Spelling suggestions: "subject:"bacteriologia molecular""
1 |
Identificação de mecanismos reguladores RALDH2 durante a padronização dorso-ventral da medula espinhal. / Identification of RALDH2 regulatory mechanisms during the spinal cord dorsal-ventral patterning.Castillo, Hozana Andrade 24 November 2010 (has links)
A sinalização pelo ácido retinóico (AR) é fundamental para o correto desenvolvimento embrionário. A principal enzima responsável pela síntese do AR durante o desenvolvimento é a Raldh2 (Aldh1a2), cujo padrão de expressão é bastante dinâmico. Apesar dos padrões de expressão da raldh2 e seus papéis durante o desenvolvimento já estarem bem estabelecidos, pouco se conhece sobre sua regulação. Estudos de bioinformática identificaram no gene raldh2 um elemento não-codante conservado (CNE), presente de anfíbios até humanos, denominado Raldh2.2. Utilizando ensaios de eletroporação e análise de camundongos transgênicos, nós mostramos que o CNE Raldh2.2 é um enhancer responsável por ativar a expressão da raldh2 na medula espinhal dorsal de tetrápodes e que seu padrão de atividade coincide em aves e camundongos. Através de ensaios de deleções e mutações sítio-direcionadas desse enhancer, identificamos quatro elementos cis regulatórios responsáveis por ativá-lo na placa do teto e em interneurônios dorsais da medula espinhal. A regulação positiva da atividade desse enhancer ocorre de maneira redundante por três sítios Tcf-homeobox, enquanto sua inibição nos interneurônios ventrais da medula espinhal se dá por dois sítos repressores, um Lim-homeodomínio e um Tgif. Neste trabalho, utilizando hibridação in situ dupla para raldh2 e math1/cath1, descrevemos um novo território transiente de expressão da raldh2, os interneurônios dorsais 1. Esses interneurônios dão origem a circuitos ascendentes e a interneurônios comissurais intraespinhais, sugerindo papéis para a sinalização pelo ácido retinóico na ontogenia dos circuitos proprioceptivos espinocerebelar e intraespinhal. / Retinoic acid (RA) signaling is crucial for correct embryonic development. Raldh2 is the major enzyme involved in retinoic acid synthesis during early development and its expression pattern is dynamic. Raldh2 expression patterns and its roles during development are well known, but little is known about its regulation. Bioinformatic analysis identified a conserved non-coding element (CNE) in the raldh2 gene conserved from amphibians to humans, called Raldh2. Using electroporation assays and transgenic mice analysis we showed that CNE Raldh2.2 is an enhancer that activates raldh2 in the dorsal spinal cord in tetrapods and that its activity pattern is the same in chicken and mice. Using deletions assays and site-directed mutagenesis, we identified four cis regulatory elements that activate this enhancer in the roof plate and dorsal interneurons of the spinal cord. This enhancer is activated by a redundant mechanism through three predicted Tcf-homeobox biding sites and it is repressed in ventral interneurons via two repressors sites, a Lim-homeodomain and a Tgif. In this thesis, using in situ hybridization, we described a new transient territory of raldh2 expression, the dorsal interneurons 1. These interneurons give rise to ascending circuits and intraspinal commissural interneurons, suggesting roles for retinoic acid signaling in the ontogeny of spinocerebellar and intraspinal proprioceptive circuits.
|
2 |
Controle da expressão do gene ALDH1A2 (RALDH2) durante o desenvolvimento: uma abordagem filogenética. / Search for regulatory elements in the ALDH1A2 (RALDH2) gene during development: a philogenetic approach.Cravo, Roberta Mascioli 26 September 2008 (has links)
O ácido retinóico (AR) é essencial para a embriogênese. A principal enzima sintetizadora de AR durante o desenvolvimento é a ALDH1A2 (RALDH2), uma retinaldeído desidrogenase que converte retinaldeído a AR. Para entendermos como o gene da aldh1a2 é regulado identificamos regiões evolutivamente conservadas (ECRs) em vertebrados e testamos seu potencial regulatório. Identificamos uma ECR localizada no intron1 da aldh1a2, conservada em anfíbios, aves e mamíferos que atua como um enhancer em estruturas derivadas de ectoderme, endoderme e mesoderme. Animais transgênicos transientes e permanentes mostram a ativação desse enhancer na região da placa do teto do tubo neural e epicárdio, local onde esse enhancer é ativado em células derivadas do órgão pro-epicárdico após o contato e/ou proximidade com células do miocárdio. A identificação de um enhancer conservado no gene da aldh1a2 suporta a idéia de que esse gene possui uma regulação modular e mostra que a abordagem evolutiva é uma eficiente ferramenta para a identificação de mecanismos de controle desse gene. / Retinoic acid (RA) is essential for embryogenesis. The key RA synthetic enzyme during early development is ALDH1A2 (RALDH2), a retinaldehyde dehydrogenase that converts retinaldehyde into RA. To understand how aldh1a2 is regulated we screened the gene for evolutionary conserved regions (ECRs) among vertebrates and assayed their regulatory potential. We describe an aldh1a2 intron 1 ECR (identified as RALDH2.2) that is conserved in amphibians, avians and humans and acts as an enhancer in derivatives of ectoderm, endoderm and mesoderm. Transient and stable transgenesis in mice reveal strong activity of the raldh2 intron 1 enhancer at the roof plate of the neural tube and at the growing epicardium. Transgenic mice indicate that the enhancer is activated in proepicardium-derived cells by contact and/or close proximity to the myocardium. The identification of an aldh1a2 conserved enhancer supports the idea of a modular regulation and shows that the evolutionary approach is an efficient tool to identify control mechanisms of the aldh1a2 gene.
|
3 |
Controle da expressão do gene ALDH1A2 (RALDH2) durante o desenvolvimento: uma abordagem filogenética. / Search for regulatory elements in the ALDH1A2 (RALDH2) gene during development: a philogenetic approach.Roberta Mascioli Cravo 26 September 2008 (has links)
O ácido retinóico (AR) é essencial para a embriogênese. A principal enzima sintetizadora de AR durante o desenvolvimento é a ALDH1A2 (RALDH2), uma retinaldeído desidrogenase que converte retinaldeído a AR. Para entendermos como o gene da aldh1a2 é regulado identificamos regiões evolutivamente conservadas (ECRs) em vertebrados e testamos seu potencial regulatório. Identificamos uma ECR localizada no intron1 da aldh1a2, conservada em anfíbios, aves e mamíferos que atua como um enhancer em estruturas derivadas de ectoderme, endoderme e mesoderme. Animais transgênicos transientes e permanentes mostram a ativação desse enhancer na região da placa do teto do tubo neural e epicárdio, local onde esse enhancer é ativado em células derivadas do órgão pro-epicárdico após o contato e/ou proximidade com células do miocárdio. A identificação de um enhancer conservado no gene da aldh1a2 suporta a idéia de que esse gene possui uma regulação modular e mostra que a abordagem evolutiva é uma eficiente ferramenta para a identificação de mecanismos de controle desse gene. / Retinoic acid (RA) is essential for embryogenesis. The key RA synthetic enzyme during early development is ALDH1A2 (RALDH2), a retinaldehyde dehydrogenase that converts retinaldehyde into RA. To understand how aldh1a2 is regulated we screened the gene for evolutionary conserved regions (ECRs) among vertebrates and assayed their regulatory potential. We describe an aldh1a2 intron 1 ECR (identified as RALDH2.2) that is conserved in amphibians, avians and humans and acts as an enhancer in derivatives of ectoderm, endoderm and mesoderm. Transient and stable transgenesis in mice reveal strong activity of the raldh2 intron 1 enhancer at the roof plate of the neural tube and at the growing epicardium. Transgenic mice indicate that the enhancer is activated in proepicardium-derived cells by contact and/or close proximity to the myocardium. The identification of an aldh1a2 conserved enhancer supports the idea of a modular regulation and shows that the evolutionary approach is an efficient tool to identify control mechanisms of the aldh1a2 gene.
|
4 |
Identificação de mecanismos reguladores RALDH2 durante a padronização dorso-ventral da medula espinhal. / Identification of RALDH2 regulatory mechanisms during the spinal cord dorsal-ventral patterning.Hozana Andrade Castillo 24 November 2010 (has links)
A sinalização pelo ácido retinóico (AR) é fundamental para o correto desenvolvimento embrionário. A principal enzima responsável pela síntese do AR durante o desenvolvimento é a Raldh2 (Aldh1a2), cujo padrão de expressão é bastante dinâmico. Apesar dos padrões de expressão da raldh2 e seus papéis durante o desenvolvimento já estarem bem estabelecidos, pouco se conhece sobre sua regulação. Estudos de bioinformática identificaram no gene raldh2 um elemento não-codante conservado (CNE), presente de anfíbios até humanos, denominado Raldh2.2. Utilizando ensaios de eletroporação e análise de camundongos transgênicos, nós mostramos que o CNE Raldh2.2 é um enhancer responsável por ativar a expressão da raldh2 na medula espinhal dorsal de tetrápodes e que seu padrão de atividade coincide em aves e camundongos. Através de ensaios de deleções e mutações sítio-direcionadas desse enhancer, identificamos quatro elementos cis regulatórios responsáveis por ativá-lo na placa do teto e em interneurônios dorsais da medula espinhal. A regulação positiva da atividade desse enhancer ocorre de maneira redundante por três sítios Tcf-homeobox, enquanto sua inibição nos interneurônios ventrais da medula espinhal se dá por dois sítos repressores, um Lim-homeodomínio e um Tgif. Neste trabalho, utilizando hibridação in situ dupla para raldh2 e math1/cath1, descrevemos um novo território transiente de expressão da raldh2, os interneurônios dorsais 1. Esses interneurônios dão origem a circuitos ascendentes e a interneurônios comissurais intraespinhais, sugerindo papéis para a sinalização pelo ácido retinóico na ontogenia dos circuitos proprioceptivos espinocerebelar e intraespinhal. / Retinoic acid (RA) signaling is crucial for correct embryonic development. Raldh2 is the major enzyme involved in retinoic acid synthesis during early development and its expression pattern is dynamic. Raldh2 expression patterns and its roles during development are well known, but little is known about its regulation. Bioinformatic analysis identified a conserved non-coding element (CNE) in the raldh2 gene conserved from amphibians to humans, called Raldh2. Using electroporation assays and transgenic mice analysis we showed that CNE Raldh2.2 is an enhancer that activates raldh2 in the dorsal spinal cord in tetrapods and that its activity pattern is the same in chicken and mice. Using deletions assays and site-directed mutagenesis, we identified four cis regulatory elements that activate this enhancer in the roof plate and dorsal interneurons of the spinal cord. This enhancer is activated by a redundant mechanism through three predicted Tcf-homeobox biding sites and it is repressed in ventral interneurons via two repressors sites, a Lim-homeodomain and a Tgif. In this thesis, using in situ hybridization, we described a new transient territory of raldh2 expression, the dorsal interneurons 1. These interneurons give rise to ascending circuits and intraspinal commissural interneurons, suggesting roles for retinoic acid signaling in the ontogeny of spinocerebellar and intraspinal proprioceptive circuits.
|
5 |
Mecanismos embrionários de diferenciação de precursores coronários: princípios para aplicação em terapia celular. / Embryonic mechanisms of coronary precursor differentiation: principles for cell therapy.Azambujá, Ana Paula 17 August 2009 (has links)
As coronárias derivam do proepicárdio, uma estrutura formada por precursores dos constituintes de vasos coronários, células endoteliais e musculares lisas (CoSMC). In vivo observa-se um marcante atraso entre a diferenciação endotelial e a integração de CoSMC à parede do vaso. O objetivo deste trabalho foi identificar os mecanismos que inibem a diferenciação a CoSMC in vivo. Baseados na perda progressiva da expressão de raldh2, a principal enzima de síntese de ácido retinóico (AR), nós exploramos a sinalização por AR como um possível inibidor da diferenciação a CoSMC. Através de um vetor adenoviral de expressão de raldh2 e da inibição in vivo da síntese de AR nós demonstramos que a sinalização por AR bloqueia a diferenciação a CoSMC dos precursores coronários. Nós também identificamos o VEGF como um fator chave no controle da diferenciação a CoSMC. Em conjunto, nossos dados suportam o modelo que a síntese de AR e VEGF durante o desenvolvimento cardíaco foi co-optada para o bloqueio da diferenciação a CoSMC até o estabelecimento de uma vasta malha vascular. / Coronary vessels derive from the proepicardium (PE), a structure formed by precursor of coronary vessels cells, endothelial and smooth muscle cells (CoSMC). In vivo there is a clear gap between the endothelial differentiation and the integration of CoSMC into the vascular tubes. The aim of this work was to understand the mechanisms controlling the delayed in vivo CoSMC differentiation. Based on the progressive loss of expression of raldh2, the main retinoic acid (RA) synthesizing enzyme, we explored the RA signaling as a possible candidate inhibitor of CoSMC differentiation. Using a adenoviral raldh2 expression system and in vivo inhibition of RA synthesis we showed that RA signaling act as a brake to slow CoSMC differentiation in PE-derived cells. We also identified VEGF as key factor acting on the control of CoSMC differentiation. Together our results support a model that AR and VEGF synthesis during cardiac development was co-opted to block the CoSMC differentiation of coronary precursors before an extensive endothelial network of tubes is established.
|
6 |
Regulação molecular da expressão atrial - específica do gene SMyHC3. / Molecular regulation of atrial-specific expression of the SMyHC3 gene.Sampaio, Allysson Coelho 02 June 2010 (has links)
Para elucidar as vias genéticas controlando a formação das câmaras cardíacas, foi analisada a regulação do promotor atrial-específico do gene de codorna que codifica a isoforma lenta da cadeia pesada de miosina (slow myosin heavy chain 3 -SMyHC3). Em camundongos transgênicos, a expressão atrial-específica dos 840 pb do promotor SMyHC3 fundido ao gene repórter da fosfatase alcalina (HAP), SMyHC3-HAP, é controlada pelos 72 pb mais distais deste promotor. Este fragmento contém sítios putativos para ligação a receptores nucleares os quais foram denominados ECRRN (elemento complexo de resposta a receptores nucleares), definidos por modelagem molecular. Tratamento de embriões SMyHC3-HAP com ácido retinoico (AR) expande o domínio atrial de expressão do transgene, enquanto que a inibição da via de sinalização por AR reduz o domínio de expressão do transgene. Ensaios de gel shift revelam que os receptores de AR, RAR/RXR se ligam fracamente a esse promotor. Também, esses receptores não ativam o promotor SMyHC3 em experimentos de transfecção transiente, mesmo na presença de coativadores, tais como p300, CBP e GRIP1. Isso sugere a participação indireta de AR na regulação deste marcador atrial. Ensaios de transfecção celular demonstram que COUPTF2 é capaz de ativar o promotor SMyHC3 e, siRNA contra COUPTF2 inibe esta transativação. Embriões tratados com AR apresentam um aumento geral da expressão de COUPTF2, reforçando a idéia de que AR age indiretamente ativando este gene. Estudos de bioinformática revelam que o ECRRN está presente na região 3 do gene AMHC1 de galinha e alinhamentos indicam que pode se tratar de um elemento móvel que pode ter sido adquirido por um evento de exaptação. Em resumo, COUPTF2 e AR controlam a expressão do promotor SMyHC3, porém a natureza da relação entre os 2 elementos necessita ser elucidada. / To elucidate the genetic pathways controlling cardiac chamber formation, the atrial specific gene promoter SMyHC3 was analyzed. In transgenic mice, the atrial specific expression an 840 bp of the SMyHC3 promoter was linked to reporter gene human alkaline phosphatase (HAP), SMyHC3-HAP. By directed mutagenesis and deletion analysis we identified the more distal 72 bp of the promoter as responsible of the atrial expression. This fragment contains putative binding sites to nuclear receptors, the CNRRE (complex nuclear receptor response element), defined by molecular modeling. RA (retinoic acid) treatment in SMyHC3-HAP embryos expands the atrial domain. However, the RA effectors, RXR/RAR bind with low affinity to the SMyHC3 promoter. These receptors are not able to activate the promoter even in the presence of coactivators such as p300, CBP and GRIP1. These results suggest that RA acts indirectly to regulate this atrial marker. Cell transient transfection shows that COUPTF2 activate the SMyHC3 promoter, and COUPTF2 siRNA inhibits the transactivation of the SMyHC3 promoter. Treatment of embryos with RA increases the COUPTF2 expression reinforcing the idea that this receptor could be regulatedindirectly by RA. Bioinformatic studies revealed that CNRRE is present in the 3 region of the ortholog chicken AMHC1 gene. Alignments indicate that this CNRRE could have been acquired by an exaptation event. In conclusion, the SMyHC3 promoter seems to be controlled by RA and COUPTF2 governing atrial expression. However the nature of relationships between RA and COUPTF2 need to be elucidated.
|
7 |
Clonagem e análise da expressão do fator de transcrição Scratch2 durante a embriogênese inicial de galinha. / Cloning and expression analysis of the transcription factor Scratch2 during the chicken early embryogenesis.Vieceli, Felipe Monteleone 23 November 2009 (has links)
Em invertebrados, os genes Scratch (Scrt) codificam fatores de transcrição que promovem a neurogênese durante o desenvolvimento. A função de Scrt em vertebrados é desconhecida, mas em camundongos Scrt1 e Scrt2 são especificamente expressos em neurônios pós-mitóticos no embrião e no sistema nervoso central adulto. Neste trabalho, nós clonamos a sequência codificante de Scrt2 de galinha (cScrt2) e caracterizamos seu padrão de expressão no embrião por PCR quantitativo e hibridação in situ. A sequência codificante completa foi clonada no vetor de expressão pMES-GFP e o produto previsto da tradução é uma proteína com 276 aminoácidos. A sequência de aminoácidos compartilha identidades de 70% com Scrt2 de rato e 58% com Scrt de zebrafish. Transcritos cScrt2 são detectados primeiramente na periferia do tubo neural do rombencéfalo em HH 15 e da medula espinhal em HH 17, coincidindo com os locais onde alguns dos primeiros neurônios se diferenciam durante a embriogênese. Entre HH 19-23, a expressão no domínio motor da medula espinhal se concentra progressivamente na interface entre as zonas ventricular e do manto. Além disso, a expressão de cScrt2 também é observada nos gânglios da raíz dorsal a partir de HH 22-23, principalmente no domínio dorsomedial. O campo de expressão de cScrt2 no tubo neural é complementar aos de Notch1, que é expresso em células-tronco neurais, e SCG10, marcador de neurônios diferenciados. Nossos resultados sugerem que durante a embriogênese da medula espinhal cScrt2 é especificamente expresso em neurônios pós-mitóticos indiferenciados. A construção pMES-GFP(cScrt2) possibilita futuras análises funcionais diretas por interferência gênica no embrião de galinha, que serão de grande valor para um melhor entendimento da função dos genes Scrt em vertebrados. / In invertebrates, the Scratch (Scrt) genes encode transcription factors that promote neurogenesis during development. The Scrt function in vertebrates is unknown, but in mice Scrt1 and Scrt2 are specifically expressed in post-mitotic neurons in the embryo and in the adult central nervous system. In this work, we have cloned the coding sequence of chicken Scrt2 (cScrt2) and characterized its expression pattern in the embryo with quantitative PCR and in situ hybridization. The complete coding sequence was cloned in the expression vector pMES-GFP and the predicted translation product is a 276-aminoacids protein. The aminoacid sequence shares identities of 70% with rat Scrt2 and 58% with zebrafish Scrt. cScrt2 transcripts are firstly detected in the periphery of the neural tube in the hindbrain by HH 15 and in the spinal cord by HH 17, coinciding with the places where some of the first neurons differentiate during embryogenesis. Between HH 19-23, the expression in the motor domain of the spinal cord is progressively concentrated in the interface between the ventricular and mantle zones. Furthermore, cScrt2 expression is also observed in the dorsal root ganglia after HH22-23, particularly in the dorsomedial domain. The expression pattern of cScrt2 in the neural tube is complementary to that of Notch1, which is expressed in neural stem cells, and SCG10, a marker for differentiated neurons. Our results suggest that during embryogenesis cScrt2 is specifically expressed in post-mitotic undifferentiated neurons. The construction pMES-GFP(cScrt2) makes possible future direct functional analysis by genetic interference in the chick embryo, which will be of great value for better understanding the Scrt genes function in vertebrates.
|
8 |
Regulação molecular da expressão atrial - específica do gene SMyHC3. / Molecular regulation of atrial-specific expression of the SMyHC3 gene.Allysson Coelho Sampaio 02 June 2010 (has links)
Para elucidar as vias genéticas controlando a formação das câmaras cardíacas, foi analisada a regulação do promotor atrial-específico do gene de codorna que codifica a isoforma lenta da cadeia pesada de miosina (slow myosin heavy chain 3 -SMyHC3). Em camundongos transgênicos, a expressão atrial-específica dos 840 pb do promotor SMyHC3 fundido ao gene repórter da fosfatase alcalina (HAP), SMyHC3-HAP, é controlada pelos 72 pb mais distais deste promotor. Este fragmento contém sítios putativos para ligação a receptores nucleares os quais foram denominados ECRRN (elemento complexo de resposta a receptores nucleares), definidos por modelagem molecular. Tratamento de embriões SMyHC3-HAP com ácido retinoico (AR) expande o domínio atrial de expressão do transgene, enquanto que a inibição da via de sinalização por AR reduz o domínio de expressão do transgene. Ensaios de gel shift revelam que os receptores de AR, RAR/RXR se ligam fracamente a esse promotor. Também, esses receptores não ativam o promotor SMyHC3 em experimentos de transfecção transiente, mesmo na presença de coativadores, tais como p300, CBP e GRIP1. Isso sugere a participação indireta de AR na regulação deste marcador atrial. Ensaios de transfecção celular demonstram que COUPTF2 é capaz de ativar o promotor SMyHC3 e, siRNA contra COUPTF2 inibe esta transativação. Embriões tratados com AR apresentam um aumento geral da expressão de COUPTF2, reforçando a idéia de que AR age indiretamente ativando este gene. Estudos de bioinformática revelam que o ECRRN está presente na região 3 do gene AMHC1 de galinha e alinhamentos indicam que pode se tratar de um elemento móvel que pode ter sido adquirido por um evento de exaptação. Em resumo, COUPTF2 e AR controlam a expressão do promotor SMyHC3, porém a natureza da relação entre os 2 elementos necessita ser elucidada. / To elucidate the genetic pathways controlling cardiac chamber formation, the atrial specific gene promoter SMyHC3 was analyzed. In transgenic mice, the atrial specific expression an 840 bp of the SMyHC3 promoter was linked to reporter gene human alkaline phosphatase (HAP), SMyHC3-HAP. By directed mutagenesis and deletion analysis we identified the more distal 72 bp of the promoter as responsible of the atrial expression. This fragment contains putative binding sites to nuclear receptors, the CNRRE (complex nuclear receptor response element), defined by molecular modeling. RA (retinoic acid) treatment in SMyHC3-HAP embryos expands the atrial domain. However, the RA effectors, RXR/RAR bind with low affinity to the SMyHC3 promoter. These receptors are not able to activate the promoter even in the presence of coactivators such as p300, CBP and GRIP1. These results suggest that RA acts indirectly to regulate this atrial marker. Cell transient transfection shows that COUPTF2 activate the SMyHC3 promoter, and COUPTF2 siRNA inhibits the transactivation of the SMyHC3 promoter. Treatment of embryos with RA increases the COUPTF2 expression reinforcing the idea that this receptor could be regulatedindirectly by RA. Bioinformatic studies revealed that CNRRE is present in the 3 region of the ortholog chicken AMHC1 gene. Alignments indicate that this CNRRE could have been acquired by an exaptation event. In conclusion, the SMyHC3 promoter seems to be controlled by RA and COUPTF2 governing atrial expression. However the nature of relationships between RA and COUPTF2 need to be elucidated.
|
9 |
Clonagem e análise da expressão do fator de transcrição Scratch2 durante a embriogênese inicial de galinha. / Cloning and expression analysis of the transcription factor Scratch2 during the chicken early embryogenesis.Felipe Monteleone Vieceli 23 November 2009 (has links)
Em invertebrados, os genes Scratch (Scrt) codificam fatores de transcrição que promovem a neurogênese durante o desenvolvimento. A função de Scrt em vertebrados é desconhecida, mas em camundongos Scrt1 e Scrt2 são especificamente expressos em neurônios pós-mitóticos no embrião e no sistema nervoso central adulto. Neste trabalho, nós clonamos a sequência codificante de Scrt2 de galinha (cScrt2) e caracterizamos seu padrão de expressão no embrião por PCR quantitativo e hibridação in situ. A sequência codificante completa foi clonada no vetor de expressão pMES-GFP e o produto previsto da tradução é uma proteína com 276 aminoácidos. A sequência de aminoácidos compartilha identidades de 70% com Scrt2 de rato e 58% com Scrt de zebrafish. Transcritos cScrt2 são detectados primeiramente na periferia do tubo neural do rombencéfalo em HH 15 e da medula espinhal em HH 17, coincidindo com os locais onde alguns dos primeiros neurônios se diferenciam durante a embriogênese. Entre HH 19-23, a expressão no domínio motor da medula espinhal se concentra progressivamente na interface entre as zonas ventricular e do manto. Além disso, a expressão de cScrt2 também é observada nos gânglios da raíz dorsal a partir de HH 22-23, principalmente no domínio dorsomedial. O campo de expressão de cScrt2 no tubo neural é complementar aos de Notch1, que é expresso em células-tronco neurais, e SCG10, marcador de neurônios diferenciados. Nossos resultados sugerem que durante a embriogênese da medula espinhal cScrt2 é especificamente expresso em neurônios pós-mitóticos indiferenciados. A construção pMES-GFP(cScrt2) possibilita futuras análises funcionais diretas por interferência gênica no embrião de galinha, que serão de grande valor para um melhor entendimento da função dos genes Scrt em vertebrados. / In invertebrates, the Scratch (Scrt) genes encode transcription factors that promote neurogenesis during development. The Scrt function in vertebrates is unknown, but in mice Scrt1 and Scrt2 are specifically expressed in post-mitotic neurons in the embryo and in the adult central nervous system. In this work, we have cloned the coding sequence of chicken Scrt2 (cScrt2) and characterized its expression pattern in the embryo with quantitative PCR and in situ hybridization. The complete coding sequence was cloned in the expression vector pMES-GFP and the predicted translation product is a 276-aminoacids protein. The aminoacid sequence shares identities of 70% with rat Scrt2 and 58% with zebrafish Scrt. cScrt2 transcripts are firstly detected in the periphery of the neural tube in the hindbrain by HH 15 and in the spinal cord by HH 17, coinciding with the places where some of the first neurons differentiate during embryogenesis. Between HH 19-23, the expression in the motor domain of the spinal cord is progressively concentrated in the interface between the ventricular and mantle zones. Furthermore, cScrt2 expression is also observed in the dorsal root ganglia after HH22-23, particularly in the dorsomedial domain. The expression pattern of cScrt2 in the neural tube is complementary to that of Notch1, which is expressed in neural stem cells, and SCG10, a marker for differentiated neurons. Our results suggest that during embryogenesis cScrt2 is specifically expressed in post-mitotic undifferentiated neurons. The construction pMES-GFP(cScrt2) makes possible future direct functional analysis by genetic interference in the chick embryo, which will be of great value for better understanding the Scrt genes function in vertebrates.
|
10 |
Mecanismos embrionários de diferenciação de precursores coronários: princípios para aplicação em terapia celular. / Embryonic mechanisms of coronary precursor differentiation: principles for cell therapy.Ana Paula Azambujá 17 August 2009 (has links)
As coronárias derivam do proepicárdio, uma estrutura formada por precursores dos constituintes de vasos coronários, células endoteliais e musculares lisas (CoSMC). In vivo observa-se um marcante atraso entre a diferenciação endotelial e a integração de CoSMC à parede do vaso. O objetivo deste trabalho foi identificar os mecanismos que inibem a diferenciação a CoSMC in vivo. Baseados na perda progressiva da expressão de raldh2, a principal enzima de síntese de ácido retinóico (AR), nós exploramos a sinalização por AR como um possível inibidor da diferenciação a CoSMC. Através de um vetor adenoviral de expressão de raldh2 e da inibição in vivo da síntese de AR nós demonstramos que a sinalização por AR bloqueia a diferenciação a CoSMC dos precursores coronários. Nós também identificamos o VEGF como um fator chave no controle da diferenciação a CoSMC. Em conjunto, nossos dados suportam o modelo que a síntese de AR e VEGF durante o desenvolvimento cardíaco foi co-optada para o bloqueio da diferenciação a CoSMC até o estabelecimento de uma vasta malha vascular. / Coronary vessels derive from the proepicardium (PE), a structure formed by precursor of coronary vessels cells, endothelial and smooth muscle cells (CoSMC). In vivo there is a clear gap between the endothelial differentiation and the integration of CoSMC into the vascular tubes. The aim of this work was to understand the mechanisms controlling the delayed in vivo CoSMC differentiation. Based on the progressive loss of expression of raldh2, the main retinoic acid (RA) synthesizing enzyme, we explored the RA signaling as a possible candidate inhibitor of CoSMC differentiation. Using a adenoviral raldh2 expression system and in vivo inhibition of RA synthesis we showed that RA signaling act as a brake to slow CoSMC differentiation in PE-derived cells. We also identified VEGF as key factor acting on the control of CoSMC differentiation. Together our results support a model that AR and VEGF synthesis during cardiac development was co-opted to block the CoSMC differentiation of coronary precursors before an extensive endothelial network of tubes is established.
|
Page generated in 0.085 seconds