Das Glioblastom ist der häufigste primäre maligne Hirntomor. Es zeichnet sich durch ein besonders aggessives und invasives Wachstumsverhalten aus. So konnte bis heute trotz moderner Diagnostik und Entwicklung neuer Behandlungsstrategien bestehend aus Operation, Radiatio und Chemotherapie mit Temozolamid die mittlere Überlebenszeit von 14.6 Monaten nicht überschritten werden. Matrixmetalloproteinasen sind zinkabhängige Endopeptidasen, die in der Lage sind die Extrazellulärmatrix zu degradieren, die Basalmembran zu durchbrechen, und somit Migration, Invasion, und Neovaskularisierung von Tumoren zu erleichtern. In zahlreichen Tumoren, so auch im Glioblastom, konnte eine Überexpression von MMPs, besonders von MMP2 und MMP9, nachgewiesen werden. Verschiedene Substanzen sind in der Lage, auf unterschiedlichen Ebenen die MMP-Synthese zu hemmen. Vor allem Doxycyclin, ein Antibiotikum aus der Gruppe der Tetracycline, sowie COL-3, ein chemisch modifiziertes Tetracyclinderivat, wurden an vielen Tumorentitäten in präklinischen und klinischen Studien erfolgreich eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 2 Antibiotika, Doxycyclin und Cefotaxim, auf ihre Wirkung auf 4 Gliomzelllinien, C6, U251, U373 und GaMG, sowie 4 Primärzellen, 2406, 2418, 2421 und 2464, untersucht. Sowohl Doxycyclin, als auch Cefotaxim hemmen teilweise die Expression von MMP2 und MMP9, was durch eine semiquantitative PCR nachgewiesen wurde; die Expression von TIMP1 bleibt weitgehend unverändert. Auch auf Proteinebene konnte mittels Immunhistochemie ein Rückgang von MMP2 und MMP9 bei den meisten Zelllinien und Primärzellen unter Behandlung mit den Antibiotika beobachtet werden. Außerdem konnten Veränderungen im Wachstunsverhalten der Zellen in der Zellkultur verzeichnet werden, wahrscheinlich durch Inhibition der MMPs bedingt. Bei allen Zelllinien und allen Primärzellen wurde eine Abnahme der Proliferation im MTT-Assay, eine Zunahme der Adhäsion im Amidoblackassay, eine Abnahme der Migration im Migrationsassay, und eine Abnahme der Invasion im 3-D-Kollagengel-Assay beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigten die Resultate anderer Arbeitsgruppen mit Doxycyclin an anderen Tumoren, wie dem Prostata-Ca. Der deutliche Einfluss des Doxycyclins auf grundlegende Zelleigenschaften, wie z.B. dem Migrations-, Proliferations- und Invasionsverhalten, erfordert einen kritischen Umgang mit dem Tet-On/Off Systems zur Genregulation, insbesondere dann, wenn funktionelle Untersuchungen Teil der Versuchszielsetzung sind. / The glioblastoma multiforme ist the most common primary malignant brain tumor. It is characterized by a very aggressive and invasive growth. Despite modern diagnostic modalities and the development of new treatment strategies including operation, radiation and chemotherapy with temozolamide, the median survival did not exceed 14,6 months. Matrixmetalloproteinases are zinc-dependent endopeptidases capable of degrading the extracellular matrix, penetrating the basement membrane, and so facilitating migration, invasion and neovascularisation of tumors. In numerous tumors, as well as in glioblastomas, an overexpression of MMPs, especially of MMP2 and MMP9, was demonstrated. Different detergents are able to inhibit the synthesis of MMPs. Doxycycline, a tetracyclic anticiotic, and COL-3, a non-antimicrobial, chemically modified tetracycline, were successfully examined in many tumor entities in preclinical and clinical studies. In this study we investigated the effect of two antibiotics, doxycycline and cefotaxime, on four glioblastoma celllines (C6, U251, U373, GaMG) and four primary cultures (2406, 2418, 2421, 2464). Both, doxycycline and cefotaxime, partially blocked the expression of MMP2 and MMP9, shown by semiquantitative PCR, expression of TIMP1 was unchanged. In immunhistochemistry lower expression levels of MMP2- and MMP9-protein were displayed by treated cells. Furthermore changes in cell growth characteristics in cell culture were detected, probably caused by inhibition of MMPs. In all cell lines and primary cultures the proliferative activity of treated cells was decreased, shown in MTT-Assay. Adhesion of treated cells was increased, and 3-D-invasion and migration were reduced. The results of this study support similar data in other tumor entities and warrant further investigation of the clinical potential of CMT in patients with gliomatous disease. The remarkable influence of doxycycline on cell characteristics, like migration, proliferation and invasion, requires a critical handling with the tet-on/off-system for gene regulation, especially when functional investigation is part of the trial.

Frankfurt (Main), Universität, Thesis (doctoral), 2001.

In den letzten Jahren zeichnet sich bei der Behandlung der Ornithose der sportlich genutzten Brieftaube die Entwicklung ab, anstelle der traditionellen intramuskulären Applikation von Doxycyclin eine orale Applikation über das Trinkwasser vorzuziehen, wofür bisher eindeutig experimentell belegte Dosierungsschemata fehlen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein oral zu verabreichendes Doxycyclin-Präparat auf seine Pharmakokinetik und Verträglichkeit bei Brieftauben zu untersuchen und ein geeignetes Dosierungsregime für die Trinkwasserapplikation zur Behandlung der Ornithose zu etablieren. Die anzuwendende orale Therapiedosis wurde in verschiedenen Schritten ermittelt. Zuerst wurde die Plasmakinetik von Doxycyclin nach einmaliger intraingluvialer Applikation von 60 mg Doxycyclin/kg KM bei einer Gruppe von 15 Brieftauben gemessen, um die gastrointestinale Resorption zu bewerten und pharmakokinetische Daten zu berechnen. Im zweiten Teil der Untersuchungen sollte an einer Gruppe von 36 Brieftauben überprüft werden, ob mit einer oralen Dosis von 30 mg Doxycyclin-Hyclat/ kg KM pro Tag, verteilt auf zwei Dosen zu 15 mg/kg KM, über einen Zeitraum von 14 Tagen Plasmaspiegel oberhalb 1,0 µg/ml bei geringen Fluktuationen erreicht werden können. Außerdem wurden in diesem Versuch Gewebespiegel von Doxycyclin in den Zielorganen von Chlamydophila psittaci (Lunge und Leber) von 12 Tauben jeweils 2 und 5 Stunden nach der letzten Doxycyclin-Applikation gemessen. In weiteren Untersuchungen sollten die Akzeptanz von Doxycyclin-supplementiertem Trinkwasser durch die Brieftauben sowie die daraus resultierenden Doxycyclin-Plasmaspiegel getestet werden. Dazu wurden in einem orientierendem Versuch 4 Tieren über 3 Tage Doxycyclin-supplementiertes Trinkwasser in der Konzentration von 800 mg/l Doxycyclin, anschließend in einem Hauptversuch 18 Brieftauben über 10 Tage supplementiertes Trinkwasser in der Konzentration von 750 mg/l angeboten, dem jeweils 1,0 g Zitronensäure/l beigemischt war. Die Verträglichkeit von Doxycyclin bei Brieftauben wurde im letzten Teil der Studie überprüft. Jeweils 12 Brieftauben wurden 5 Versuchsgruppen zugeteilt. Über einen Zeitraum von 20 Tagen wurden jeder Taube täglich Doxycyclin-Lösungen in folgenden Dosierungen oral appliziert: 0 mg/kg (Placebogruppe), bzw. 30 mg/kg, bzw. 45 mg/kg, bzw. 60 mg/kg, bzw. 150 mg/kg KM; die Dosis wurde auf zwei gleiche Mengen pro Tag verteilt. Mittels klinischer, blutchemischer, hämatologischer und pathologischer Untersuchungen wurde der Gesundheitsstatus der Tiere überwacht. Es zeigte sich, dass Doxycyclin nach oraler Gabe von 60 mg/kg KM an Brieftauben gut aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert wurde. Eine maximale Plasmakonzentration von 8,1 µg/ml wurde 6 h post applicationem erreicht und es wurde eine Plasmahalbwertszeit von 11,3 h ermittelt. DiePlasmaspiegel erwiesen sich in Anbetracht des angestrebten Wertes von 1,0 µg Doxycyclin/ ml Plasma zur Ornithosetherapie als ausreichend hoch. Bei Gabe von 30 mg Doxycyclin/kg KM pro Tag, verteilt auf 2 gleiche Einzeldosen, über einen Zeitraum von 14 Tagen, wurden maximale Plasmakonzentrationen von durchschnittlich 2,4 µg/ml, minimale Plasmakonzentrationen von im Mittel 1,8 µg/ml gemessen. Die Versuchsergebnisse bestätigen, dass die verabreichte Dosis ausreichend ist, um mittels oraler Applikation einen Plasmaspiegel von > 1,0 µg/ml, entsprechend den Anforderungen der PSITTAKOSE-VERORDNUNG (2005), zu gewährleisten. Noch ausgeprägter als im Plasma, reicherte sich das stark lipophile Doxycyclin in den Zielgeweben Lunge und Leber zum zwei-(Lunge) bis 7-fachen (Leber) gegenüber dem Blutplasma an. Im dritten Teil der Untersuchungen wurde mit einer täglichen durchschnittlichen Aufnahme von 37 ml/kg KM Doxycyclin-medikierten Trinkwassers (Konzentration von 750 mg Doxycyclin/ l) eine gute Akzeptanz des Präparates beobachtet. Während die Mittelwerte der Doxycyclin-Plasmaspiegel sich immer oberhalb der angestrebten 1,0 µg/ml befanden, verfehlten einzelne Tiere, jedoch nur in der ersten Hälfte des Applikationszeitraumes, an einzelnen Messzeitpunkten knapp diese Grenze. Die Supplementierung des Trinkwassers mit Zitronensäure erwies sich als notwendig, um die Ausfällung von Doxycyclin durch mehrwertige Kationen im Leitungswasser zu verhindern. Eine ausgezeichnete Verträglichkeit von Doxycylin bei der Zieltierart Brieftaube und oraler Applikation konnte bei 20-tägiger Applikation bis zur 2-fachen Überdosierung (60 mg/kg KM pro Tag) bestätigt werden. Eine höhere Überdosierung ist zu vermeiden, da in der Fünffachdosisgruppe (150 mg/kg KM pro Tag) Nebenwirkungen in Form von Regurgitieren und Leberbelastungen mit Polydipsie, Polyurie, Körpermasseverlust und einem Anstieg der Leberenzyme auftraten. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass anhand der vorliegenden Untersuchungsergebnisse bei Brieftauben eine tägliche orale Dosis von 30 mg/kg KM Doxycyclin über das Trinkwasser zu wirksamen Blutplasma- und Gewebespiegeln führt, bei guter Verträglichkeit, und somit zur Ornithosetherapie empfohlen werden kann. Eine mehr als 2-fache, akzidentelle Überdosierung des Präparates ist zu vermeiden.

In den letzten Jahren zeichnet sich bei der Behandlung der Ornithose der sportlich genutzten Brieftaube die Entwicklung ab, anstelle der traditionellen intramuskulären Applikation von Doxycyclin eine orale Applikation über das Trinkwasser vorzuziehen, wofür bisher eindeutig experimentell belegte Dosierungsschemata fehlen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein oral zu verabreichendes Doxycyclin-Präparat auf seine Pharmakokinetik und Verträglichkeit bei Brieftauben zu untersuchen und ein geeignetes Dosierungsregime für die Trinkwasserapplikation zur Behandlung der Ornithose zu etablieren. Die anzuwendende orale Therapiedosis wurde in verschiedenen Schritten ermittelt. Zuerst wurde die Plasmakinetik von Doxycyclin nach einmaliger intraingluvialer Applikation von 60 mg Doxycyclin/kg KM bei einer Gruppe von 15 Brieftauben gemessen, um die gastrointestinale Resorption zu bewerten und pharmakokinetische Daten zu berechnen. Im zweiten Teil der Untersuchungen sollte an einer Gruppe von 36 Brieftauben überprüft werden, ob mit einer oralen Dosis von 30 mg Doxycyclin-Hyclat/ kg KM pro Tag, verteilt auf zwei Dosen zu 15 mg/kg KM, über einen Zeitraum von 14 Tagen Plasmaspiegel oberhalb 1,0 µg/ml bei geringen Fluktuationen erreicht werden können. Außerdem wurden in diesem Versuch Gewebespiegel von Doxycyclin in den Zielorganen von Chlamydophila psittaci (Lunge und Leber) von 12 Tauben jeweils 2 und 5 Stunden nach der letzten Doxycyclin-Applikation gemessen. In weiteren Untersuchungen sollten die Akzeptanz von Doxycyclin-supplementiertem Trinkwasser durch die Brieftauben sowie die daraus resultierenden Doxycyclin-Plasmaspiegel getestet werden. Dazu wurden in einem orientierendem Versuch 4 Tieren über 3 Tage Doxycyclin-supplementiertes Trinkwasser in der Konzentration von 800 mg/l Doxycyclin, anschließend in einem Hauptversuch 18 Brieftauben über 10 Tage supplementiertes Trinkwasser in der Konzentration von 750 mg/l angeboten, dem jeweils 1,0 g Zitronensäure/l beigemischt war. Die Verträglichkeit von Doxycyclin bei Brieftauben wurde im letzten Teil der Studie überprüft. Jeweils 12 Brieftauben wurden 5 Versuchsgruppen zugeteilt. Über einen Zeitraum von 20 Tagen wurden jeder Taube täglich Doxycyclin-Lösungen in folgenden Dosierungen oral appliziert: 0 mg/kg (Placebogruppe), bzw. 30 mg/kg, bzw. 45 mg/kg, bzw. 60 mg/kg, bzw. 150 mg/kg KM; die Dosis wurde auf zwei gleiche Mengen pro Tag verteilt. Mittels klinischer, blutchemischer, hämatologischer und pathologischer Untersuchungen wurde der Gesundheitsstatus der Tiere überwacht. Es zeigte sich, dass Doxycyclin nach oraler Gabe von 60 mg/kg KM an Brieftauben gut aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert wurde. Eine maximale Plasmakonzentration von 8,1 µg/ml wurde 6 h post applicationem erreicht und es wurde eine Plasmahalbwertszeit von 11,3 h ermittelt. DiePlasmaspiegel erwiesen sich in Anbetracht des angestrebten Wertes von 1,0 µg Doxycyclin/ ml Plasma zur Ornithosetherapie als ausreichend hoch. Bei Gabe von 30 mg Doxycyclin/kg KM pro Tag, verteilt auf 2 gleiche Einzeldosen, über einen Zeitraum von 14 Tagen, wurden maximale Plasmakonzentrationen von durchschnittlich 2,4 µg/ml, minimale Plasmakonzentrationen von im Mittel 1,8 µg/ml gemessen. Die Versuchsergebnisse bestätigen, dass die verabreichte Dosis ausreichend ist, um mittels oraler Applikation einen Plasmaspiegel von > 1,0 µg/ml, entsprechend den Anforderungen der PSITTAKOSE-VERORDNUNG (2005), zu gewährleisten. Noch ausgeprägter als im Plasma, reicherte sich das stark lipophile Doxycyclin in den Zielgeweben Lunge und Leber zum zwei-(Lunge) bis 7-fachen (Leber) gegenüber dem Blutplasma an. Im dritten Teil der Untersuchungen wurde mit einer täglichen durchschnittlichen Aufnahme von 37 ml/kg KM Doxycyclin-medikierten Trinkwassers (Konzentration von 750 mg Doxycyclin/ l) eine gute Akzeptanz des Präparates beobachtet. Während die Mittelwerte der Doxycyclin-Plasmaspiegel sich immer oberhalb der angestrebten 1,0 µg/ml befanden, verfehlten einzelne Tiere, jedoch nur in der ersten Hälfte des Applikationszeitraumes, an einzelnen Messzeitpunkten knapp diese Grenze. Die Supplementierung des Trinkwassers mit Zitronensäure erwies sich als notwendig, um die Ausfällung von Doxycyclin durch mehrwertige Kationen im Leitungswasser zu verhindern. Eine ausgezeichnete Verträglichkeit von Doxycylin bei der Zieltierart Brieftaube und oraler Applikation konnte bei 20-tägiger Applikation bis zur 2-fachen Überdosierung (60 mg/kg KM pro Tag) bestätigt werden. Eine höhere Überdosierung ist zu vermeiden, da in der Fünffachdosisgruppe (150 mg/kg KM pro Tag) Nebenwirkungen in Form von Regurgitieren und Leberbelastungen mit Polydipsie, Polyurie, Körpermasseverlust und einem Anstieg der Leberenzyme auftraten. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass anhand der vorliegenden Untersuchungsergebnisse bei Brieftauben eine tägliche orale Dosis von 30 mg/kg KM Doxycyclin über das Trinkwasser zu wirksamen Blutplasma- und Gewebespiegeln führt, bei guter Verträglichkeit, und somit zur Ornithosetherapie empfohlen werden kann. Eine mehr als 2-fache, akzidentelle Überdosierung des Präparates ist zu vermeiden.

No description available.

Einleitung: Equines Asthma ist eine herausfordernde Erkrankung der Pferde. Gekennzeichnet ist sie durch verengte Atemwege mit massiver Schleimansammlung mit einhergehender Leistungsinsuffizienz des Pferdes. Eines der Therapieziele ist der β2-Adrenozeptor (β2AR) in den Atemwegen, der nach Aktivierung durch β-selektive Pharmaka zur Bronchienerweiterung und verbesserten Ventilation der Lunge führt. Eine Langzeitapplikation dieser Therapeutika führt jedoch zur Downregulation der Rezeptoranzahl mit korrespondierender Abschwächung des Therapieerfolges, wobei es Unterschiede im Ausmaß dieses Effektes zwischen den Pharmaka zu geben scheint. Der genaue Mechanismus dahinter ist nicht geklärt. Ziel der Untersuchung: Die vorliegende Arbeit entwickelt zwei neue In-vitro-Zellsysteme, in denen der equine β2AR stabil transfiziert wird und dessen Genexpression (ADRB2) durch Doxycyclin steuerbar ist. Nach Etablierung der reproduzierbaren Anwendbarkeit wird eines der Systeme unter Zugabe von β-selektiven Agonisten genutzt, um den Einfluss der Pharmaka auf die Rezeptor-Signalkaskade und Downregulation zeit- und dosisabhängig zu bestimmen. Material und Methoden: ADRB2 wurde in den Vektor pSBtet_GP kloniert und HEK293T- und COS-7-Zellen mit dem Konstrukt stabil transfiziert. Zur Bestimmung der Parameter für eine adäquate Genexpression wurden die Zellen mit verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen und Inkubationszeiten induziert und die Rezeptor-mRNA-Bildung, -anzahl und -funktion mittels qPCR, Iodocyanopindolol (ICYP)-Bindungsstudien und AlphaScreen cAMP-Assay bestimmt. Anschließend wurden dem HEK-Zellsystem Agonisten (Isoproterenol, Epinephrin, Norepinephrin, Clenbuterol, Salbutamol, Salmeterol), ebenfalls in zeit- und konzentrationsabhängigen Versuchen, zugegeben. Die Entwicklung der Rezeptor-mRNA und -anzahl wurde mittels qPCR und ICYP-Bindungsstudien verfolgt. Zusätzliche Verdrängungsexperimente wurden zur Affinitätsbestimmung einiger Agonisten zum equinen β2AR genutzt. Der Einfluss von Zeit und Dosis von Doxycyclin wurde mittels Two-way-ANOVA mit Bonferroni-Korrektion ermittelt, wobei das Signifikanzniveau bei p < 0,05 festgelegt wurde. Ergebnisse: Die Bildung von Rezeptor-mRNA konnte über alle Doxycyclin-Konzentrationen hinweg mit einer 48-stündigen Inkubation am besten generiert werden, weshalb weitere Experimente mit dieser Induktionsdauer durchgeführt wurden. qPCR und ICYP-Bindungsstudien zeigten eine maximale mRNA- und Rezeptorproteinbildung bei 8,0 µg/ml Doxycyclin, wohingegen die Rezeptorfunktion in Form von Bildung des second messengers cAMP bei niedrigeren Doxycyclin-Konzentrationen (COS: 2,0 µg/ml; HEK: 0,5 µg/ml) gegeben war. Daher entschieden wir uns für eine Induktion mit 1,0 µg/ml Doxycyclin für 48 Stunden, welche dann als Startpunkt für die anschließende 72-stündige Agonistenzugabe genutzt wurde. Alle Agonisten induzierten nach 8-stündiger Inkubation eine gesteigerte Rezeptor-Genexpression, die jedoch meist nach 24 Stunden unter das Startniveau sank und dort auf einem niedrigen Level bis zum Betrachtungsende verblieb. Korrespondierend dazu stieg zeitversetzt die durch ICYP-Bindungsstudien bestimmte Rezeptoranzahl bis 48 Stunden an, zeigte danach unter Salmeterol und Salbutamol, jedoch nicht unter Clenbuterol, eine leichte Abnahme, ohne unter das Ausgangsniveau zu sinken. Die Affinität der Agonisten zum equinen β2AR zeigte folgende Reihenfolge: Salmeterol > Clenbuterol > Isoproterenol > Salbutamol. Schlussfolgerungen: Beide Zellmodelle eignen sich zur weiteren Erforschung der Rezeptorregulation des equinen β2AR mit den ermittelten Parametern für eine stabile Genexpression. Im HEK-System konnte erstmalig nach Agonisten-Zugabe gezeigt werden, dass es einen pharmakainduzierten Zusammenhang zwischen Rezeptor-mRNA-Bildung und dichte gibt, bevor die downregulierenden Prozesse unter Dauertherapie die Überhand bekommen. Salmeterol zeigte dabei schon in geringen Konzentrationen Effekte. Clenbuterol regulierte in unserem Modell jedoch die Rezeptoranzahl nach 72-stündiger Agonisten-Zugabe nicht herunter, was im Kontrast zu bisherigen Ergebnissen steht und zelltypabhängig zu sein scheint.