Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

Nesta tese foi estudada a influência da recirculação do percolado, ajustando as melhores taxas e freqüências, para degradação da fração orgânica dos resíduos sólidos urbanos, em sistema de batelada de uma e duas fases (híbrido). Foram utilizados reatores de 3,45 litros preenchidos com resíduo sólido urbano padrão (FORSUp), percolado como inóculo e um filtro anaeróbio como reator metanogênico. Foram testadas as taxas de recirculação do inóculo de 1%, 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30% e 50% e seu monitoramento feito por análises físico-químicas e microbiológicas. O reator que apresentou melhores valores de produção de metano e redução de DQO foi aquele com taxa de recirculação de 20% do percolado metanogênico. Na segunda etapa foram operados três digestores de 50L, alimentados com a FORSUp com as melhores taxas de recirculação determinadas na primeira etapa desse trabalho e a obtida no trabalho de Salgado (2003). Um reator simulou o reator acidogênico de um sistema de duas fases, no qual 20% de seu inóculo foi injetado em um filtro anaeróbio (com tempo de detenção hidráulico de 24 horas). Um outro sistema com taxa de 10% de recirculação de percolado foi operado como reator de uma fase. Outro reator, inoculado com a mesma quantidade de FORSUp e percolado, porém, não se realizou qualquer recirculação do seu inóculo (controle), servindo para comparar os digestores de uma e duas fases. O sistema de duas fases, comparado aos demais reatores, confirmou que a taxa de recirculação de 20%, obteve maior eficiência na partida, com elevada produção de metano e maior percentual de degradação de sólidos. Os exames microscópicos realizados em amostras de percolado desses reatores revelaram predominância de organismos de morfologia com características de Methanococcus e Methanosarcina. Concluiu-se que a taxa de recirculação de percolado influi significativamente nos reatores degradando a matéria orgânica. O estudo cinético confirmou que o processo de digestão obedece a cinética das reações em série, com elevados valores de k´1 / This thesis studied the influence of the leachate recirculation, adjusting to the best rates and frequencies, for degradation of the organic fraction of the urban solid wastes, in one and two-phases (hybrid) system. Bioreactors of 3.45 L were used and filled out with OFMSW pattern, leachate as seed and an anaerobic filter as methanogenic reactor. The performance of the reactors was analyzed varying recirculation rates (1, 2.5, 5, 10, 20, 30 and 50 % in volume of seed). Leachate samples from these reactors were examined through microscopical examinations and physical-chemical analyses to evaluate its performance. The reactor with 20% recirculation rate, got larger efficiency in the departure, methane production and percentage of solid degradation, compared to the others reactors. In the second stage, three 50L digesters were operated and fed with standard OFMSW with the best recirculation rates of the first stage and the best rate obtained in Salgado (2003). A bioreactor simulated the acidogenic reactor of a two-phase system, in which 20% of its seed was injected in anaerobic filter (with hydraulic detention time of 24 hours). Another system, with 10% of recirculation rate of leachate was operated in a one-phase reactor. Once more bioreactor, inoculated like others, however, without any recirculation were studied to compare with one and two-phase reactor. The two-phase system confirmed that the 20% recirculation rate, compared to the others reactors, obtained better efficiency with high methane production and solid degradation. The microscopical examinations in the leachate samples from this reactor presented predominance of organisms with characteristical morphology from Methanococcus and Methanosarcina. It was concluded that the leachate recirculation has significant influence in the degradation of organic matter bioreactors. The kinetic study confirmed that the anaerobic process for OFMSW proceed the in series kinetics, with high constants values of first order

nvestigando a estrutura dos sistemas elementares com simetria de Poincaré em 1 + 1 dimensões, devemos considerar o problema da eliminação das anomalias clássicas, que têm origem no segundo grupo de cohomologia não-trivial deste grupo dinâmico, gerando um termo de Wess-Zumino na ação da partícula relativística. Efetuamos a classificação geral de todos os sistemas elementares em 1 + 1 dimensões, em termos de co-órbitas, mostrando que existe um simplectomorfismo entre o espaço de fase reduzido da partícula e uma determinada co-órbita na álgebra de Lie dual à de Poincaré estendida. / While researching the structure of elementar systems with Poincaré symmetry in 1+1 dimensions, we must be concerned about the problem of elimination of the classical anomalies, which arise from the non-trivial second cohomology group of this dynamical group, generating a Wess-Zumino term in the relativistic particle action. We classify all elementary systems in 1+1 dimensions in terms of co-orbits, showing that there is a symplectomorphism between the reduced phase space of the particle and a certain co-orbit in the Lie algebra dual to the extended Poincaré one.

Nesta dissertação nós revisamos a teoria básica que descreve a junção Josephson bosônica para uma e duas espécies partindo do modelo de Bose-Hubbard. Em seguida explicamos como é possível gerar campos de calibe artificiais em um sistema de átomos neutros, como é o caso do condensado de Bose-Einstein. Finalmente, utilizando os conhecimentos teóricos desenvolvidos anteriormente nós buscamos os estados estacionários de um sistema de pseudospin 1/2 submetido a um campo de calibre não-Abeliano artificial, que torna a dinâmica da junção muito mais complexa e rica. Nós também exploramos um novo desbalanceamento de população que surge no sistema, devido a presença do campo de calibre, com características similares as do Macroscopic Quantum Self-Trapping. / In this dissertation we review the basic theory that describes the bosonic Josephson junction for one and two species using the Bose-Hubbard model. Afterwards, we explain how it is possible to generate artificial gauge fields for neutral atoms, like a Bose-Einstein condensate. Finally, using this theoretical background we search for stationary states of a pseudospin 1/2 system subject to a non-Abelian artificial gauge field which turns the dynamic of the junction much more complex and rich. We also explore a possible new populational imbalance that appears on the system due to the presence of the gauge field, with similar features as the Macroscopic Quantum Self-Trapping.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, sendo utilizado em associação com antibióticos β-lactâmicos. Atualmente, a purificação industrial do AC envolve, principalmente, processos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos e etapas cromatográficas. Assim, métodos alternativos como os sistemas micelares de duas fases aquosas (SMDFA), os quais oferecem seletividade na partição de biomoléculas de acordo com sua hidrofobicidade, são de grande interesse. O presente trabalho teve como objetivo estudar a partição do AC em sistemas micelares não iônicos de duas fases aquosas, puros e com adição do sal (NH4)2SO4 ou do polímero sulfato de dextrana (Dx-S). Os estudos de estabilidade do AC mostraram que o fármaco é mais estável em pH 6,5 e temperaturas mais baixas (5 - 20 ºC). Em relação à presença dos aditivos, foi verificado que a adição do Dx-S acarretou em menor perda da estabilidade do AC quando comparado ao (NH4)2SO4, com valor residual ≥ 90% a 35 °C. Na presença dos tensoativos Triton X-114 e Triton X-100, o AC apresentou-se estável, com valor residual de aproximadamente 100%. De acordo com os ensaios de partição, o AC foi recuperado preferencialmente na fase pobre em micelas, tanto nos sistemas TX/tampão quanto TX/sal para ambos os tensoativos, com valores de coeficiente de partição (KAC) ~ 0,7 e rendimento na fase diluída (Yclavd) ~ 75%. A adição do polímero em maiores concentrações (≥ 8% p/p) proporcionou um pequeno aumento nos valores de KAC, porém com valores ainda próximos a 1 - 1,5. Portanto, os resultados demonstraram que a presença dos aditivos não influenciou suficientemente a partição do AC para a fase micelar e, desta maneira, os sistemas TX/tampão mostraram ser mais eficientes para a recuperação do ácido clavulânico na fase pobre em micelas, podendo ser empregados como etapa prévia de extração em um processo biotecnológico. / Clavulanic acid (CA) corresponds to a potent β-lactamase inhibitor that is used in association with β-lactamic antibiotics. The industrial purification of CA usually involves liquid-liquid extraction processes employing organic solvents followed by several chromatographic steps. Therefore, new purification alternatives such as aqueous two-phase micellar systems (ATPS) are of great interest. These systems can provide selectivity in biomolecule partitioning according to hydrophobicity and other molecular properties. Within this context, the main goal of this study was to investigate CA partitioning in aqueous two-phase micellar (nonionic) systems, with and without the addition of (NH4)2SO4 or dextrane sulfate (Dx-S). Stability studies performed with CA indicated that the drug is more stable at pH 6.5 and lower temperatures (5 - 20 ºC). In addition, it was demonstrated that Dx-S addition led to a lower loss of CA stability in comparisson to (NH4)2SO4, with residual values ≥ 90% at 35 °C. The drug was found to be very stable in the presence of the surfactants Triton X-114 and Triton X-100, with residual values around 100%. Regarding CA partitioning in the ATPMS, the drug partitioned preferentially to the micelle-poor phase, irrespective of the surfactante employed and of the presence of (NH4)2SO4,with partition coefficient (KAC) ~ 0.7 and yield in the poor phase (Yclavd) ~ 75%. Nonetheless, the addition of Dx-S in concentrations (≥ 8.0% p/p) resulted in a discrete increase in KAC, with values around 1 - 1.5. Therefore, the results obtained in this work demostrated that the addition of (NH4)2SO4 or Dx-S to ATPMS did not significantly influenced CA partitioning to the micelle-rich phase and, in this context, the systems investigated could be considered more eficiente for CA recovery in the micelle-poor phase, as a previous extraction step of a biotechnological process.

O trabalho é uma leitura da obra de João Cabral de Melo Neto, de Pedra do Sono a Andando Sevilha, reavaliando algumas considerações de sua Fortuna Crítica. Promove-se a revisão de alguns estudos definidores da poética cabralina que postularam que sua lógica de composição está atrelada à segmentação de sua poesia em duas vertentes: as \"duas águas\". Considera-se que a maioria destes estudos, realizados durantes os anos 60 e 80, reforçaram alguns pressupostos, tais como o antilirismo de sua poesia, sem confrontar as categorias analíticas ao conjunto dos livros do poeta, escritos após A Educação Pela Pedra. Apresentase, portanto, a análise dos seis livros do poeta de Museu de Tudo a Andando Sevilha que conferem ao todo da poesia de João Cabral uma nova conformação. A partir da análise da tematização do lirismo-amoroso e do feminino e da inscrição do autobiográfico na obra, problematiza-se a divisão da poesia cabralina em duas vertentes e reconsideram-se os desdobramentos dela decorrentes. / This research is the reading about João Cabral de Melo Neto work, from Pedra do Sono (Sleep\'s Stone) to Andando Sevilha (Walking Sevilla) , re-evaluating some considerations from his Critical Fortune. It is promoted a revision of some studies which defined the Cabral\'s poetics and which postulated that his logic of composing is attached to the segmentation of his poetry in two ways: the \"two waters\". It is considered that most of those studies, which were accomplished during the 1960\'s and 1980\'s, reinforce some propositions, such as the antilyricism in his poetry, without confronting the analytical categories to all his books, written after A Educação Pela Pedra (Education by Stone). It is presented, therefore, the analysis about the six books written by the author from Museu de Tudo (Museum of Everything) to Andando Sevilha (Walking Sevilla) which give to João Cabral whole poetry a new configuration. Starting from the analysis about the themes of love-lyricism and feminine and the inscription of auto-biography in his work, it is discussed the problematic of the division of Cabral\'s poetry in two perspectives and the unrollings which are consequences of this division.

Made available in DSpace on 2016-10-13T14:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Comunicacao_e_consumo_da_marca_global.pdf: 5484421 bytes, checksum: db4bb31e3ac74a285097e8d0ae28aef7 (MD5) Previous issue date: 2010-03-19 / Contemporary society, which has been called consumer society, characterized by constant and permanent changes, accelerated by advances in technology. Relations Communication / reception / consumption / identities, a feature of this season, are manifested in society as a whole. It is in this context that this research falls, with the corpus telenovelas Two Face, broadcast on TV Globo (Brazil), and The Other, broadcast by TVI (Portugal), both aired in prime time. Intraficção television advertising (product placement commercial) and mode (consumer) receiver that can be inferred from soap operas will be evaluated and compared in the field, subject to receipt of different socioeconomic levels. We believe that the material and symbolic aspects of goods are intrinsically linked: every product has a meaning assigned to it socially and a concrete face - stant the object itself has no value until it is used socially. This research will seek to understand the process of construction of meaning present in soap operas from the combination material / symbolic / A sociedade contemporânea, que tem sido denominada sociedade de consumo, caracteriza-se pelas constantes e permanentes mudanças, aceleradas pelo avanço da tecnologia. As relações comunicação/ recepção/ consumo/ identidades, uma das características dessa época, estão manifestadas na sociedade como um todo. É neste âmbito que esta pesquisa se insere, tendo como corpus as telenovelas Duas Caras, transmitida pela Rede Globo (Brasil), e A Outra, transmitida pela TVI (Portugal), ambas veiculadas no horário nobre. A publicidade intraficção televisiva (merchandising comercial) e a modalidade de (consumidor) receptor que se pode inferir destas telenovelas serão avaliadas e confrontadas, no campo, com sujeitos da recepção de diferentes níveis socioeconômicos. Consideramos que os aspectos materiais e simbólicos dos bens estão intrinsecamente interligados: todo produto possui um significado que lhe é atribuído socialmente e uma face concreta - o objeto per se stante não possui valor enquanto não for socialmente utilizado. Essa pesquisa procurará compreender o processo de construção de sentidos presentes nas telenovelas a partir da conjunção bens materiais/ simbólicos

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.