The Spemann organizer in amphibians gives rise to the anterior mesendoderm (AME) and is capable of inducing neural tissues. This inductive activity is thought to occur largely via the antagonism of Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in the organizer. In the mouse, BMP antagonists Chordin and Noggin function redundantly in the AME and are required during forebrain maintenance. However, the timing of forebrain initiation and the function of BMP antagonism in forebrain initiation remained unclear prior to this study. In addition, the Transforming Growth Factor β (TGFβ) ligand Nodal patterns the forebrain via its function in the anterior primitive streak (APS), the precursor tissue of the AME. Whether BMP and Nodal signaling pathways interact has not been previously investigated. The goal of this dissertation was to investigate the cellular and molecular mechanisms involved in early mammalian forebrain establishment by embryonic and genetic manipulations. This study determined that forebrain initiation occurs during early gastrulation and requires signals from the AVE and AME. The AVE was identified as a source of active BMP antagonism in vivo, and the BMP antagonism supplied by exogenous tissues was capable to promote forebrain initiation and maintenance in the murine ectoderm. It is likely that BMP antagonism enhances forebrain gene expression via inhibiting posteriorization. This study further identified a possible crosstalk between BMP and Nodal signaling. Loss of Chordin or Noggin in combination with heterozygosity for Nodal or Smad3 results in holoprosencephaly. Molecular analyses suggest that the BMP-Nodal interaction occurs in the APS and/or the AME. Failure of this interaction results in an imbalance of BMP and Nodal signal levels that devastate APS and AME patterning during early forebrain establishment, ultimately leading to holoprosencephaly in mid-gestation. This interaction is likely to occur extracellularly, possibly by formation of a BMP-Nodal heteromeric complex. Furthermore, the spatiotemporal expression of phospho-Smad1/5/8, an effector of BMP signaling pathway, was characterized during early mouse embryogenesis. Distribution of phospho-Smad1/5/8 serves as a faithful readout of BMP signaling activity and helps to better understand how BMPs are involved in patterning early embryos. The implication of phospho-Smad1/5/8 expression in both wildtype and mutant embryos is also discussed. / Dissertation

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is an ultra-sensitive optical technique to investigate the dynamic properties of ensembles of single fluorescent molecules in solution. It is in particular suited for measurements in biological samples. High sensitivity is obtained by employing confocal microscopy setups with diffraction limited small detection volumes, and by using single-photon sensitive detectors, for example avalanche photo diodes (APD). However, fluorescence signal is hence typically collected from a single focus position in the sample only, and several measurements at different positions have to be performed successively. To overcome the time-consuming successive FCS measurements, we introduce electron multiplying CCD (EMCCD) camera-based spatially resolved detection for FCS. With this new detection method, multiplexed FCS measurements become feasible. Towards this goal, we perform FCS measurements with two focal volumes. As an application, we demonstrate spatial cross-correlation measurements between the two detection volumes, which allow to measure calibration-free diffusion coefficients and direction-sensitive processes like molecular flow in microfluidic channels. FCS is furthermore applied to living zebrafish embryos, to investigate the concentration gradient of the morphogen fibroblast growth factor 8 (Fgf8). It is shown by one-focus APD-based and two-focus EMCCD-based FCS, that Fgf8 propagates largely by random diffusion through the extracellular space in developing tissue. The stable concentration gradient is shown to arise from the equilibrium between a local morphogen production and the sink function of the receiving cells by receptor-mediated removal from the extracellular space. The study shows the applicability of FCS to whole model organisms. Especially in such dynamically changing systems in vivo, the perspective of fast parallel FCS measurements is of great importance. In this work, we exemplify parallel, spatially resolved FCS by utilizing an EMCCD camera. The approach, however, can be easily adapted to any other class of two-dimensional array detector. Novel generations of array detectors might become available in the near future, so that multiplexed spatial FCS could then emerge as a standard extension to classical one-focus FCS. / Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist eine hochempfindliche optische Methode, um die dynamischen Eigenschaften eines Ensembles von einzelnen, fluoreszierenden Molekülen in Lösung zu erforschen. Sie ist insbesondere geeignet für Messungen in biologischen Proben. Die hohe Empfindlichkeit wird erreicht durch Verwendung konfokaler Mikroskop-Aufbauten mit beugungsbegrenztem Detektionsvolumen, und durch Messung der Fluoreszenz mit Einzelphotonen-empfindlichen Detektoren, zum Beispiel Avalanche-Photodioden (APD). Dadurch wird das Fluoreszenzsignal allerdings nur von einer einzelnen Fokusposition in der Probe eingesammelt, und mehrfache Messungen an verschiedenen Positionen in der Probe müssen nacheinander durchgeführt werden. Um die zeitaufwendigen, aufeinanderfolgenden FCS-Einzelmessungen zu überwinden, entwickeln wir in dieser Arbeit Elektronenvervielfachungs-CCD (EMCCD) Kamera-basierte räumlich aufgelöste Detektion für FCS. Mit dieser neuartigen Detektionsmethode werden Multiplex-FCS Messungen möglich. Darauf abzielend führen wir FCS Messungen mit zwei Detektionsvolumina durch. Als Anwendung nutzen wir die räumliche Kreuzkorrelation zwischen dem Signal beider Fokalvolumina. Sie ermöglicht die kalibrationsfreie Bestimmung von Diffusionskoeffizienten und die Messung von gerichteter Bewegung, wie zum Beispiel laminarem Fluss in mikrostrukturierten Kanälen. FCS wird darüber hinaus angewendet auf Messungen in lebenden Zebrafischembryonen, um den Konzentrationsgradienten des Morphogens Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (Fgf8) zu untersuchen. Mit Hilfe von APD-basierter ein-Fokus FCS und EMCCD-basierter zwei-Fokus FCS zeigen wir, dass Fgf8 hauptsächlich frei diffffundiert im extrazellulären Raum des sich entwickelnden Embryos. Der stabile Konzentrationsgradient entsteht durch ein Gleichgewicht von lokaler Morphogenproduktion und globalem Morphogenabbau durch Rezeptor vermittelte Entfernung aus dem extrazellulären Raum. Die Studie zeigt die Anwendbarkeit von FCS in ganzen Modell-Organismen. Gerade in diesen sich dynamisch ändernden Systemen in vivo ist die Perspektive schneller, paralleler FCS-Messungen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird räumlich aufgelöste FCS am Beispiel einer EMCCD Kamera durchgeführt. Die Herangehensweise ist jedoch einfach übertragbar auf jede andere Art von zwei-dimensionalem Flächendetektor. Neuartige Flächendetektoren könnten in naher Zukunft verfügbar sein. Dann könnte räumlich aufgelöste Multiplex-FCS eine standardisierte Erweiterung zur klassischen ein-Fokus FCS werden.

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Peculiarities of edible onions (Allium cepa L.) gynogenesis investigated in the dissertation work. Conditions for creation of dihaploid plants evaluated. Biological assumptions for preparation of methodical suggestions, that would enable improving of gynogenesis, determined. Stimulation effect of using TDZ and NAR in media on the formation of edible onion embryogenic tissue has been revealed for the first time. Characteristic higher frequency of gynogenesis of unfertilized flower of edible onion isolated from the flower stems soaked in 2,4-D solution has been evaluated. By using experimental method it has been established that 3 day length gynogenesis induction period, using media containing 2,4-D and BA, is enough to induce gynogenesis of edible onion. High heterogeneity of edible onion variety population ‘Lietuvos didieji’ has been demonstrated from the point of organogenesis in isolated unfertilized flower culture. It has been established that the efficiency of edible onion gynogenesis can be increased by decreasing plant donor growing temperature in the final phases of flower development and using of exogenous growth regulators TDZ and NAA in plant regeneration media as well as by flower stems soaking in 2,4-D solution for 14 days. Plants with characteristic high gynogenesis frequency have been determined according to evaluation of edible onion variety population ‘Lietuvos didieji’ organogenetic response. 10 homozygous lines of edible onion have been created. 2 lines with... [to full text]

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Stem cell research is one of the promising areas of biotechnology, which offers the prospect of developing new methods to repair or replace tissues or cells damaged by injuries or diseases and to treat serious chronic diseases, such as diabetes, Parkinson’s, chronic heart failure as well as stroke and spinal cord injuries. Stem cell research is expected to be equally important for basic science to understand cell differentiation and growth as well as for other specific medical applications such as for the understanding of disease development and for the development of safer and more effective drugs. Scientists are intensively studying the fundamental properties of stem cells. One of the possible sources for stem cells is human embryos. However, when this research involves the use of human embryos it raises the question of ethical values at stake and of the limits and conditions for such research. The title of this work is ,,Stem cell regulation comparative analysis of legal aspects”. This work explores legal aspects concerning production of stem cell from embryos. The main comparative aspects investigated in this graduation paper work: 1. historical stem cell research beginning aspects; 2. medical stem cell characteristics; 3. ethical embryo stem cell research aspects; 4. EU member states that allowing creation of human embryos for procurement of human embryonic stem cells by law; 5. EU member states that prohibiting procurement of human embryonic stem cells by law; 6. EU... [to full text]

The development of spinal circuits underlying motor behaviors was examined in zebrafish. Zebrafish embryos showed three sequential, stereotyped behaviors: a transient period of spontaneous coiling contractions, followed by touch-evoked rapid coils, and swimming. Lesioning the hindbrain eliminated swimming and touch responses, but not the spontaneous contractions. / The first (spontaneous) behavior was chosen for further analysis in order to characterize the underlying circuit. In vivo patch clamp recordings were obtained from identified spinal neurons. These neurons showed periodic depolarizations that triggered rhythmic bursts of action potentials with a frequency and duration that were consistent with those of the spontaneous contractions. As with the behavior, transecting the spinal cord at the hindbrain border did not affect the rhythmic activity patterns of the neurons. Surprisingly the contractions and the periodic depolarizations were insensitive to both general and specific blockade of synaptic transmission. The periodic depolarizations were suppressed by heptanol and by intracellular acidification treatments that are known to uncouple gap junctions, indicating that electrotonic synapses could underlie network synchronization during the earliest motor behavior. / Paired recordings were obtained from identified spinal neurons. These showed that active ipsilateral neurons were electrically coupled in a simple network consisting initially of motoneurons and only three types of interneurons. Therefore, this early spinal circuit consists of rhythmically active and electrically coupled neurons. Furthermore, this circuit is also initially independent of the main neurotransmitter systems, sensory inputs, and descending hindbrain projections. The descending projections are required later in development for the onset of touch responses and swimming.

Conifer species are subjected to major time constraints in tree improvement because of their long regeneration cycle and large sizes. However, integration of developing biotechnologies could significantly reduce this time limitation in tree breeding programs. In this regard, somatic embryogenesis (SE) offers a great potential in commercially important Turkish red pine (Pinus brutia TEN.) for rapid production of larger number of clones as well as capture of greater genetic gains. In this study, seven collections were done to sample precotyledonar zygotic embryos for induction of embryogenic tissue (ET) from 15 clones located in Antalya. Afterwards, abscisic acid, carbohydrates, polyethylene glycol (PEG), and gellan gum were tested to obtain mature somatic embryos in maturation experiments. Analyses of variance showed a significant variation among collection dates (43.1% of total variance) and clones studied (18.8% of total variance) for induction of ETs. Overall initiation frequency of ET in this study was 11.6% with clonal range of 4.7 &amp / #8211 / 24.1%. Of those tested maturation treatments, 80&amp / #956 / M ABA, sucrose and maltose at 3 and 6%, 3.75% PEG combined with 1% gellan gum were found to be suitable for maturation of somatic embryos in Turkish red pine. Sixty nine somatic embryos were obtained from Clone 22, which was one of tested clones. Induction frequencies could be further improved by using different basal media and/or manipulating media components, such as plant growth regulators. For proper maturation of somatic embryos, embryogenic lines need to be screened to find suitable lines, which are developmentally responsive to ABA treatment.

Die derzeit angewendete Formalinbegasung von Bruteiern zur Keimreduktion stellt ein wichtiges Mittel zum Schutz des Verbrauchers vor dem Eintrag der Salmonellose aus der Geflügelindustrie in die Lebensmittelkette dar. Jedoch verlangt sein kanzerogenes Potenzial die Suche nach einer ebenso effektiven und einfach zu praktizierenden, aber weniger gesundheitlich bedenklichen alternativen Methode. In dieser Arbeit wurde die Eignung einer in ovo-Ozonbegasung zur Bruteidesinfektion hinsichtlich ihrer Auswirkung auf die Embryonalentwicklung untersucht. Dafür wurden befruchtete Eier vor ihrem Einsatz in den Brüter mit unterschiedlichen Ozonkonzentrationen zwischen 0,5% bis >5,0% (wt/ wt O3 in O2) bei einer relativen Luftfeuchte von 70% in einer Laborkammer begast. Die verwendeten Ozonkonzentrationen wurden dabei in drei Konzentrationsgruppen eingeteilt: hoch (2,8% bis 5,0%), mittel (1,1% bis 2,5%) und niedrig (0,5% bis 1,0%). Nach Erreichen der Zielkonzentration blieben die Eier für eine definierte Einwirkzeit (EWZ) zwischen 0 bis 24 h in der Kammer. Am Bruttag (BT) 18, 19 oder 20 wurden die Überlebensrate (ÜLR), Gewicht und Länge erhoben sowie histologische Untersuchungen der Organe Herz, Leber, Milz und Niere vorgenommen. Bei vier Versuchen erfolgte zusätzlich die Untersuchung am BT 6 und BT 12. Insgesamt wurden 13 Versuchsreihen mit Begasungen in der Laborkammer in den drei genannten Konzentrationsgruppen durchgeführt. Des Weiteren sollte die Übertragbarkeit der ermittelten Ergebnisse auf eine großtechnische Lösung, durch die Anwendung in einer projektintern entwickelten Prototyp-Kammer überprüft werden. Die Konzipierung dieses Prototyps folgte den technischen Gegebenheiten unter Einbeziehung der ermittelten Ergebnisse zur Embryotoxizität, zur Effektivität der Keimreduktion sowie der Veränderung der Eiinhaltsstoffe. Im Prototyp wurde daher die Begasungskonzentration von 0,7% Ozon bei einer EWZ von 2 h angewendet und in 2 Versuchsreihen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und die morphologische Entwicklung getestet. Um zusätzlich eine Aussage treffen zu können, welche Wirkung eine hohe Ozonkonzentration bei der Applikation während der Bebrütung zur Folge hat, wurde in zwei weiteren Versuchsreihen jeweils am BT 3, 4 und 5 eine Ozondosis von 5,0% in Kombination mit 1 h EWZ appliziert. Nach der Entnahme der Embryonen am BT 6 bzw. BT 8 erfolgte die morphologische Untersuchung. Aus der vorliegenden Arbeit wird zusammenfassend geschlussfolgert:  Ozon besitzt einen dosisabhängigen Effekt auf die ÜLR: je höher die Dosis, desto geringer die Überlebensrate. Bei niedrigen Ozonkonzentrationen zwischen 0,5% und 1,0% kommt es zu ÜLR von 90% und 100%.  Die Einwirkzeit stellt einen wichtigen Einflussfaktor auf die Überlebensrate dar. Eine Kombination einer hohen Ozondosis mit langer EWZ hat eine höhere Embryomortalität zur Folge, als eine hohe Ozondosis ohne EWZ. Eine erhöhte Mortalitätsrate zeigt sich auch bei der Kombination einer mittleren Ozondosis mit einer langen EWZ. Keinen Einfluss zeigt sie bei der Kombination mit einer niedrigen Ozonkonzentration.  Ozonierte Embryonen zeigen dosisabhängig eine geringere Längen- oder Gewichtsentwicklung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Signifikante Gewichts- und Längenunterschiede lagen nur vereinzelt bei der Begasung mit hoher Ozonkonzentration vor.  Pathohistologische Befunde an Organen, die mit einer Ozonbegasung in Zusammenhang gebracht werden können, konnten nicht erhoben werden.  Die Versuche zur Begasung während der Organogenese wiesen nicht auf ein teratogenes Potenzial von Ozon hin. Korrespondierend mit den Ergebnissen der Begasung am BT 0 zeigte sich ebenfalls eine deutliche Embryotoxizität.  Die Wirkung von Ozon folgt einem Alles-oder-Nichts-Prinzip: entweder die Schädigung ist so stark, dass es zu keiner Entwicklung mehr kommt, oder aber der überlebende Embryo bzw. Fetus zeigt ein phänotypisch normales Aussehen.  Mit den vorgestellten Untersuchungen konnte bewiesen werden, dass bei einer in ovo-Begasung von befruchteten Hühnereiern am Bruttag 0 mit einer niedrigen Ozonkonzentration von 0,5% bis 1,0% in Kombination mit einer mittleren und geringen EWZ keine teratogenen oder embryotoxischen Veränderungen zu erwarten sind.  Aus diesen Befunden ergibt sich ein unbedenklicher Einsatze von Ozon als alternative Methode zur Bruteidesinfektion. Die Voraussetzung dafür ist, dass die großtechnische Lösung die Anwendung von 1,0% Ozonkonzentration in Kombination mit 2 h EWZ ermöglicht, um eine sehr gute ÜLR, Entwicklung und eine 100%ige Inaktivierung des in Legehennenbeständen vorherrschenden Serovars Salmonella Enteritidis zu gewährleisten.

Graduation date: 1993