Purpose: The aim of this work was to characterize the healthy human cornea and the cornea of patients suffering from posterior polymorphous corneal dystrophy (PPCD) using different antibodies. Despite the fact that PPCD is a very rare disorder, one of the largest groups of PPCD patients in the world comes from the Czech Republic. This offers us the opportunity to investigate the changes on the clinical, cellular and molecular levels. Material and Methods: A collection of 25 control corneas as well as 16 pathological corneas from PPCD patients were used. Epithelial (cytokeratins) and mesothelial markers (mesothelin, calbindin 2, HBME-1 protein) were detected in all layers of the healthy corneas using immunocyto- and immunohistochemistry. The expression of all markers was confirmed using molecular methods as well (RT-PCR and Western blot). Changes in the expression of cytokeratins and changes in the extracellular matrix structure (collagen IV and VIII) were studied in the PPCD corneas. Combined fluorescent immunohistochemistry with fluorescence in situ hybridization were used in order to characterize the origin of abnormal cells on the posterior graft surface, which cause the recurrence of the PPCD after penetrating keratoplasty surgery. Results: Changes in the cytokeratin expression (strong...

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第12788号 / 論医博第2068号 / 新制||医||1000(附属図書館) / 30807 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 瀬原 淳子, 教授 髙橋 淳, 教授 山下 潤 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19229号 / 医博第4028号 / 新制||医||1011(附属図書館) / 32228 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙橋 良輔, 教授 妻木 範行, 教授 井上 治久 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23770号 / 医博第4816号 / 新制||医||1056(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 安達 泰治, 教授 遊佐 宏介 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

<p>  </p> <p>Heart disease is the leading cause of death for individuals with Duchenne muscular dystrophy (DMD). DMD is a devastating and progressive neuromuscular disease with no known cure. This X-linked genetic disorder affects nearly 1 in 5000 boys and manifests as debilitating muscle weakness and progressive cardiomyopathy (CM). While CM in some individuals with DMD progresses rapidly and fatally in their teenage years, others can live relatively symptom-free into their thirties or forties. Early identification and treatment can improve quality and length of life, but currently, there are no standard imaging biomarkers that can detect early onset or rapidly progressing DMD CM. Addressing this gap, we describe here a novel cardiac image analysis paradigm using 4D cardiac magnetic resonance imaging (CMR) to map left-ventricular kinematics comprehensively in DMD CM. The primary goal of this dissertation work is to introduce novel imaging biomarkers and computational methods to enable earlier diagnosis and precise prognosis for cardiac function in DMD. Central to this goal, we identified myocardial strain biomarkers that predict the early onset and rapid progression of cardiac disease in vulnerable patients. These findings bridge clinical gaps and pave the way for multi-center studies to characterize DMD CM progression and assessment of individual patient risk profiles for improved treatment and outcomes in DMD.</p>

Die myotone Dystrophie ist eine autosomal dominant vererbte, multisystemische Erkrankung mit skelettmuskulärem Fokus und wird in zwei Untergruppen eingeteilt, die myotone Dystrophie Typ I (MD1), verursacht durch eine CTG-Trinukleotidexpansion im DMPK-Gen auf Chromosom 19, und die myotone Dystrophie Typ II (MD2), verursacht durch eine Tetranukleotidexpansion im CNBP-Gen auf Chromosom 3. Die Nukleotidexpansionen akkumulieren als mRNA intranukleär und tragen über die Beeinflussung des alternativen Splicings von über 30 Genen zum Erkrankungsmechanismus bei. Daneben akkumulieren die mRNA-Repeats im Zytoplasma und induzieren über die Repeat-assoziierte-non-AUG-Translation (RAN-Translation) die Akkumulation aberranter Proteine. Wenngleich die Patienten der MD2 einen milderen Krankheitsverlauf erleben, zeigen sie ein erhöhtes Auftreten von Autoimmunerkrankungen. In der Pathogenese der Autoimmunerkrankungen spielt die durch Interferon-Typ-I vermittelte Immunreaktion eine wichtige Rolle. In der AG Günther konnte eine erhöhte Expression interferonstimulierter Gene und die erhöhte Expression von Markern des Stresszustandes des endoplasmatischen Retikulums in Fibroblasten von MD2-Patienten nachgewiesen sowie die erhöhte Prävalenz von Autoimmunerkrankungen in MD2 gezeigt werden. Die Auswertung serologischer Parameter im Rahmen dieser Arbeit erlaubte eine klinische Charakterisierung der Patienten und ergab einen positiven Zusammenhang zwischen Höhe der Myoglobin-Konzentration im Serum und Länge der CCTG Repeats. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die zytoplasmatischen RNA-Repeats über die RAN-Translation und Akkumulation aberranter Proteine zur Induktion von ER-Stress führen, welcher über die gemeinsame Kontaktflächen der Mitochondrien-assoziierten Membranen (MAMs) in die Mitochondrien übertragen wird. Im Rahmen des mitochondrialen Stresszustandes könnte es zu einer Freisetzung mitochondrialer DNA und zur Aktivierung des zytosolischen DNA-Rezeptors cGAS und einer nachfolgenden Expression von Interferon und Interferon-stimulierten Genen kommen, die für das vermehrte Auftreten der Autoimmunerkrankungen verantwortlich sind. Zur Überprüfung der Hypothese sollte nach Analyse der Proteinexpression der ER-Stress-Marker eIF2α und peIF2α eine Hemmung der ER-Stressreaktion vorgenommen werden. Die anschließende Untersuchung des mitochondrialen Stresszustandes und die Unterbrechung der MAMs sollte Aufschluss über die Rolle der Mitochondrien in der Pathogenese der Autoimmunität liefern. In dieser Arbeit konnte die erhöhte Expression des ER-Stressmarkers peIF2α nach Stressinduktion in Fibroblasten von MD2-Patienten gezeigt werden. Dies könnte auf eine Sensibilisierung des Signalweges im Rahmen eines chronischen Stresszustandes hinweisen. Der Versuch einer Behandlung der Fibroblasten mit Ursodesoxycholsäure (UDCA), einem chemischen Chaperon, mit Ziel der Suppression der ER-Stressreaktion erzielte keine Reduktion der Expression der ER-Stressmarker unter Nativniveau. Nach Stimulation des ER-Stresses konnte mit UDCA-Vorbehandlung dennoch die Reduktion auf Nativniveau erzielt werden. Zur Analyse des mitochondrialen Stresszustandes wurde eine Färbung mit Mitotracker-Farbstoffen und anschließender Durchflusszytometrie und eine Messung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) vorgenommen, welche ein verringertes mitochondriales Membranpotential und eine erhöhte ROS-Expression in den MD2-Fibroblasten ergaben und mit einem mitochondrialen Stresszustand einhergehen könnten. Nach Unterbrechung der räumlichen Verbindung zwischen ER und Mitochondrium durch die Herunterregulation des gemeinsamen Strukturproteins PERK konnten Hinweise auf eine verringerte ROS-Expression in den MD2-Fibroblasten gefunden werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese der Funktion der mitochondrialen Stressreaktion in den Fibroblasten der MD2-Patienten, wenngleich die Autoimmunität-vermittelnden Mechanismen noch Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein sollten.

Le muscle strié squelettique est un tissu richement vascularisé. Au delà de l'apport en oxygène et en nutriments, de nouvelles fonctions des vaisseaux ont été récemment identifiées, par le biais des interactions établies entre les cellules du vaisseau (cellules endothéliales) et les cellules du muscle, en particulier les cellules souches musculaires (cellules satellites). Celles-ci interagissent étroitement avec les cellules endothéliales pour leur expansion et leur différenciation, puis avec les cellules péri-endothéliales pour leur auto-renouvellement et leur retour à la quiescence. Les vaisseaux participent ainsi au contrôle de l’homéostasie du muscle squelettique. Grâce à ces interactions, les cellules vasculaires jouent donc un rôle central dans le remodelage tissulaire après un phénomène destructif, survenant par exemple au cours d’un trauma ou d’une myopathie. Pour étudier, les mécanismes de la plasticité vasculaire au cours du remodelage tissulaire, deux situations paradigmatiques de muscle en régénération chez l’enfant : la dermatomyosite juvénile (DMJ) et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) ont été étudiées. Il existe, dans ces deux pathologies une souffrance musculaire associée à des cycles de nécrose/régénération. Elles se différencient par leur plasticité vasculaire et par leur évolution. En effet, la DMJ, la myopathie inflammatoire la plus fréquente de l’enfant est caractérisée par une vasculopathie avec perte en capillaires. L’évolution peut être favorable avec restitution ad integrum du muscle. La DMD est une myopathie génétique conduisant à une dégradation progressive de la force musculaire associée à une néovascularisation compensatrice. Le volet clinique/histologique incluant une analyse multiparamétrique des critères évolutifs cliniques et de réponse thérapeutique couplée à une réévaluation des données histologiques de la DMJ (analyse morphométrique des muscles DMJ) a permis de montrer qu’il existait des sous groupes phénotypiques homogènes de sévérité différente dans la DMJ. Le degré de sévérité clinique est relié à la gravité de la vasculopathie musculaire Par ailleurs, des marqueurs cliniques et histologiques simples permettant de repérer au diagnostic les patients nécessitant une escalade thérapeutique rapide (CMAS>34, atteinte gastrointestinale, fibrose endomysiale musculaire au diagnostic) ont été identifiés. Le volet cellulaire a permis l’identification in vitro des interactions cellulaires spécifiques et différentielles des myoblastes issues de patients DMD et DMJ sur les cellules endothéliales normales par l’analyse de leur rôle sur la prolifération, migration et différenciation des cellules vasculaires. Dans la DMD, les myoblastes entrainent une réponse angiogénique importante mais non efficace (néovascularisation anarchique). Dans la DMJ, les myoblastes participent efficacement à la reconstruction vasculaire notamment via la sécrétion de facteurs proangiogéniques. Ces résultats ont été renforcés par analyse transcriptomique effectuée à partir de cellules endothéliales et satellites isolées de muscles de patients confirmant le rôle central de la vasculopathie associée à un contexte inflammatoire spécifique lié à l’interféron dans la physiopathologie de la DMJ et montrant dans la DMD une dérégulation de l’homéostasie normale des interactions vaisseau-muscle avec mise en jeu d’un remodelage tissulaire non efficace. Ces données permettent d'identifier de nouvelles fonctions des cellules vasculaires dans le remodelage du muscle strié squelettique au cours des pathologies musculaires de l'enfant, et devraient ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. / Skeletal muscle is highly vascularised. Beyond oxygen and nutriment supply, new functions for vessels have been recently identified, through the interactions that vessel cells (endothelial cells) establish with muscle cells, particularly with muscle stem cells (satellite cells). These latter closely interact with endothelial cells for their expansion and their differentiation, then with periendothelial cells for their self-renewal and return to quiescence. During skeletal muscle regeneration endothelial cells reciprocally interact with myogenic cells by direct contact or by releasing soluble factors to promote both myogenesis and angiogenesis processes. Skeletal muscle regeneration typically occurs as a result of a trauma or disease, such as congenital or myopathies. To better understand the role of vessel plasticity in tissue remodeling, we took advantage of two muscular disorders that could be considered as paradigmatic situations of regenerating skeletal muscle in the child: Juvenile Dermatomyositis (JDM), the most frequent inflammatory myopathy and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), the most common type of muscular dystrophy. Although these two muscular disorders share, at the tissue level, similar mechanisms of necrosis-inflammation, they differ regarding the vessel domain. In JDM patients, microvascular changes consist in a destruction of endothelial cells assessed by focal capillary loss. This capillary bed destruction is transient. The tissue remodeling is efficient and muscle may progressively recover its function. By contrast, in DMD, despite an increase of vessels density in an attempt to improve the muscle perfusion, the muscle function progressively alters with age. We identified clinical and pathological markers of severity and predictive factors for poor clinical outcome in JDM by computing a comprehensive initial and follow-up clinical data set with deltoid muscle biopsy alterations controlled by age-based analysis of the deltoid muscle capillarization. We demonstrated that JDM can be divided into two distinctive clinical subgroups. The severe clinical presentation and outcome are linked to vasculopathy. Furthermore, a set of simple predictors (CMAS<34, gastrointestinal involvement, muscle endomysial fibrosis at disease onset) allow early recognition of patients needing rapid therapeutic escalation with more potent drugs. We studied in vitro the specific cell interactions between myogenic cells issued from JDM and DMD patients and normal endothelial cells to explore whether myogenic cells participate to the vessel remodeling observed in the two pathologies. We demonstrated that MPCs possessed angiogenic properties depending on the pathological environment. In DMD, MPCs promoted the development of establishment of an anarchic, although strong, EC stimulation, leading to the formation of weakly functional vessels. In JDM, MPCs enhanced the vessel reconstruction via the secretion of proangiogenic factors. This functional analysis was supported by the transcriptomic analysis consistent with a central vasculopathy in JDM including a strong and specific response to an inflammatory environment. On the contrary, DMD cells presented an unbalanced homeostasis with deregulation of several processes including muscle and vessel development with attempts to recover neuromuscular system by MPCs. To summarize, our data should allow the definition of new functions of vessel cells in skeletal muscle remodelling during muscle pathologies of the child that will open the way to explore new therapeutic options and to gain further insights in the pathogenesis of these diseases.