sw-5b e em isolinhas de tomate resistentes (contendo Sw-5) para monitoramento de HR. Como resultado, HR foi induzida após expressão da proteína não-estrutural NSM do isolado BR-01 de TSWV que induz resistência, mas não do isolado GRAU de TSWV que quebra resistência (Capítulo 2). Foco sobre a proteína NSM seguiu no capítulo 3. Versões truncadas dessa proteína foram transientemente co-expressas com Sw-5b em folhas de N. benthamiana (wild type). Tais versões truncadas excluíam domínios anteriormente associados com formação de túbulos, movimento viral célula-célula e sistêmico. Proteínas NSM truncadas faltando até 50 aminoácidos (aa) de ambos N e C terminais (NSM inteira contém 301 aa) ainda induziram HR, sugerindo que funções associadas ao movimento viral e comportamento como Avr são características independentes para NSM. No capítulo 4 experimentos foram realizados para caracterizar uma nova espécie de tospovírus observado em plantas de feijão que apresentavam sintomas de mosaico necrótico em São Paulo, Brasil (2006). Microscopia eletrônica de folhas sintomáticas revelou partículas pleiomórficas agrupadas em vesículas. Devido ao fato de feijão ser um hospedeiro não usual e pelo resultado negativo em testes de ELISA para outras espécies já conhecidas por circular no Brasil, testes biológicos, sorológicos e moleculares foram realizados para caracterização de uma provável nova espécie de tospovírus. Este vírus apresentou um estreito espectro de hospedeiros, infectando sistemicamente três de vintes espécies de plantas indicadoras e apresentou propriedades sorológicas únicas quando comparado com outras espécies de tospovírus encontradas no Brasil. O sequenciamento do genoma deste tospovírus revelou uma nova espécie que, junto com Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), representa uma nova linhagem evolutiva de tospovírus circulando no continente americano. Este tospovírus foi tentativamente chamado Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Já que a proteína Sw-5b reconhece pelo menos cinco espécies de tospovírus de origem “americana”, a proteína NSM do BeNMV também foi testada para monitoramento de HR através de sua co-expressão com Sw- 5b em folhas de N. benthamiana. O resultado, entretanto, mostrou que a proteína NSM do BeNMV não é um Avr cognato da proteína Sw-5b. No capítulo 5 é mostrado que a proteína Sw-5b induz HR dependentemente e independentemente da presença de NSM. A forma independente foi observada através da coexpressão da proteína Sw-5b com supressores de silenciamento gênico (p19 e NSS), os quais aumentaram a acumulação celular da proteína Sw-5b, induzindo auto-HR. Esta observação permitiu o screening de indução de HR e reconhecimento de NSM como eventos independentes para as outras proteínas Sw-5. Enquanto Sw-5a induziu auto-HR, ela não foi capaz de reconhecer NSM como Avr. De forma diferente, o ortólogo mais conservado das proteínas Sw- 5a e Sw-5b de S. lycopersicum susceptível a TSWV, nomeado Sw-5aS, não induziu qualquer tipo de HR. Através da co-expressão dos domínios individuais de Sw-5b, CC, NB-ARC, LRR ou de versões combinadas (CC-NB-ARC e NB-ARC-LRR) com NSM e com o supressor de silenciamento gênico p19, o papel desses domínios na indução de HR e no reconhecimento de NSM foram determinados. Enquanto NB-ARC foi suficiente para induzir auto-HR, NB-ARC-LRR induziu tanto auto quanto HR dependente de NSM, indicando que o domínio LRR especifica o reconhecimento do Avr. Já o domínio CC suprimiu HR induzida por NB-ARC em cis e trans, apontando para uma função regulatória de CC. A superexpressão do domínio NB-ARC de Sw- 5aS não resultou em HR, similar ao resultado da proteína Sw-5aS completa. Após alinhamento dos domínios NB-ARC, três variações de aminoácidos (aa) foram encontradas entre as proteínas Sw-5a, Sw-5b e Sw-5aS, os quais foram revertidos no último. Quando a glutamina da posição 599 foi convertida em uma arginina (Q599R), igual a proteína Sw-5b nesta posição, o domínio NB-ARC da proteína Sw-5aS tornou-se funcional para indução de HR. Modelagem deste domínio revelou que esta mutação encontra-se fora do domínio de ligação de ADP/ATP, o qual é importante para o switching entre os estados on e off dos domínios NB-ARC. Finalmente, a fusão do domínio LRR da proteína Sw-5b na variante Q599R do domínio NBARC de Sw-5aS resultou em auto-HR e HR dependente de NSM. Os construtos codificando os domínios da proteína Sw-5b também foram usados para estudos subcelulares no capítulo 6. Para este propósito, todas as proteínas estavam fusionadas a Green Fluorescence Protein (GFP) na porção N-terminal para tornar possível a visualização por microscopia confocal em tecido folhear. Enquanto a proteína Sw-5b inteira, os domínios CC, NB-ARC e LRR e o combinado CC-NB-ARC apresentaram distribuição nucleocitoplasmática, NB-ARC-LRR localizou-se somente no citoplasma, sugerindo que CC sinaliza o importe nuclear. Os domínios NB-ARC e LRR também foram investigados para uma possível interação direta com NSM através da técnica Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Enquanto interação direta não foi observada entre LRR e NSM, o domínio NB-ARC aparentou interagir com NSM. As especificidades para o reconhecimento de NSM como Avr são discutidas no capítulo 7, levando em consideração aspectos evolutivos de tomates e tospovírus. Um modelo da ativação da proteína Sw-5b é postulado no texto tendo como base a dissecção desta proteína e os ensaios de localização subcelular, além de sua putativa interação direta com NSM. / Tomato spotted wilt virus (TSWV) along with other tospovirus species (family Bunyaviridae) is responsible for substantial losses in crop production around the world. Tospoviruses are transmitted in a propagative and circulative manner by thrips vectors (Order Thysanoptera). As for other pathogens, disease management against tospoviruses pursues a holistic approach involving a combination of cultural, phytosanitary, chemical, and biological tactics, when suitable in addition to the use of resistant crops. Nevertheless, successful control has proven difficult given the broad host range of these viruses and their effective spread by thrips vectors. More importantly, increased reliance on the use of low-cost insecticides has exacerbated tospovirus spread by causing thrips resistance. To ease the financial and environmental constraints associated with insecticide abuse to control thrips, efforts have been increased to obtain genetically resistant cultivars as an integral component of disease management strategies. So far there are two resistance sources available for commercial breeding of vegetables against TSWV. One of these sources is the Sw-5 gene cluster, which has been found in Solanum peruvianum L., a wild species of tomato from Peru, and has been introgressed in S. lycopersicum L. cultivars (commercial tomatoes). After gene mapping, it has been reported that at least five paralogs compose the Sw-5 gene cluster in S. peruvianum, which were named Sw- 5a to Sw-5e. These paralogs encode NB-LRR receptors, a class of cytoplasmic proteins that activate disease resistance upon direct or indirect recognition of pathogens that have overcome the first lines of defense of the plant immune system. Transformation of tobacco plants with the paralogs Sw-5a and Sw-5b, revealed that only the latter triggers resistance against TSWV isolates. With the availability of the tomato genome, highly conserved orthologs have been mapped in S. lycopersicum as well. This thesis started off with a detailed description of the plant immune system and previous findings about the Sw-5 gene cluster (Chapter 1). As part of this introduction, the problems caused by tospoviruses, to which Sw-5b locus confers resistance and the characteristics of these viruses have been described. With this knowledge as a starting point, this thesis focused on unraveling the key features of Sw-5b-mediated resistance against TSWV with special attention to the molecular and cellular events underlying the resistance mechanism. Functional analyses have been performed towards clarification of the genetic delimitations between functional and non-functional Sw-5 orthologs considering tospovirus recognition and resistance triggering. Since earlier made N. tabacum transformants containing Sw-5b did not show a hypersensitive response (HR) upon challenging with TSWV, N. benthamiana have been transformed with Sw-5b aiming to obtain transgenic lines that would respond with a visual HR and thereby facilitate the identification of the avirulence determinant (Avr) from TSWV (Chapter 2). While N. tabacum plants were transformed with Sw-5b gene under control of its own regulatory elements, the N. benthamiana plants were transformed with the Sw-5b gene under control of the Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Interestingly, the Sw-5btransformed N. benthamiana plants presented a strong HR upon challenging with TSWV and four other tospoviruses: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Chapter 2 and 7). To identify the Avr, TSWV genes were cloned and expressed individually in leaves of Sw-5b-transformed N. benthamiana plants and Sw-5-resistant tomato isolines for HR monitoring. As a result, HR was triggered upon expression of the non-structural protein NSM from the resistance-inducing TSWV isolate BR-01, but not from the resistance-breaking TSWV isolate GRAU (Chapter 2). The research on NSM was continued in Chapter 3, in which truncated versions of this protein were transiently co-expressed with Sw-5b in wild type N. benthamiana leaves. These truncations lacked domains previously associated with tubule formation, cell-tocell and systemic viral movement. Truncated NSM proteins lacking up to 50 amino acids (aa) from either the N- or C-terminus (full NSM is 301 aa in size) still triggered Sw-5b-mediated HR, suggesting that viral movement functions of NSM and its fate as Avr are independent from each other. Chapter 4 described experiments to characterize a new tospovirus collected from bean plants showing necrotic mosaic symptoms during a field survey in São Paulo, Brazil (2006). Electron microscopy of symptomatic leaves revealed pleomorphic particles packed in vesicles. Due to its unusual natural host for a “Brazilian” tospovirus and being negative in ELISA for tospovirus species known to be circulating in Brazil, biological, serological, and molecular tests were performed to further characterize this putatively new tospovirus species. The virus appeared to have a narrow host-range, systemically infecting only three out of twenty test-plants of various species and presented unique serological properties when compared to other known tospovirus species. The genome sequencing of this tospovirus revealed a completely new species, which, together with Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), represents a second evolutionary lineage of tospoviruses circulating in the American continent. This new tospovirus was tentatively named Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Since the Sw-5b protein recognizes at least five tospovirus species of “American” origin, the NSM protein of BeNMV was also tested for HR-triggering through co-expression with Sw-5b in N. benthamiana leaves. The outcome, however, indicated that the NSM protein of BeNMV is not a cognate Avr of the Sw-5b protein. In Chapter 5 it is shown that the Sw-5b protein triggers both NSM-dependent and - independent HR. The latter was achieved by co-expression of Sw-5b with RNA silencing suppressors (p19 and NSS), which increased the Sw-5b cellular accumulation and lead to auto- HR. This observation allowed the screening of HR-triggering and NSM-recognition as uncoupled events for other Sw-5 proteins as well. While Sw-5a could trigger auto-HR, it lacked the ability to recognize NSM as Avr. On the other hand, the highest conserved ortholog of Sw-5a and Sw-5b from susceptible S. lycopersicum, named here as Sw-5aS, lacked both auto-HR and NSMdependent HR. By co-expression of the individual Sw-5b domains CC, NB-ARC, LRR or combined versions (CC-NB-ARC and NB-ARC-LRR) with NSM and the silencing suppressor p19, the role of these domains in HR-triggering and NSM-recognition was determined. While NBARC was sufficient for auto-HR, NB-ARC-LRR triggered both auto- and NSM-dependent HR, indicating that LRR specifies the Avr recognition. The CC domain suppressed HR triggered by NB-ARC in cis and trans, pointing towards a regulatory function for CC. The overexpression of the NB-ARC domain from Sw-5aS did not result in HR, similar to the outcome with the full-length Sw-5aS protein. After alignment of the NB-ARC domain, three mismatches were found between Sw-5a, Sw-5b, and Sw-5aS which were reverted in the latter. When the glutamine at position 599 was converted into an arginine (Q599R), to mimic the situation in the Sw-5b protein at this position, the Sw-5aS NB-ARC domain became functional for auto-HR triggering. Modeling of this domain revealed that this mutation was outside of the ADP/ATP binding site, which is important for the switching between “on” and “off” states of NB-ARC domains. Finally, the fusion of the LRR domain of Sw-5b to the Q599R variant of the Sw-5aS NB-ARC domain resulted in both auto- and NSM-dependent HR. The constructs encoding the various Sw-5b domains were used for subcellular studies in Chapter 6. To this end, all constructs encoded proteins were fused with Green Fluorescence Protein (GFP) at their N-terminus, to enable easy visualization by confocal microscopy in leaf tissue. Whereas the full-length Sw-5b protein, the individual domains CC, NB-ARC, and LRR and the combined CC-NB-ARC version showed a nucleocytoplasmic distribution, NB-ARC-LRR localized only in the cytoplasm, suggesting that CC signalizes nuclear import. The subdomains NB-ARC and LRR were also investigated for a possible direct interaction with NSM using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). While for LRR interaction with NSM was not observed, the NB-ARC domain seemed to directly bind to NSM. The specificities for NSM recognition have been discussed in Chapter 7 taking into consideration evolutionary aspects of tomatoes and tospoviruses. A model for Sw-5b activation is postulated throughout the text based on the dissection of this protein in HR-triggering and subcellular localization assays and on its putative direct interaction with NSM.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2015-11-19T15:35:07Z No. of bitstreams: 1 2015_LucianaRamalhodeFarias.pdf: 4779015 bytes, checksum: 7b81169103e721898ed9a99c2bf0ed62 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T12:57:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LucianaRamalhodeFarias.pdf: 4779015 bytes, checksum: 7b81169103e721898ed9a99c2bf0ed62 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T12:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LucianaRamalhodeFarias.pdf: 4779015 bytes, checksum: 7b81169103e721898ed9a99c2bf0ed62 (MD5) / Os percevejos representam uma ameaça à soja, principal cultura agrícola do país. A investigação de proteínas relacionadas à olfação representa uma abordagen atual que visa o desenvolvimento de novas ferramentas a partir da compreensão do sistema olfativo de insetos e sua relação com o comportamento desses indivíduos no campo. O trabalho teve como objetivo identificar transcritos relacionados à olfação em três espécies de percevejos pragas da soja - Euschistus heros (Fabricius, 1798), Chinavia ubica (Rolston, 1983) e Dichelops melacanthus (Dallas, 1851), analisar a afinidade das proteínas que se ligam a odorantes (OBPs – Odorant Binding Proteins) a sete moléculas odorantes testadas in vivo como mistura complexa de odores e analisar a ultraestrutura das sensilas das antenas do percevejo marrom E. heros. Os transcritos foram obtidos a partir de sequenciamento de alto desempenho de amostras de RNA extraídas das antenas dos insetos não acasalados. Os dados obtidos no sequenciamento permitiram a montagem de sequências que posteriormente, foram triadas para obtenção das sequências de interesse. As relações filogenéticas entre as OBPs com sequência completa foram estabelecidas utilizando o programa FastTree. A modelagem estrutural dessas proteínas foi realizada pelo programa MODELLER 9.10. O docking molecular realizado para verificar a afinidade das OBPs com os ligantes foi realizado pelo programa AutoDock Vina. A ultraestrutura das sensilas de E. heros foi estudada utilizando técnicas de microscopia eletrônica de transmissão. Foram identificadas nove OBPs com sequências completas, sendo quatro pertencentes às espécies E.heros e C.ubica e uma ao D. melacanthus. As relações filogenéticas observadas indicaram uma divergência intraespecífica e duas relações de proximidade interespecífica. Os modelos obtidos a partir de modelagem estrutural foram consistentes com aqueles resolvidos por cristalografia de raio-X e resonância nuclear magnética. Esse estudo revelou uma maior afinidade das OBPs para odorantes relacionados aos feromônios sexuais, exceto a OBP de D. melacanthus, que não apresentou afinidade significativa com nenhum ligante. Em relação à ultraestrutura sensilar, os resultados demonstram uma organização semelhante à outra espécie de hemíptera e diferente da organização em lepidópteros. Este trabalho possibilitou o aprofundamento dos conhecimentos relacionados aos processos olfatórios nas espécies analisadas, bem como o levantamento de estratégias que poderão levar ao desenvolvimento de biossensores que poderão ser aplicados no campo como alternativa às estratégias de controle tradicionalmente utilizadas e, muitas vezes, ineficientes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Stink-bugs (Pentatomidae) include a complex of species major pests of soybean in Brazil. Development of new tools to manage this pest complex is an important goal. The investigation of proteins related to olfaction presents potential to be used in monitoring and/or developing sustainable managing tools to be implemented in holistic integrated pest management (IPM) programs. This study aimed to identify transcripts related to olfaction in three species of stink bug pests of soybean - Euschistus heros, Chinavia ubica and Dichelops melacanthus -, and to analyze the affinity of odorant binding proteins (OBPs - Odorant Binding Proteins) to seven odorant molecules tested in live as complex mixture of odors and to analyze the ultrastructure of sensilas of the most commun species, E. heros. The transcripts were obtained through next generation sequencing from RNA samples extracted from the antennas unmated insects. The sequencing data obtained enabled the assembly sequences that were screened for obtaining the sequences of interest. The phylogenetic relationships between full-length OBPs were established using the FastTree program. Structural modeling of these proteins was carried out by MODELLER 9.10 software. The molecular docking conducted to determine the affinity of ligands with OBPs was performed by Vina AutoDock program. The sensilla ultrastructure of E. heros was studied using electron transmission microscop. Nine full-length OBPs were identified four belonging to the species E.heros and C. ubica each and one from D. melacanthus. The phylogenetic relationships observed indicated an intraspecific divergence and two relations of interspecific proximity. The models obtained from structural modeling were consistent with those solved by X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. This study revealed a greater affinity for the OBPs odorants related to sex pheromones, except OBP D. melacanthus, which showed no significant affinity with any odorant molecule. Regarding to sensilar ultrastructure, the results demonstrate an organization similar to other species of Hemiptera and different organization from Lepidoptera. This work enabled the development of knowledge related to olfactory processes in the analyzed species and raising strategies that may lead to the development of biosensors that can be applied in the field as an alternative to control strategies traditionally used and often inefficient.