A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S3A22 e S3A23), e da cultivar BR-2(S3B63 e, apenas na cultura de anteras, S3B61), bem como da cultivar MN-599 (nãoselecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S3A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S3B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2o dia de cultivo in vitro) até o final (34o dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3o dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4o dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8o dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14o ao 20o dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22o dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18o dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S3A22 e S3A23, do que na cultivar MN-599. / The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained from single anthers established in vitro is evaluated. The present work pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green plant regeneration (strains S3A22 and S3A23 selected from cultivar A-05) or worse response to induction and better to green plant regeneration (S3B63 and S3B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA, dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3mm thick sections. For the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other from the middle and another from the top of each just collected spike. After the low temperature (5 oC) pretreatment, but before in vitro culture, three anthers (from the opposite row of each spike) were fixed . These two samples were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture, three anthers were fixed – until the 18th day. Anthers and multicellular structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in their initial production of embryogenic structures, but the total, final production did not differ. But differences were observed between cultivar MN- 599 and strain S3A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well differentiated embryos, but embryos of strain S3A22, besides in smaller number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically analyzed samples of strain S3B63. However, considering that another sample of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after 34 days in culture. One should emphasize that significant differences were found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation. These results indicate that selection was more efficient for the plant regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first sample of histological analyses (2nd day of in vitro culture) until the last one (34th day in culture), microspores were always present; the same was observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated grains were observed, in culture, from the 3rd day on. Multicellular were present in vitro culture from the 4th day on. Multicellular structures were first observed at 8th day. Multicellular structures varied in number and size at different samples of histological analysis, reaching the largest size from the 14th to the 20th day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses. From the 22nd day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the 18th day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed. The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem; 3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The largest class was that of amorphous structures, when compared with the remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain S3A22 and S3A23; however these strains produced embryos earlier than the cultivar.

Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo. Instituto de Biociencias / Não possui conteúdo digital / Made available in DSpace on 2013-12-05T20:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1989

A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S3A22 e S3A23), e da cultivar BR-2(S3B63 e, apenas na cultura de anteras, S3B61), bem como da cultivar MN-599 (nãoselecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S3A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S3B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2o dia de cultivo in vitro) até o final (34o dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3o dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4o dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8o dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14o ao 20o dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22o dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18o dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S3A22 e S3A23, do que na cultivar MN-599. / The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained from single anthers established in vitro is evaluated. The present work pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green plant regeneration (strains S3A22 and S3A23 selected from cultivar A-05) or worse response to induction and better to green plant regeneration (S3B63 and S3B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA, dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3mm thick sections. For the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other from the middle and another from the top of each just collected spike. After the low temperature (5 oC) pretreatment, but before in vitro culture, three anthers (from the opposite row of each spike) were fixed . These two samples were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture, three anthers were fixed – until the 18th day. Anthers and multicellular structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in their initial production of embryogenic structures, but the total, final production did not differ. But differences were observed between cultivar MN- 599 and strain S3A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well differentiated embryos, but embryos of strain S3A22, besides in smaller number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically analyzed samples of strain S3B63. However, considering that another sample of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after 34 days in culture. One should emphasize that significant differences were found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation. These results indicate that selection was more efficient for the plant regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first sample of histological analyses (2nd day of in vitro culture) until the last one (34th day in culture), microspores were always present; the same was observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated grains were observed, in culture, from the 3rd day on. Multicellular were present in vitro culture from the 4th day on. Multicellular structures were first observed at 8th day. Multicellular structures varied in number and size at different samples of histological analysis, reaching the largest size from the 14th to the 20th day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses. From the 22nd day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the 18th day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed. The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem; 3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The largest class was that of amorphous structures, when compared with the remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain S3A22 and S3A23; however these strains produced embryos earlier than the cultivar.

A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S3A22 e S3A23), e da cultivar BR-2(S3B63 e, apenas na cultura de anteras, S3B61), bem como da cultivar MN-599 (nãoselecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S3A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S3B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2o dia de cultivo in vitro) até o final (34o dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3o dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4o dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8o dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14o ao 20o dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22o dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18o dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S3A22 e S3A23, do que na cultivar MN-599. / The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained from single anthers established in vitro is evaluated. The present work pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green plant regeneration (strains S3A22 and S3A23 selected from cultivar A-05) or worse response to induction and better to green plant regeneration (S3B63 and S3B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA, dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3mm thick sections. For the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other from the middle and another from the top of each just collected spike. After the low temperature (5 oC) pretreatment, but before in vitro culture, three anthers (from the opposite row of each spike) were fixed . These two samples were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture, three anthers were fixed – until the 18th day. Anthers and multicellular structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in their initial production of embryogenic structures, but the total, final production did not differ. But differences were observed between cultivar MN- 599 and strain S3A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well differentiated embryos, but embryos of strain S3A22, besides in smaller number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically analyzed samples of strain S3B63. However, considering that another sample of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after 34 days in culture. One should emphasize that significant differences were found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation. These results indicate that selection was more efficient for the plant regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first sample of histological analyses (2nd day of in vitro culture) until the last one (34th day in culture), microspores were always present; the same was observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated grains were observed, in culture, from the 3rd day on. Multicellular were present in vitro culture from the 4th day on. Multicellular structures were first observed at 8th day. Multicellular structures varied in number and size at different samples of histological analysis, reaching the largest size from the 14th to the 20th day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses. From the 22nd day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the 18th day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed. The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem; 3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The largest class was that of amorphous structures, when compared with the remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain S3A22 and S3A23; however these strains produced embryos earlier than the cultivar.

Sementes de llex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) necessitam, "in situ", de um longo período para germinar - 6 a 8 meses - e a percentagem de germinação é muito baixa. Quando os embriões são excisados e cultivados "in vitro", a embriogênese pode completar-se em duas semanas. As causas quanto a esses aspectos do desenvolvimento embrionário tardio ainda não estão bem esclarecidas. A interrupção da embriogênese "in vivo" deve-se, provavelmente, à imaturidade do embrião. O baixo índice germinativo pode estar sendo causado por degeneração prematura do suspensor, em alguma das fases desse desenvolvimento. Visando contribuir para a elucidação desse problema, foram fe itos estudos morfoanatômicos - tanto em material fresco como em material fixado - nas diversas fases do desenvolvimento embrionário, em pirenos de l/ex paraguariensis , cultivados a campo durante doze meses. Lotes foram coletados em intervalos de aproximadamente vinte dias e analisados, permitindo a constatação de mudanças estruturais tais como, formação de cotilédones, aumento gradativo do eixo embrionário, diferenciação de tecidos e espessamento helicoidal de elementos de condução. Pôde-se observar, particularmente, a presença do suspensor, órgão identificável em estrutura embrionária, durante as diversas fases da embriogênese, em estágio inicial, como também em estágios mais avançados do desenvolvimento. Testes histoquímicos permitiram verificar a natureza lipoprotéica das reservas do endosperma. Estas reservas, em estágios mais avançados de desenvolvimento embrionário, apresentam-se modificadas, na região próxima ao embrião, mostrando a ocorrência de utilização das mesmas. / The seeds of l/ex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) take a long time to germinate - 6 to 8 months - and a high percentage of them fail to develop. When the embryos are excised and cultured "in vitro", embryogenesis may be completed in two weeks. The reasons for this late embryonic development are not quite clear. The interruption of "in vivo" embryogenesis is probably due to embryo imaturity. The low rate of germination is possibly a result of early degeneration of the suspensor during some stage of development. In order to elucidate this problem, morphoanatomical studies were carried out using both fresh and fixed material taken at different stages of embryonic development. l/ex paraguariensis pyrenes were cultivated under field conditions over twelve months. Samples were collectet and analysed at 20 days intervals. Thus, structural changes could be observed, such as the formation of cotyledons, the gradual growth of the embryo axis, tissue differentiation and helicoidal thickening in conduction elements. The suspensor could be found in the embryonary structure during the various stages of embryogenesis ranging from initial to advanced. Histochemical tests demonstrated the lipoproteic nature of the endosperm reserves. In advanced stages of embryogeny, these reserves are modified near the embryo, showing that they are in fact being used.

Sementes de llex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) necessitam, "in situ", de um longo período para germinar - 6 a 8 meses - e a percentagem de germinação é muito baixa. Quando os embriões são excisados e cultivados "in vitro", a embriogênese pode completar-se em duas semanas. As causas quanto a esses aspectos do desenvolvimento embrionário tardio ainda não estão bem esclarecidas. A interrupção da embriogênese "in vivo" deve-se, provavelmente, à imaturidade do embrião. O baixo índice germinativo pode estar sendo causado por degeneração prematura do suspensor, em alguma das fases desse desenvolvimento. Visando contribuir para a elucidação desse problema, foram fe itos estudos morfoanatômicos - tanto em material fresco como em material fixado - nas diversas fases do desenvolvimento embrionário, em pirenos de l/ex paraguariensis , cultivados a campo durante doze meses. Lotes foram coletados em intervalos de aproximadamente vinte dias e analisados, permitindo a constatação de mudanças estruturais tais como, formação de cotilédones, aumento gradativo do eixo embrionário, diferenciação de tecidos e espessamento helicoidal de elementos de condução. Pôde-se observar, particularmente, a presença do suspensor, órgão identificável em estrutura embrionária, durante as diversas fases da embriogênese, em estágio inicial, como também em estágios mais avançados do desenvolvimento. Testes histoquímicos permitiram verificar a natureza lipoprotéica das reservas do endosperma. Estas reservas, em estágios mais avançados de desenvolvimento embrionário, apresentam-se modificadas, na região próxima ao embrião, mostrando a ocorrência de utilização das mesmas. / The seeds of l/ex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) take a long time to germinate - 6 to 8 months - and a high percentage of them fail to develop. When the embryos are excised and cultured "in vitro", embryogenesis may be completed in two weeks. The reasons for this late embryonic development are not quite clear. The interruption of "in vivo" embryogenesis is probably due to embryo imaturity. The low rate of germination is possibly a result of early degeneration of the suspensor during some stage of development. In order to elucidate this problem, morphoanatomical studies were carried out using both fresh and fixed material taken at different stages of embryonic development. l/ex paraguariensis pyrenes were cultivated under field conditions over twelve months. Samples were collectet and analysed at 20 days intervals. Thus, structural changes could be observed, such as the formation of cotyledons, the gradual growth of the embryo axis, tissue differentiation and helicoidal thickening in conduction elements. The suspensor could be found in the embryonary structure during the various stages of embryogenesis ranging from initial to advanced. Histochemical tests demonstrated the lipoproteic nature of the endosperm reserves. In advanced stages of embryogeny, these reserves are modified near the embryo, showing that they are in fact being used.

Sementes de llex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) necessitam, "in situ", de um longo período para germinar - 6 a 8 meses - e a percentagem de germinação é muito baixa. Quando os embriões são excisados e cultivados "in vitro", a embriogênese pode completar-se em duas semanas. As causas quanto a esses aspectos do desenvolvimento embrionário tardio ainda não estão bem esclarecidas. A interrupção da embriogênese "in vivo" deve-se, provavelmente, à imaturidade do embrião. O baixo índice germinativo pode estar sendo causado por degeneração prematura do suspensor, em alguma das fases desse desenvolvimento. Visando contribuir para a elucidação desse problema, foram fe itos estudos morfoanatômicos - tanto em material fresco como em material fixado - nas diversas fases do desenvolvimento embrionário, em pirenos de l/ex paraguariensis , cultivados a campo durante doze meses. Lotes foram coletados em intervalos de aproximadamente vinte dias e analisados, permitindo a constatação de mudanças estruturais tais como, formação de cotilédones, aumento gradativo do eixo embrionário, diferenciação de tecidos e espessamento helicoidal de elementos de condução. Pôde-se observar, particularmente, a presença do suspensor, órgão identificável em estrutura embrionária, durante as diversas fases da embriogênese, em estágio inicial, como também em estágios mais avançados do desenvolvimento. Testes histoquímicos permitiram verificar a natureza lipoprotéica das reservas do endosperma. Estas reservas, em estágios mais avançados de desenvolvimento embrionário, apresentam-se modificadas, na região próxima ao embrião, mostrando a ocorrência de utilização das mesmas. / The seeds of l/ex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) take a long time to germinate - 6 to 8 months - and a high percentage of them fail to develop. When the embryos are excised and cultured "in vitro", embryogenesis may be completed in two weeks. The reasons for this late embryonic development are not quite clear. The interruption of "in vivo" embryogenesis is probably due to embryo imaturity. The low rate of germination is possibly a result of early degeneration of the suspensor during some stage of development. In order to elucidate this problem, morphoanatomical studies were carried out using both fresh and fixed material taken at different stages of embryonic development. l/ex paraguariensis pyrenes were cultivated under field conditions over twelve months. Samples were collectet and analysed at 20 days intervals. Thus, structural changes could be observed, such as the formation of cotyledons, the gradual growth of the embryo axis, tissue differentiation and helicoidal thickening in conduction elements. The suspensor could be found in the embryonary structure during the various stages of embryogenesis ranging from initial to advanced. Histochemical tests demonstrated the lipoproteic nature of the endosperm reserves. In advanced stages of embryogeny, these reserves are modified near the embryo, showing that they are in fact being used.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289231.pdf: 1620951 bytes, checksum: a62aeadc4a1209d35b1bcc351a80279f (MD5) / A Acca sellowiana (O. Berg.) Burret é uma espécie pertencente à família Myrtaceae, conhecida popularmente como goiabeira serrana. Uma série de trabalhos multidisciplinares envolvendo a domesticação da goiabeira serrana, com ênfase na área de melhoramento genético e da aplicação das técnicas de cultura vegetal para a micropropagação desta espécie têm sido realizados por diferentes grupos de pesquisa. Estudos morfofisiológicos com o auxilio das técnicas de cultura vegetais, notadamente a embriogênese somática, permitem a propagação massal clonal de genótipos superiores, além de servir como modelo de estudos fisiológicos, genéticos e bioquímicos do desenvolvimento embrionário. A embriogênese somática é uma dos principais sistemas de regeneração de plântulas in vitro, pois permite a redução de custos associados a um maior rendimento biológico em comparação aos demais sistemas de micropropagação. A técnica da embriogênese somática em Acca sellowiana tem sido estudada desde 1997 no Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal do CCA/UFSC e vários pontos de controle do protocolo foram otimizados, sendo possível alcançar um rendimento de mais de mil embriões somáticos por explante. Entretanto, a técnica ainda precisa ser aprimorada, podendo ser associada a outras técnicas como a imersão temporária para a conversão dos embriões somáticos. Desta forma, o presente estudo busca elucidar pontos de controle durante a indução e conversão de embriões somáticos de Acca sellowiana. Este trabalho foi redigido em forma de capítulos visando a melhor compreensão dos dados. O primeiro capítulo esta relacionado a uma revisão bibliográfica sobre os aspectos da embriogênese somática com ênfase em Acca sellowiana. O segundo capítulo aborda a influência do 2,4-D na embriogênese somática desta espécie e como este fitorregulador afeta a conversão dos embriões somáticos. Aspectos bioquímicos relacionados com os teores de ABA, AIA, poliaminas e aminoácidos também foram analisados para uma maior elucidação do processo. O terceiro capítulo aborda a conversão dos embriões somáticos em plântulas em resposta ao uso de biorreatores de imersão temporária e do Fluridone, um inibidor da síntese de ABA.

Butia odorata (Barb. Rodr.) Noblick, é nativa da região Sul do Brasil e Sudeste do Uruguai. As áreas de butiazais do Rio Grande do Sul, formadas por B. odorata, vêm sofrendo redução devido à expansão agrícola e urbana. Além disso, a espécie apresenta dificuldades para germinar causando entraves na produção de mudas e assim a produção se torna extrativista, o que reduz a renovação dos butiazais. A embriogênese somática (ES) é uma alternativa para multiplicação in vitro de B. odorata. Análises anatômicas e o uso de marcadores moleculares podem contribuir para a determinação do processo da ES. O presente trabalho teve por objetivo principal propor uma metodologia para obtenção de embriões somáticos in vitro da espécie a partir de diferentes explantes. Para isso foram avaliados os efeitos das auxinas 2,4-D e picloram e a influência dos meios de cultura MS e Y3 sobre embriões zigóticos maduros. A técnica Thin Cell Layer (TCL) foi testada como fonte alternativa de explante para indução da ES em B. odorata. Para uma melhor compreensão das mudanças morfológicas e celulares foi realizado um estudo histo-anatômico mais detalhado das fases durante a ES. Para verificar a expressão do gene SERK foi isolado, clonado e sequenciado um gene candidato a partir de calos embriogênicos de B. odorata. 9Continua) Os resultados apresentaram uma resposta heterogênea produzindo calos embriogênicos e embriões somáticos em ambos os meios combinados com diferentes concentrações das auxinas. Dentre os resultados obtidos para TCL destacam-se o meio de cultura Y3 com a auxina picloram, nas concentrações de 452,49; 542,99 e 633,48 μM/L, induzindo a formação de calos embriogênicos e embriões somáticos. A análise histo-anatômica permitiu verificar os principais eventos celulares ocorridos durante a ES, como a presença de centros meristemáticos, proembriões, embriões globulares e grãos de amido como fonte de reserva em embriões somáticos. A obtenção de uma sequência parcial do gene SERK em butiá, além de confirmar a indução da ES, pode ser usada, juntamente com as análises anatômicas, como marcador molecular específico para ES. A metodologia proposta apresenta resultados promissores até a fase de diferenciação dos embriões somáticos globulares e alguns mais desenvolvidos, contudo a conversão desses em plântulas não foi completa. / Butia odorata (Barb. Rodr.) Noblick, is native to Southern Brazil and Southeastern Uruguay. Butiazais areas of Rio Grande do Sul, formed by B. odorata, have been reduced due to the agricultural and urban expansion. In addition, the species presents difficulties to germinate causing obstacles in seedlings production and thus the production becomes extractive, what reduces the renewal of butiazais. Somatic embryogenesis (ES) is an alternative to in vitro multiplication of B. odorata. Anatomical analysis and the use of molecular markers may contribute to the determination of the ES process. The present work had as main objective to propose a methodology for obtaining of somatic embryos in vitro of the different explants from species. The effects of 2,4-D auxins and picloram and the influence of MS and Y3 culture media on mature zygotic embryos were evaluated. The Thin Cell Layer (TCL) technique was tested as an alternative explant source for ES induction in B. odorata. For a better understanding of the morphological and cellular changes, a more detailed histo-anatomical study of the phases during ES was performed. To verify the expression of the SERK gene, a candidate gene was isolated, cloned and sequenced from B. odorata embryogenic calli. The results showed a heterogeneous response producing embryogenic calli and somatic embryos in both media combined with different concentrations of auxin. Among the results obtained for TCL include Y3 culture medium with auxin picloram, in concentrations of 452,49; 542,99 and 633,48 μM/L, inducing the formation of embryogenic calli and somatic embryos. Histo-anatomical analysis has shown the main cellular events that occurred during ES, as the presence of meristematic centers, proembryos, globular embryos and starch grains as a reserve source in somatic embryos. Obtaining a partial sequence of the SERK gene in pindo palm, in addition to confirm ES induction, it can be used, along with the anatomical analysis, such as molecular marker specific for ES. The proposed methodology presents promising results until the differentiation phase of the globular somatic embryos and some more developed, however the conversion of these in seedlings was not complete.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2012-10-24T18:52:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 266463.pdf: 1340728 bytes, checksum: e843f8959b1ec2611e3a974c8e6381bf (MD5) / A pupunha (Bactris gasipaes Kunth - Arecacea) é uma palmeira domesticada, nativa do trópico úmido americano. Nos últimos anos, o cultivo da pupunheira para a produção de palmito vem despertando o interesse de agricultores de todo o País. Esse interesse é devido, principalmente, à busca de novas opções de cultivo em substituição aos tradicionais, já que para atender a alta demanda comercial, a exploração predatória provocou uma grande devastação das palmeiras nativas da Mata Atlântica. A embriogênese dessa espécie foi alvo do presente estudo no qual foram estudados eventos moleculares, celulares, fisiológicos e do desenvolvimento ao longo deste processo morfogenético tanto in vitro quanto in vivo. A embriogênese somática pode ser empregada para a propagação massal clonal de genótipos de interesse e para o avanço na compreensão de fatores fisiológicos, genéticos e bioquímicos envolvidos no desenvolvimento do embrião. Ferramentas biotecnológicas podem ser empregadas nesta espécie para a sua conservação e propagação massal. No presente trabalho eventos e processos bioquímicos e fisiológicos em calos embriogênicos e não embriogenicos foram estudados para fundamentar o estabelecimento de protocolos regenerativos baseados na embriogênese somática. Teores endógenos de acido indolacético (AIA), ácido abscísico (ABA), poliaminas (PAs), aminoácidos e fenóis totais foram analisados. Aminoácidos, PAs, AIA e ABA foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência e fenóis totais a partir da leitura das absorbâncias em espectrofotômetro. Outro foco do estudo foi investigar e caracterizar mudanças no perfil das proteínas expressas durante o desenvolvimento da embriogênese somática, endosperma e embriões zigóticos de pupunha. Para isto, estágios da embriogênese somática, calos embriogênicos e não embriogênicos, bem como embriões zigóticos e endosperma foram caracterizados por eletroforese bidimensional (2-DE). Nas análises bioquímicas foram detectadas diferenças entre calos embriogênicos e não embriogênicos para AIA, ABA, PAs, aminoácidos e fenóis totais. Para AIA e ABA calos embriogênicos apresentaram níveis mais altos, estando estes associados à indução e aumento da competência embriogênica. Já para PAs e fenóis totais, calos não embriogenicos apresentaram níveis mais elevados, especialmente para poliamina putrecina. Alguns aminoácidos tiveram suas expressões envolvidas com a competência ou não dos calos. Os altos níveis de triptofano observados em calos embriogênicos podem estar associados a uma maior síntese de AIA nos mesmos. Para proteômica, durante a embriogênese somática (0, 15, 30 e 60 dias) observou-se um aumento tanto na concentração de proteínas totais quanto no número de spots entre 0 dias (15,68µg/g de MF) e 15 dias (38,5 µg/g de MF), ficando constante entre 15 e 30 dias com uma subseqüente diminuição entre 30 e 60 dias (22,36 µg/g de MF). Algumas proteínas foram exclusivas dos estádios de 15 e 30 dias podendo ser biomarcadoras da embriogenese somática. Em calos embriogênicos e não embriogênicos houve uma maior expressão de proteínas em calos embriogênicos, observando-se 71 spots exclusivos desses calos, 11 de calos não embriogênicos e 128 spots constantes, sendo que alguns deles apresentaram diferença na sua expressão. Perfis protéicos de embrião zigótico e endosperma também revelaram um maior número de proteínas expressas em embriões zigóticos, verificando-se 118 spots exclusivos de embriões zigoticos, 58 spots constantes e 10 spots exclusivos do endosperma.