Background: In this study, six enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), intended for routine porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) herd monitoring, are tested for their ability to detect PRRSV specific antibodies in the serum of pigs after vaccination with an inactivated PRRSV type 1 vaccine and subsequent infection with a highly pathogenic (HP) PRRSV field strain. For this reason, ten piglets (group V) from a PRRSV negative herd were vaccinated twice at the age of 2 and 4 weeks with an inactivated PRRSV vaccine. Ten additional piglets (group N) from the sameherd remained unvaccinated. Three weeks after second vaccination, each of the piglets received an intradermal application of an HP PRRSV field strain. Serum samples were taken before first vaccination as well as before and 3, 7, 10 and 14 days after HP PRRSV application. All serum samples were tested for PRRSV RNA by reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) as well as for PRRSV antibodies with all six study ELISAs. Results: At the beginning of the study (before vaccination), all of the piglets were PRRSV antibody negative with all study ELISAs. They also tested negative for PRRSV RNA measured by RT-qPCR. From day 3 after HP PRRSV application until the end of the study, a viremia was detected by RT-qPCR in all of the piglets. On day 0 (day of HP PRRSV application), nine out of ten piglets of the pre-vaccinated group tested PRRSV antibody positive with one of the tested ELISAs, although with lower S/P values than after infection. On day 10 after HP PRRSV application, all study ELISAs except one had significantly higher S/P or OD values, respectively more positive samples, in group V than in group N. Conclusions: Only one of the tested ELISAs was able to detect reliably PRRSV antibodies in pigs vaccinated with an inactivated PRRSV vaccine. With most of the tested ELISAs, higher S/P values respectively more positive samples after PRRSV infection were seen in the pre-vaccinated group than in the non-vaccinated.

I december 2019 rapporterades fall av oidentifierad lunginflammation, senare känd som Covid-19. Antalet fall ökar fortfarande snabbt i världen och därmed utgör Covid-19 ett extraordinärt hot mot folkhälsan. Studier har visat en ökad mängd proinflammatoriska cytokiner TNF-α, associerade med andningssvårigheter samt en ökad kortisolproduktion. Utsöndring av kortisol och TNF-α är associerade med fysiska- och psykiska hälsoeffekter, sjukdomsgrad samt dödsfall av Covid-19. Syftet med studien var att undersöka utsöndringen av biomarkörerna kortisol och TNF-α i saliv hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 samt hos individer utan diagnostiserad Covid-19 (kontrollgrupp). Det för att undersöka huruvida kvarvarande symtom kunde associeras till biomarkörerna. Studien inkluderade 40 individer, varav 20 individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 samt 20 individer utan diagnostiserad Covid-19. Saliv och ett frågeformulär om deras allmänna hälsotillstånd och symtom kopplade till Covid-19 infektion samlades in och analyserades. Salivprover tagna på morgon analyserades med ELISA och resultatet jämfördes mellan grupperna. Inga signifikanta skillnader visade mellan grupperna gällande biomarkörer. Resultaten visade dessutom inga korrelation mellan symtom och biomarkörer samt att inga förhöjda nivåer av analyserade biomarkörer kan associeras med kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion. / A cluster of unidentified pneumonia cases, later known as Covid-19, were reported in December 2019. The number of Covid-19 cases is still rapidly increasing and poses an extraordinary threat to our public health. Studies have shown an increased level of the cytokine TNF-α, associated with severe respiratory symptoms as well as an increased cortisol production. Together associated with physical and mental health effects, disease severity and increased mortality of Covid-19. This study aimed to evaluate the secretion of cortisol and TNF-α in the saliva of individuals previously diagnosed with Covid-19 and individuals not diagnosed with Covid-19 (control group). This to examine whether the residual symptoms can be associated with the analyzed biomarkers. The study included 40 participants, 20 individuals diagnosed with Covid-19 and 20 individuals not diagnosed with Covid -19. Saliva and a questionnaire concerning their overall health and possible symptoms associated with Covid-19 infection were collected and analyzed. Saliva morning samples were analyzed with ELISA and results were compared between the groups. No significant differences were shown between the groups regarding the biomarkers. Also, the results showed no correlations between symptoms and biomarkers, nor elevated levels of analyzed biomarkers could be associated with residual symptoms after a Covid-19 infection.

The highly pathogenic Avian Influenza subtype H5N1 can lead to 100 % mortality in chickens. The main issue in prevention of H5N1 is the development of efficient poultry vaccines. Influenza haemagglutinin (HA) derived recombinant polypeptides would not elicit an immune response against internal viral proteins. Thus HA polypeptide use facilitates differentiation between infected and vaccinated animals (DIVA). Serological tests using recombinant immune-dominant proteins devoid of non-specific moieties present in whole cell preparations might have higher sensitivity and specificity. In the present study, four non-overlapping sequences of different functional domains of influenza A virus subtype H5 virus (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) designated P1, P2, P5 and rHA1 were cloned and expressed in Pichia pastoris for vaccination and diagnosis purposes. The four polypeptides were expressed successfully in P. pastoris using peptone methanol (1 % (w/v) yeast extract, 2 % (w/v) peptone, 2 % (v/v) methanol). P1, P2 and rHA1 polypeptides were purified using nickel affinity chromatography, whereas, P5 was purified using lectin affinity chromatography. Correct expression was analysed by SDS-PAGE and western blot, glycosylation analysis and MALDI-TOF.The immune responses of P1, P2 and rHA1 polypeptides were assessed in BALB/C mice. To enhance antibody response, recombinant polypeptides were mixed with the Gerbu adjuvant and injected subcutaneously. Vaccination of mice induced high subtype specific antibody titres in mice as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen) and Immunofluorescence assay (IFA) performed on Vero cells infected with H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004). The immunogenicity of P1, P2, P5 and rHA1 polypeptides was determined in commercial layer chickens. Results showed that P1, P2 and rHA1 polypeptides induced high subtype specific antibody titres in chickens as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen), IFA (performed on Vero cells infected with H5N1 A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) and microneutralization test (µNT). However, P5 polypeptide was not immunogenic in chickens. Neutralizing antibodies could be detected in chicken sera immunized with P1, P2 and rHA1 polypeptides as analyzed with microneutralization test. IgY was analysed in egg yolk of chickens immunized with recombinant polypeptides. The IgY of chicken immunized with P1 and rHA1, transferred to the egg yolk was proportional to maternal serum IgY. However, IgY could not be detected in egg yolk of chickens immunized with P2 and P5 recombinant polypeptides. The more immunogenic polypeptides P1 and rHA1 were used in an recombinant Elisa (rElisa) for detection of influenza A subtype H5 in chickens and duck sera.The optimal antigen for the concentrations of rHA1, P1 was 50 ng / well, 50 ng / well. Analysis of 25 positive sera and 25 negative sera to H5 antibodies revealed that, the sensitivity of Western blot, whole H5N1 Elisa, agar gel immunodiffusion test (AGID), P1-Elisa and rHA1-Elisa was 100 %, 100 %, 52 %, 80 % and 100 %, respectively, while the specificity was 100 %, 100 %, 100 %, 72 %, and 100 %, respectively. Moreover, duck sera, with haemagglutination inhibiting titer ranged from 4 - 8 log2, were tested positive by rHA1 Elisa compared with negative duck sera. Further analysis of 179 serum samples with rHA1-Elisa in comparison with haemagglutination inhibition (HI) and commercial Elisa proved to be highly sensitive and specific. The agreement ratio between rElisa and HI was 84.9 % and between commercial Elisa (Flock check) and HI was 76.5 %. In conclusion, P. pastoris may allow development of an effective recombinant influenza vaccine based on truncated sequences of HA that might provide broader protection against H5 influenza viruses. The possibilities to use rHA1, P1 and P5 recombinant polypeptides as a vaccine against H5 influenza should be further studied. Also our study demonstrates the potential utility of recombinant Elisa as a tool for improvement of serological diagnosis of influenza A subtype H5 in chickens and ducks. / Die hochpathogene aviäre Influenza des Subtyps H5N1 erreicht beim Ausbruch von Infektionen in Nutzgeflügelbeständen Mortalitätsraten von bis zu 100 %. Effektive und kostengünstige Impfstoffe werden benötigt, die möglichst auch eine Differenzierung zwischen geimpften Tieren und mit Wild-Virus infizierten Tieren zulassen. In diesem Zusammenhang könnten Peptid-Vakzine eine mögliche Alternative zu den herkömmlichen Impfstoffen darstellen, bei denen unter Verwendung des Vollvirus Antikörper gegen mehrere Virusproteine induziert werden. Außerdem, könnten rekombinante Antigene in serologischen Tests zur Diagnose von H5 Virus in Nutzgeflügel eingesetzt werden. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit, wurden vier verkürzte Sequenzen des Hämagglutinins (P1, P2, P5 und rHA1) von Subtyp H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) rekombinant in Pichia Pastoris exprimiert. Dazu erfolgten zunächst eine Klonierung in der Expressionsvektor pAOX und die Transformation von Pichia Pastoris. Die Expression wurde durch Methanol induziert. Der Nachweis der rekombinanten Fusionspeptiden mit C-terminalen Histidin-Tag erfolgte durch SDS-PAGE, Western Blot, Glycolysierungsanalyse, und MALDI-TOF. Der Histidin-Tag ermöglichte die Reinigung von P1, P2 und rHA1 mit Metall-Affinitätschromatographie. Polypeptid P5 hingegen wurde mittels Lectin-Affinitäts- chromatographie gereinigt. Balb/c Mäuse wurden mit Polypeptid P1, P2 bzw. rHA1, versetzt mit Gerbu Adjuvans, immunisiert. Zur Untersuchung der Immunantwort wurden die murinen Seren mittels Elisa (unter Verwendung rekombinanter Antigene oder Voll-H5N1 Antigen) sowie IFA (durchgeführt in Vero- Zellen infiziert mit A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) analysiert. Dabei wurde die präferentielle Induktion von H5-spezifischen Antikörpern detektiert. Die Immunogenität der P1, P2, P5 und rHA1-Polypeptide wurde in kommerziellen Legehennen bestimmt. Seren wurden mit ELISA, IFA, und Mikroneutralizationstest (μNT) analysiert. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die Polypeptide P1, P2 und rHA1 hohe Subtyp-spezifische Antikörpertiter in Hühnern induzierten. Im µNT konnte nur ein niedriger neutralisierender Antikörpertiter nachgewiesen werden. Das P5- Polypeptid ist bei Hühnern nicht immunogen. Im Eigelb von Hühnern, die mit den rekombinanten Polypeptiden P1 und rHA1 immunisiert wurden, konnten H5-spezifische IgY Antikörper detektiert werden. Hühner, die mit P2 und P5 immunisiert wurden, zeigten keine IgY im Eigelb. Die rekombinanten Antigene P1 und rHA1 wurden im ELISA auf ihre potenzielle Eignung für die Serodiagnostik untersucht. Die optimale Antigenkonzentration war 50 ng / well. Die serologische Analyse von 25 positiven und 25 negativen Seren auf Antikörper gegen H5 zeigte, dass Sensitivität und Spezifität von Western Blot, Voll-H5N1 ELISA und rHA1-ELISA bei jeweils 100 % lagen. Bei Agargel- Immunodiffusiontest (AGID) lagen Sensitivität und Spezifität bei 52 % und 100 %, während im P1-Elisa lediglich eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 72 % erreicht wurden. Somit eignet sich rHA1 für die Anwendung in der Serodiagnostik. Bei der serologischen Untersuchung von 175 Hühnerseren wurde eine Überbestimmung zwischen rHA1-ELISA und Hämagglutinationshemmungstest (HAI) 84.9 % festgestellt, während diese zwischen dem kommerziellen ELISA (Flock Check) und HAI 76.5 % betrug. Die Ergebnisse zeigten, dass das Expressionssystem P. pastoris als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von H5 Influenza geeignet ist. Challenge-Versuche sind nötig, um die Eignung von rekombinanten Antigenen als möglichen Impfstoff gegen H5 Influenza zu untersuchen.

Zöliakie ist eine immunologisch vermittelte Erkrankung bei der die Dünndarm-schleimhaut durch das in zahlreichen Getreidesorten vorkommende Klebereiweiß Gliadin geschädigt wird. Dabei wird die typische Architektur der Mukosa zerstört und imponiert histologisch als Zottenatrophie. In Folge dessen zeigen Betroffene Mangelerscheinungen und Verdauungsbeschwerden sowie zahlreiche extra-intestinale, atypische Symptome. Bei Kindern können zusätzlich gravierende Wachstums- und Entwicklungsstörungen auftreten. Die Therapie besteht in einer lebenslangen glutenfreien Diät. Die Diagnostik der Erkrankung basiert auf vier Säulen: Neben der Beurteilung der klinischen Symptomatik werden zöliakie-typische Antikörper nachgewiesen, welche bei hoher Konzentration die Indikation zur Biopsie darstellen. Die bioptische Untersuchung mit anschließendem histolo-gischem Nachweis der Zottenatrophie stellt den Goldstandard der Diagnostik dar und wird durch die Besserung der klinischen Symptomatik unter glutenfreier Diät gestützt. Bei der serologischen Untersuchung haben Antikörper gegen natives Gliadin auf Grund niedriger diagnostischer Genauigkeit an Bedeutung verloren. Sie wurden durch die Bestimmung von Autoantikörpern gegen die Gewebstransglutaminase abgelöst, die eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen. Im Jahr 2000 konn-te jedoch gezeigt werden, dass sich Antikörper von Zöliakiepatienten an Gliadin-peptide besser nach selektiver Deamidierung (Austausch der Aminosäure Glutamin durch Glutaminsäure) binden. Darauf aufbauend entwickelte die Firma INOVA Diagnostics im Jahr 2006 erst-mals einen ELISA zur Zöliakiediagnostik mit synthetisch hergestellten, deamidier-ten Gliadinpeptiden (DGP) als Antigen. Zu Beginn unserer Arbeit existierten keine Veröffentlichungen zur diagnostischen Genauigkeit dieser Tests bei Kindern und nur eine Veröffentlichung, die zwei der ELISA an Seren von erwachsenen Patienten untersuchte. Bei Kindern ist es jedoch besonders wichtig, durch die Antikörperbestimmung eine hohe Diagnosesicher-heit zu erlangen, weil für sie die Biopsie eine große Belastung darstellt und eine nicht erkannte Zöliakieerkrankung zu schwerwiegenden Entwicklungsstörungen führen kann. Aus diesem Grund soll die vorliegende Studie den Nutzen dieser neuen ELISA in der Diagnostik der Zöliakie im Kindesalter evaluieren. Es wurden dazu insgesamt 340 Seren von bioptisch bestätigten Zöliakiepatienten und Kontrollen, bei denen die Erkrankung histologisch ausgeschlossen wurde, gesammelt, verblindet und retrospektiv analysiert. Dabei wurden vier verschiede-ne ELISA der Firma INOVA Diagnostics eingesetzt: drei ELISA mit DGP als An-tigen sowie ein weiterer ELISA, in dem DGP mit Gewebstransglutaminase kombiniert war. Es wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: 1. Alle vier ELISA eignen sich zur Diagnostik von Zöliakie bei Kindern und weisen eine hohe Trennschärfe auf. Die Fläche unter der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve ist für alle vier Tests größer als 0,96. Mit den Tests kann somit die Indikation zur bioptischen Untersuchung mit großer Sicherheit gestellt werden. 2. Die Bestimmung der Antikörper gegen DGP ist der Antikörperbestimmung gegen natives Gliadin überlegen. Die DGP-Tests weisen eine signifikant größe-re Fläche unter der ROC-Kurve als die Tests auf Antikörper gegen natives Gli-adin auf. Die Bestimmung der Antikörper gegen DGP ist der Bestimmung von Antikörpern gegen Gewebstransglutaminase nicht unterlegen. Die Flächen un-ter den ROC-Kurven unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. 3. Überraschenderweise zeigt die IgG-Klasse der DGP eine signifikant höhere diagnostische Genauigkeit als die IgA-Klasse. Somit ist auch bei Patienten mit IgA-Mangel eine sichere Diagnosestellung gegeben und es kann auf die gene-relle Bestimmung des Gesamt-IgA verzichtet werden. 4. Der DGP-IgG-Test weist von den vier validierten Antikörpertests bei einer Sensitivität von 100 % die höchste Spezifität (90 %) und bei einer Spezifität von 100 % die höchste Sensitivität (64 %) auf. 5. Durch den kombinierten Test mit zwei Antigenen und den gleichzeitigen Nachweis von IgA und IgG in einem ELISA (tTG/DGP-Screen-Test) lassen sich Kosten und Zeit sparen. Dieser kombinierte Test weist die höchste diagnosti-sche Genauigkeit der untersuchten DGP-Tests auf. 6. Durch Angabe von Likelihood Ratios und mittels grafischer Darstellung der Posttest-Wahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der Antikörperkonzentration und Prävalenz können den behandelnden Ärzten wertvolle Informationen zur Di-agnosesicherheit eines einzelnen Testergebnisses vermittelt werden. Mit den evaluierten DGP-Tests stehen neue und zuverlässige ELISA zur Diagnos-tik der Zöliakie im Kindesalter zur Verfügung. Sie weisen eine hohe diagnostische Sicherheit auf und unterscheiden sicher zwischen Gesunden und Zöliakiepatien-ten. Die Indikation für eine Dünndarmbiopsie kann mit Hilfe der DGP-Tests sehr sicher gestellt werden. Ob darüber hinaus auf der Basis sehr hoher Antikörper-konzentrationen ohne histologische Untersuchung die Diagnose Zöliakie ausrei-chend sicher gestellt werden kann oder bei sehr niedrigen Konzentrationen auf einen bioptischen Ausschluss verzichtet werden kann, soll in einer weiteren be-reits in Planung befindlichen prospektiven Studie geklärt werden. Zusätzlich sollte die Diagnosestellung durch DGP-Tests bei besonders jungen Kindern in prospektiven Studien untersucht werden. Die vorliegende Arbeit legt gemeinsam mit anderen Untersuchungen den Grundstein dafür.:Bibliografische Beschreibung Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 11 1.1 Definition 11 1.2 Formen der Zöliakie und Epidemiologie 12 1.3 Diagnostik 13 1.3.1 Klinische Symptomatik 13 1.3.2 Serologische Untersuchung 14 1.3.3 Histologische Untersuchung 15 1.4 Pathogenese 18 1.5 Deamidierte Gliadinpeptide 21 2 Zielstellung 23 3 Methoden 25 3.1 Studienaufbau 25 3.2 Teilnehmercharakteristik 29 3.3 Antikörper-Bestimmung 31 3.4 Statistische Auswertung 33 3.5 Methodenkritik 35 4 Ergebnisse 37 4.1 Antikörperkonzentration bei Patienten und Kontrollen 37 4.2 ROC-Analyse 39 4.3 Grenzwerte 41 4.3.1 Firmengrenzwert 41 4.3.2 Eigener Grenzwert 42 4.3.3 Eigener Grenzwert für hohe Sensitivität 42 4.3.4 Eigener Grenzwert für hohe Spezifität 44 4.3.5 Ergebnisse der Tests in Kombination 44 4.4 Likelihood Ratios und Posttest-Wahrscheinlichkeit 46 4.5 Antikörperkonzentration und Marsh-Stadium 48 4.6 Altersabhängigkeit der Antikörperkonzentration 50 4.7 Antikörperkonzentration und Geschlecht 50 4.8 Wiederholbarkeit 53 4.9 Fallbetrachtungen 53 4.9.1 Antikörperkonzentration bei jungen Zöliakiepatienten 53 4.9.2 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen 54 4.9.3 Positive Biopsiebefunde in der Kontrollgruppe 55 4.9.4 Zöliakiepatient mit negativem Biopsiebefund 56 4.9.5 Patient mit selektivem IgA-Mangel 57 5 Diskussion 59 5.1 Vergleich der DGP-Tests untereinander 59 5.2 Vergleich der DGP-Tests mit Antikörper-Tests gegen natives Gliadin 60 5.3 Vergleich der DGP-Test mit Autoantikörper-Tests gegen tTG 61 5.4 Vorteile der kombinierten Antikörper-Tests 64 5.5 Testinterpretation 64 5.6 Wann kann auf die Biopsie verzichtet werden? 68 6 Zusammenfassung 71 Literaturverzeichnis 75 Tabellenverzeichnis 87 Abbildungsverzeichnis 88 Selbständigkeitserklärung 89 Lebenslauf 91 Publikationen 93 Dank 101

Die proliferative Enteropathie, verursacht durch das gram-negative Bakterium Lawsonia intracellularis, ist weltweit bei Schweinen als Durchfallerkrankung bekannt. Neben anderen Tierarten, unter anderem Hamster, Ratten, Schafe und Hunde, konnte diese Krankheit auch bei Fohlen im Alter zwischen zwei und neun Monaten nachgewiesen werden. Die Fallberichte stammen meist aus Nordamerika. Intra vitam gibt es neben der klinischen und labordiagnostischen Untersuchung weitere Nachweismöglichkeiten. Im Kot kann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) die L. intracellularis-DNA, im Serum mittels Immunoperoxidase Monolayer Assay (IPMA), Immunofluoreszenz-Antikörpertest (IFAT) oder blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) der L. intracellularis-Antikörper nachgewiesen werden. Diese vier Testsysteme sind bei Schweinen zur Herdendiagnostik etabliert. Während es diverse Studien zur Prävalenz von Antikörpern bei Schweinen in Deutschland gibt, wurde dies bei Pferden bislang nicht geklärt. Da es auch einen Fallbericht aus Deutschland gibt, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, wie viele Fohlen und Stuten aus verschiedenen Beständen und mit unterschiedlichem Vorbericht bzw. Gesundheitszustand seropositiv sind. Desweiteren sollte der Verlauf der Antikörper bei Stuten und ihren Fohlen nachverfolgt werden. Die serologische Untersuchung erfolgte mit Hilfe eines ELISAs. Dabei werden die Ergebnisse als Prozentsatz der Inhibition (PI) durch L. intracellularis-Antikörper angegeben. Ein PI – Wert über 30 wird als seropositiv gewertet. Für die erste Studie wurden 56 Fohlen, die mit unterschiedlichen Vorberichten in die Medizinische Tierklinik eingeliefert worden waren, sowie 24 gesunde Fohlen eines Haflingergestütes serologisch untersucht. Die zweite Studie war eine Verlaufsuntersuchung. In einem Haflingergestüt wurde der Antikörpernachweis bei 24 (2009) bzw. 16 (2010) Mutterstuten und ihren Fohlen in zwei aufeinanderfolgenden Jahren durchgeführt. In einem Warmblutgestüt wurden sechs Stuten und ihre Fohlen vor und nach der Abfohlung bzw. nach der Geburt monatlich getestet, bis alle Fohlen seronegativ waren. Es waren 39,3 % der in die Klinik eingelieferten Fohlen seropositiv. Signifikante Unterschiede zwischen gesunden Fohlen, Fohlen mit Diarrhoe, Fohlen mit Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes und anderen Erkrankungen wurden nicht beobachtet. Alle getesteten erwachsenen Stuten waren zu jedem Zeitpunkt seropositiv. Im Haflingergestüt hatten im ersten Jahr 29,2 % und im zweiten Jahr 25 % der Fohlen Antikörper gegen L. intracellularis. Die seropositiven Fohlen des zweiten Jahres hatten dieselben Mutterstuten wie die seropositiven Fohlen des ersten Jahres. Bei den Warmblütern hatten fünf von sechs Fohlen nach der Geburt L. intracellularis-Antikörper. Die PI – Werte sanken sowohl bei den Stuten als auch bei den Fohlen im Untersuchungszeitraum kontinuierlich ab. Ende Juli, im Alter zwischen 82 und 141 Tagen (Median 115 Tage), wurden die fünf anfangs seropositiven Fohlen zum ersten Mal seronegativ getestet. Alle Fohlen im Alter von weniger als 14 Tagen waren seropositiv. Es bestand eine negative Korrelation zwischen dem Alter der Fohlen und ihrem PI-Wert, die bei den Warmblütern signifikant war. Außerdem bestand eine signifikante, positive Korrelation zwischen dem PI – Wert der Mutterstute und dem ihres Fohlens. Die Untersuchungen zeigen, dass der Nachweis von Antikörpern im equinen Serum auch mittels eines ursprünglich für Schweineserum entwickelten ELISAs möglich ist. Prozentual haben in Mitteldeutschland ähnlich viele Fohlen positive Ergebnisse wie in Nordamerika. Beeinflusst wird der PI – Wert eines Fohlens durch die Mutterstute, deren PI – Wert und das Alter des Fohlens. Nach der Geburt sinkt die Anzahl der Antikörper bis zum Alter von drei bis vier Monaten. In diesem Alter werden auch die meisten Erkrankungen beschrieben. Man kann daraus schlussfolgern, dass das Bakterium L. intracellularis auch bei Pferden in Deutschland weit verbreitet ist. Antikörper bilden nicht nur erkrankte Fohlen aus, sondern auch gesunde Pferde und Pferde mit anderen Erkrankungen. Da Fohlen im Alter von 12 bis 20 Wochen keine Antikörper mehr haben, ist eine Impfung empfehlenswert.

Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.

Octapharma tillverkar Octagam, en lösning innehållande humant immunglobulin för intravenös administrering, vars huvudkomponent är immunglobulin G (IgG). Aggregerade IgG förknippas med aktivering av komplementsystemet i frånvaro av antigen. Denna ospecifika aktivering av komplement har tidigare rapporterats orsaka biverkningar hos patienter. För att undvika detta använder Octapharmas laboratorium för kvalitetskontroll en metod som kallas test av antikomplementär aktivitet, för kontroll av batcher av Octagam innan de släpps ut på marknaden. Denna metod har flera problem, t.ex. låg tillgänglighet av viktiga reagens. Syftet med detta projekt var därför att undersöka om en alternativ metod, CIC-C1q ELISA, kunde mäta aktiveringen av komplementsystemet på immunglobuliner genom att testa olika batcher av IgG och värmebehandlade IgG-prover för att bedöma om det fanns en korrelation mellan resultaten från de två metoderna. Resultaten visade att det inte fanns någon korrelation mellan ACA-testet och CIC-C1q ELISA. Varken normala IgG-batcher eller värmebehandlade prover uppvisade någon tydlig korrelation. Den enda fördelen som C1q kan ha är att den gav ett högt resultat för en batch som tidigare har rapporterats orsaka biverkningar hos patienter, medan svaret i ACA-testet var relativt normalt. CIC-C1q ELISA metoden har dock visat sig ha sina egna problem eftersom standardprover ger inkonsekventa värden och mer tester behöver utföras för att hitta spädnings-linjäritet. / Octapharma manufactures Octagam, a liquid preparation of highly purified human immunoglobulin for intravenous administration, the main component of which is immunoglobulin G (IgG). Aggregated IgG is associated with activation of the complement system in the absence of antigen. This non-specific activation of complement has been reported to cause adverse reactions in patients. To avoid this, Octapharma's quality control laboratory uses a method called the determination of anti-complementary activity (ACA) in Immunoglobulin, for control of all batches of Octagam before release. This method has several problems, such as low availability of critical reagents. Therefore, the aim of this project was to investigate whether an alternative method, CIC-C1q ELISA, could measure the activation of the complement system on immunoglobulins by testing different batches of IgG and heat-treated IgG samples to assess whether there is a correlation between the results of the two methods. The results showed that there was no correlation between the ACA test and the CIC-C1q ELISA. Neither normal IgG batches nor heat-treated samples showed a clear correlation. The only advantage the C1q may have is that it gives a high response for a batch that has been reported to cause adverse reactions in patients, while the response in the ACA test was relatively normal. If this can be demonstrated by testing similar batches, it may be beneficial to continue testing the C1q ELISA. However, this method has also been shown to have its own problems, such as the standard sample giving inconsistent values, and more work is needed to find the linearity of the dilution.

Neuroborrelios (NB) kan förekomma när Borrelia garinii, som är en del av artkomplexet Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l), infekterar nervsystemet. När immuncellerna utsätts för borreliaantigen bildas antikroppar i plasma och intratekalt. NB ger även upphov till mononukleär pleocytos i cerebrospinalvätska (CSV). Neurologiska symptom, pleocytos och antikroppsindex (AI), som indikerar intratekal syntes av borreliaantikroppar, vägleder nuvarande NB-diagnostik på Klinisk Mikrobiologi i Kalmar. Diagnostiken försvåras vid tidig NB när AI är negativ och pleocytos positiv. För att komplettera tidig NB-diagnostik kan kemokinet C-X-C motif ligand 13 (CXCL13) mätas i CSV. I nuläget utförs CXCL13 enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) på ett externt laboratorium. Mätning av CXCL13 kan även utföras med en snabb semi-kvantitativ ReaScan+ CXCL13 metod som bygger på lateral flödesimmunanalys (LFIA). Syftet var att verifiera ReaScan+ CXCL13, kontrollera linjäritet, CXCL13 stabilitet och bestämma diagnostisk specificitet och sensitivitet. CSV-proverna indelades i fyra grupper baserat på pleocytos och AI samt tre kategorier utifrån kriterier till NB-diagnos (n=31). Metodjämförelsen genomfördes mellan ReaScan+ LFIA och CXCL13 ELISA (n=25). Linjäritetsanalys utfördes på prov med hög CXCL13-koncentration i CSV och CXCL13-stabiliteten kontrollerades på två patientprover vid frys- och kylförvaring. Beräkning av sensitivitet och specificitet baserades på definitiv (n=20) och ej NB (n=5). Metodjämförelsen visade en fullständig överensstämmelse och Spearman´s korrelationskoefficienten var 0,949. Determinationskoefficienten för linjäritetsanalysen var 0,963. Diagnostisk sensitivitet var 80% och specificitet 100%. Hög prestanda, acceptabla stabilitets- och linjäritetsresultat samt ReaScan+ potentiella förmågan att särskilja mellan definitiv och ej NB, indikerar att metoden kan införas på Klinisk Mikrobiologi i Kalmar och komplettera nuvarande diagnostik av tidig NB. / Lyme neuroborreliosis (LNB) occurs when Borrelia garinii, part of the Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l) species complex, infects the nervous system. Upon exposure, immune cells produce antibodies that can be measured in serum or cerebrospinal fluid (CSF). LNB also cause mononuclear pleocytosis in CSF. Neurological symptoms, pleocytosis and antibody index (AI), which indicate intrathecal synthesis of Borrelia antibodies, guide current diagnosis of LNB at the Clinical Microbiology in Kalmar. The diagnosis is complex in early LNB, especially when AI is negative and pleocytosis is positive. Expression of chemokine C-X-C motif ligand 13 (CXCL13) in CSF can be used as an additional marker to early LNB. Analysis is currently performed at an external laboratory using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The aim of this project was to evaluate the performance of the rapid semi-quantitative lateral flow immunoassay (LFIA) ReaScan+ CXCL13 test using 31 patient samples divided into four groups based on pleocytosis and AI. Linearity assay was performed on samples with high CXCL13 concentrations and stability was tested on two CSF samples after freezing and refrigeration. Estimation of sensitivity and specificity was based on definite (n=20) and non-LNB (n=5). Method comparison showed a complete agreement and Spearman's correlation coefficient was 0,949. The R2 for linearity was 0,963. Sensitivity was 80% and specificity 100%. Strong agreement, acceptable stability and linearity results as well as ReaScan+ potential ability to distinguish between definite and non-NB, indicate that the method can be introduced at Clinical Microbiology in Kalmar and used as a supplement in early LNB diagnostics.

Master of Science / Department of Clinical Sciences / James D. Lillich / Objective: To assess the in vitro ability of a novel lipopolysaccharide binding compound (EVK063) to inhibit cytokine production in lipopolysaccharide-stimulated equine peripheral blood mononuclear cells Animals: Eight healthy horses were sources for mononuclear cells. Procedures: Replicate aliquots (concentrated at 4-5 million cells/mL) were stimulated with S. typhimurium lipopolysaccharide (LPS) (100ng/mL), treated with graded concentrations of EVK063, (0.01µM, 0.1µM, 1µM, 10µM), Polymyxin B (PMB) (10µM) and incubated at 37°C for 6 hours. Media and cell samples were collected and stored at -80°C for evaluation of Tumor necrosis factor (TNF) using an equine specific ELISA and Interleukin-6 (IL6) via qRT-PCR. NanoDrop confirmed RNA quantity and primer sets designed for equine IL6 and the housekeeping gene 18s were used. EVK063 toxicity was evaluated with propidium iodide staining as determined by flow cytometry. Data was normalized, expressed as percent inhibition of cytokine up-regulation by LPS, and statistically evaluated by analysis of variance. Statistical significance was set at P ≤ 0.05. Results: Samples incubated in media with 0% serum demonstrated the following results: 0.01µM and 0.1µM EVK063 maintained >90% cellular viability yet failed to significantly inhibit TNF production or IL6 expression. The 1µM and 10µM EVK063 concentrations exhibited 25% and 70% cell death respectfully and therefore an interpretation as to their efficacy to inhibit TNF production or IL6 expression could not be made. Samples incubated in media with 10% serum demonstrated the following results: 0.01µM, 0.1µM and 1µM concentrations of EVK063 maintained >90% cellular viability yet failed to inhibit TNF production or IL6 expression. The 10µM EVK063 concentration exhibited 35% cell death and therefore an interpretation as to the efficacy to inhibit TNF production or IL6 expression could not be made. In a whole blood preparation, all samples evaluated maintained >90% cellular viability. The 10µM EVK063 significantly reduced TNF production and IL6 expression. Conclusion: This in vitro study confirms the ability of EVK063 to inhibit TNF production and IL6 expression in LPS stimulated equine mononuclear cells with comparable results to PMB.

Circadian rhythm is a biological rhythm with period of about 24 hours. Circadian rhythm is universal in phyla from bacteria to mammals and exists in different level from gene expression to behavior. Circadian system consists of three components: 1) a self-sustained oscillator; 2) an input pathway which can alter the phase of the oscillator; and 3) an output such as gene expression, enzyme activity, hormone production, heart rate, body temperature or locomotor activities. The way the oscillator regulates its outputs is complicated, in that on one hand usually the oscillator is not the only factor affecting the outputs, and on the other, the oscillator itself is incorporated in intricate pathways. Chicken pineal cell culture is a well-established in vitro model to study circadian rhythm. It contains a self-sustained oscillator which can be phase-shifted by light as input and rhythmically releases melatonin as an output. Here I have characterized the role of norepinephrine (NE), the sympathetic regulatory input of pineal gland, and the microenvironment of pineal cells in melatonin rhythmicity of cultured chicken pineal cells. Chapter 1 of this dissertation provides a review of circadian rhythm with a focus on melatonin regulation in pineal gland. Chapter 2 describes the methods to build up a fraction collector which offers high time resolution of sampling for a superfusion system. Chapter 3 is a technical report of a melatonin enzyme-linked immunosorbent assay suitable for high throughput measurement of melatonin. Chapter 4 presents data demonstrating that daily administration of NE recovers damped melatonin rhythm in constant darkness. In addition, NE does not change the expression of clock genes but the recovery effect of NE depends on the internal clock. Furthermore, the data indicates that NE administration stimulates the gene expression of phosphodiesterase 4D (PDE4D) and adenylate cyclase 1 (AC1) in a time order, potentially corresponding to the trough and peak of recovered melatonin rhythm. Chapter 5 presents data showing that the amplitude of melatonin rhythm in cultured pineal cells is affected by microenvironments of the cell culture and connexin plays a role in this effect. Finally, in Chapter 6 I discuss how the results of each chapter demonstrate multiple regulatory mechanism of the melatonin rhythm of chicken pineal cells. Furthermore, I discuss the implications of this work in the field of developmental biology and how the current data will shape future investigations. My dissertation incorporates engineering, immunocytochemistry, chicken genetics, and biochemical analyses, and will help in better understanding the regulation mechanism of output in a circadian system.