MTOR est une sérine/thréonine kinase appartenant au complexe mTORC1 (mTOR Complexe 1), un régulateur clé de la traduction. Ce complexe joue un rôle au sein de la LTP (Potentialisation à Long Terme), une forme de plasticité synaptique qui requiert la synthèse de nouvelles protéines pour renforcer la transmission synaptique. La première partie de ma thèse porte sur les mécanismes de régulation de la voie mTORC1 dans les neurones. Dans les cellules non neuronales, cette voie de signalisation est classiquement régulée par deux voies distinctes. D’une part, les acides aminés induisent le recrutement du complexe mTORC1 à la membrane des endo-lysosomes où la protéine Rheb est enrichie et favorisent ainsi l’activation de mTORC1. D’autre part, les facteurs de croissance activent mTORC1 en stimulant la voie PI3K/Akt/TSC/Rheb. Nos résultats indiquent que les neurones sont capables d’ "utiliser" le mécanisme responsable de la translocation de mTORC1 en réponse à la supplémentation en acides aminés pour coupler l’induction de la plasticité synaptique à l’activation de mTORC1. En effet, les récepteurs NMDA et le BDNF, deux acteurs centraux de la LTP, augmentent le recrutement de mTORC1 à la membrane des endo-lysosomes même en absence d’acides aminés, et activent mTORC1. Par des stratégies induisant la translocation de mTORC1 à la membrane des endo-lysosomes, nous avons montré que ce mécanisme est important pour l’activation de mTORC1 mais n’est pas suffisant : il faut également une activation de la protéine Rheb. Le second aspect de mon projet porte sur la régulation de mTORC1 dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive de la mémoire. Les déficits cognitifs s’accompagnent d’un dysfonctionnement progressif des synapses suivi par la perte neuronale, tous deux causés par une accumulation anormale du peptide amyloïde β (Aβ). Les données de la littérature montrent que les oligomères toxiques du peptide Aβ (AβO) inhibent la plasticité synaptique dans les stades précoces de la maladie. Cependant, les mécanismes restent obscurs. Plusieurs études mettent en évidence une altération de la voie mTORC1. Nos résultats montrent que les AβO inhibent le recrutement de mTORC1 à la membrane des endo-lysosomes. Ce mécanisme est rétabli par une inhibition pharmacologique de l’AMPK. Ainsi, ces données indiquent que les AβO inhibent l’adressage de mTORC1 aux compartiments endo-lysosomaux via l’AMPK. Cela aurait pour conséquence une inhibition de la synthèse protéique décrite dans la littérature et contribuerait ainsi au dysfonctionnement synaptique. / MTOR is a serine/threonine kinase that belongs to mTORC1 (mTOR complex 1), a key regulator of translation. This complex is involved in LTP (Long Term Potentiation), a form of synaptic plasticity requiring new protein synthesis to reinforce synaptic transmission. The first part of my thesis investigates the mechanism of mTORC1’s regulation in neurons. In non-neuronal cells, mTORC1 pathway is commonly activated by two distinct pathways. On the one hand, amino acids induce mTORC1 recruitment to the membrane of endo-lysosomes where Rheb is enriched and can thus promote mTORC1 activation. On the other hand, growth factors activate mTORC1 via the PI3K/Akt/TSC/Rheb pathway. Our results indicate that neurons are capable of “using” amino acid-induced translocation of mTORC1 to connect synaptic plasticity induction to mTORC1 activation. Indeed, NMDA receptors and BDNF, two main actors of synaptic plasticity, increase mTORC1 recruitment to the membrane of endo-lysosomes even in the absence of amino acids, and activate mTORC1. Using strategies targeting mTORC1 to endo-lysosomes, we show that this mechanism promotes activation of mTORC1 but is not sufficient: Rheb activation is also required. The second part of my project is focused on the regulation of mTORC1 in Alzheimer’s disease, a neurodegenerative pathology characterized by a progressive memory loss. Cognitive deficits are widely believed to result from a progressive dysfunction of synapses, followed by a loss of neurons, both caused by an abnormal accumulation of the amyloid β peptide (Aβ). Data from others show that toxic Aβ oligomers (AβOs) inhibit synaptic plasticity at early stages of the disease. However, the mechanisms remain poorly understood. Several studies indicate an alteration of the mTORC1 pathway. Our results show that AβOs inhibit mTORC1 recruitment to the membrane of endo-lysosomes and that this effect can be rescued by a pharmacological inhibition of AMPK. Thus our data indicate that AβOs inhibit mTORC1 translocation to endo-lysosomal compartments via AMPK. This could lead to the impairment of protein synthesis reported in other studies and thus alter synaptic function.

The efficcacy of the treatment of the endodontic-periodontal lesion was evaluated in longitudinal studies, by means through a systematic review. Bibliographic tabulation sources identified electronically by MEDLINE, from 1966 up to March, 26 of 2007 and Cochrane Library, in the same period. As search strategy one used the terms - endodontic-periodontal lesion or endodontic-periodontal lesions or endodontic periodontal lesion or endodontic periodontal lesions or endo-perio lesion or endo-perio lesions or endodontics periodontal lesion or endodontics periodontal lesions - as word-key. The studies had been selected by two copyholders, independent, that also they had determined the criteria of inclusion and exclusion. The search presented 257 related articles, being that, of these, 55 articles were of literature revision, 27 articles became related with prospectives studies, 70 studies was cases reports, 19 studies had been developed in animals and 25 had involved retrospective studies. Absence of longitudinal studies that satisfied the inclusion criteria, with sights to the analysis based on evidences was observed. However, front to applied literature was verified that the success of the treatment of the endodontic-periodontal lesions is related to the brief identification of the etiology, to the control of microbiota present, to the immunological characteristics of the individual, being that one of the strategies and possible prognostic the origin of the infectious process is associated to it. Considering the estimate of success of the clinical success of the endodontic-periodontal lesion an initial microorganisms control in the oral cavity is suggested, followed for the control of endodontical microorganisms and, to follow, the periodontal, for then carrying through the treatment. The immunological system of the individual participates actively of the process as component manager. / Avaliou-se em estudos longitudinais a eficácia do tratamento da lesão endodôntica-periodontal, por meio de revisão sistemática. Utilizou-se de fontes de catalogação bibliográfica identificadas eletronicamente por MEDLINE, a partir de 1966 até 26 de março de 2007 e Cochrane Library, no mesmo período. Como estratégia de busca utilizou-se os termos endodontic-periodontal lesion or endodontic-periodontal lesions or endodontic periodontal lesion or endodontic periodontal lesions or endo-perio lesion or endo-perio lesions or endodontics periodontal lesion or endodontics periodontal lesions como palavras-chave. Os estudos foram selecionados por dois revisores, independentes, que também determinaram os critérios de inclusão e exclusão. A busca apresentou 257 artigos relacionados, sendo que, destes, 55 artigos eram de revisão de literatura, 27 artigos relacionavam-se com estudos prospectivos, 70 estudos eram relatos de casos clínicos, 19 estudos foram desenvolvidos em animais e 25 envolveram estudos retrospectivos. Observou-se ausência de estudos longitudinais que satisfizessem os critérios de inclusão, com vistas à análise baseada em evidências. Contudo, frente à literatura aplicada verificou-se que o sucesso do tratamento das lesões endodônticas-periodontais está relacionado à breve identificação da etiologia, ao controle da microbiota presente, às características imunológicas do indivíduo, sendo que uma das estratégias e o possível prognóstico vincula-se à origem do processo infeccioso (endodôntico ou periodontal). Considerando a estimativa de êxito do sucesso clínico da lesão endodôntica-periodontal sugere-se um controle microbiano inicial na cavidade bucal, seguido pelo controle da microbiota endodôntica e, a seguir, a periodontal, para então realizar o tratamento. O sistema imunológico do indivíduo participa ativamente do processo como componente gerenciador. / Mestre em Odontologia

As mudanças climáticas estão causando prejuízos em vários setores da economia mundial. Na reunião da COP21, que teve como foco estas mudanças climáticas, participantes do mundo todo decidiram tomar atitudes urgentes para tentar conter aumento da temperatura média global. Dentro deste cenário, a produção e o consumo de energia têm uma importância central, onde fontes de energia renováveis vêm sendo preferidas às fontes de energias fósseis. O Brasil tem uma participação importante na geração de energia renovável mundial aportando um 40% do total de sua matriz energética. A degradação dos componentes da parede celular vegetal tem um vasto potencial na geração de biocombustíveis e outros compostos verdes a partir da celulose, hemicelulose e lignina. Para isto estudos das enzimas capazes de degradas estes componentes vem sendo realizados, com ênfase nas enzimas hidrolases de glicosídeos. Dentre as hidrolases, encontram-se as arabinanases, enzimas capazes de hidrolisar o arabinano, componente polissacídeo da hemicelulose, em L-arabinose. Neste trabalho, estudos envolvendo duas arabinanases de Bacillus licheniformis foram realizados, iniciando na etapa de clonagem dos genes. Os produtos foram transformados em Escherichia coli e expressos e purificados. A avaliação da estabilidade térmica indicou uma afinidade das enzimas por metais divalentes. Tentativas de cristalização resultaram na formação de um cristal, que possibilitou a determinação da estrutura uma das arabinanases. Através de ensaios bioquímicos, foi determinada a especificidade por substrato, temperatura e pH ótimos e a atividade frente a metais. Foi observado que as enzimas são seletivas para arabinano não ramificado, tem temperatura ótima em 45 e 40 graus, para BlAbn-1 e BlAbn-2, respectivamente, e pH ótimo em 8 e 7. Por último, foram realizados ensaios complementares de sinergismo e atividade oxidativa. Embora os ensaios de atividade oxidativa tenham sido inconclusivos, os ensaios de sinergismo mostraram que a enzima BlAbn-1 é capaz de aumentar em 30% a atividade do coquetel enzimático Accellerase 1500 sobre biomassa pré-tratada e sobre celulose pura. Este efeito é ainda maior na presença de sulfato de níquel. / Climate change is causing losses in different sectors of the world economy. At the meeting of COP21, focused on climate changes, participants from around the world decided to take urgent actions to try to halt the increase in global average temperature. Within this scenario, the production and consumption of energy are of central importance, where renewable energy sources have been preferred to fossil fuels. Brazil has an important role in the global renewable energy generation by contributing 40% of its total energy mix. The degradation of the components of plant cell wall has a vast potential in the generation of biofuels and other green chemical from cellulose, hemicellulose and lignin. Thus, studies of enzymes that degrade these components have been carried out, with emphasis on glycoside hydrolases. Among the hydrolases are the arabinanases, enzymes capable of hydrolyzing arabinan, a polysaccharide component of hemicellulose, in L-arabinose. In this work, studies involving two arabinanases from Bacillus licheniformis were carried out, starting in gene cloning step. The products were transformed into Escherichia coli, expressed and purified. The evaluation of the thermal stability of the enzymes showed an affinity for divalent metals. Crystallization attempts resulted in the formation of a single crystal, which made it possible to determine the crystal structure of one arabinanase. Through biochemical assays, it was determined the substrate specificity, optimum temperature and pH and activity against metals. It was observed that the enzymes are selective for non-branched arabinan, have optimum temperature at 45 and 40 degrees, to BlAbn-1 and BlAbn-2, respectively, and optimum pH of 8 and 7. Finally, additional tests were performed to evaluate the possible synergism and oxidative activity. Although the oxidative activity assays were inconclusive, the synergism tests showed that BlAbn-1 is able to increase by 30% the activity of the enzymatic cocktail Accellerase 1500 on pre-treated biomass and on pure cellulose. This effect is even greater in the presence of nickel sulfate.

Este trabalho procurou avaliar algumas isozimas envolvidas com o processo de degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal, encontradas em Aspergillus versicolor, fungo pertencente a um gênero onde a multiplicidade de componentes enzimáticos com a mesma atividade oscila de uma a três. Duas ß-xilosidases foram purificadas por meio de DEAE-celulose e precipitação com sulfato de amônia. Ambas mostraram-se enzimas que, quando deglicosiladas por PNGaseF, apresentam mesmos mapas trípticos. A glicosilação mostrou-se importante para a manifestação de diferenças bioquímicas relacionadas às interações com ambiente eletrolítico adjacente, visto as mudanças das curvas de pH e alterações de comportamento frente a sais de íons metálicos, tão bem como para a manutenção do funcionamento das enzimas. Também foi verificado que as diferentes formas glicosiladas periplásmicas são produzidas em meios distintos (xilana e xilose), cujos pH finais corresponderam aos pH das enzimas encontradas. Por meio de zimogramas, verificou-se que estas não eram produzidas de imediato, mas selecionadas ao longo do tempo de cultivo. Esta seleção foi inicialmente independente do pH, visto este, mesmo tamponado, ser corrigido pelo fungo, de modo a se apresentar, ao final de 48h, correlato com o da enzima selecionada. Exame cromatográfico em Concanavalina-A das enzimas deglicosiladas por EndoH mostraram que a oriunda de xilana tem aporte maior de ramificações biantenárias, que são ricas em galactose. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-xilosidase induzida por xilana apresentou proporções de manose, galactose e glucose iguais a 69,68 : 30,25 : 0,056 %, respectivamente, enquanto que ß-xilosidase induzida por xilose apresentou proporções iguais a 85,35 : 14,54 : 0,094%, respectivamente, resultado que corrobora com a resultado anterior. Duas ß-glucosidases de superfície micelial foram purificadas por meio de DEAE-Sephacel e DEAE-celulose. Ambas mostraram-se mais semelhantes entre si que as ß-xilosidases, e independentes de fonte de carbono ou pH. No entanto, apresentaram diferenças frente à inibição por celobiose (acentuada a partir de 10mM para ß-glucosidase I e 20mM para B-glucosidase II) e, embora sutis, a pH. Após serem submetidas a 45 ºC por 30min (temperatura que induziu segunda conformação estável) mostraram curvas de pH muito distintas, que foram eliminadas nas enzimas submetidas ao mesmo experimento após deglicosilação por PNGaseF. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-glucosidase I mostrou-se constituída de Man:Gal:Glu em proporções iguais a 78,36%:21,61%:0,033% do carboidrato total, respectivamente, e a ß-glucosidase II, Man:Gal:Glu iguais a 83,59%:16,38%:0,028%, respectivamente. Ambas também apresentaram sinergismo quando juntas. Sobre celobiose, foi verificado apenas em pH acima de 5.5. Sobre celooligossacarídeos, manifestou-se em pH 5,25. A ß-glucosidase I foi menos ativa que a ß-glucosidase II quando em ausência de glucose e celobiose na solução de reação inicial, situação na qual o contrário foi verdadeiro. O sinergismo foi drasticamente eliminado após deglicosilação por PNGaseF. Não se sabe se este resultado foi oriundo de mudanças cinéticas provocadas pela deglicosilação ou de uma possível eliminação de agregação anteriormente existente entre glicosiladas. O componente ß-glicosidásico extracelular foi purificado por meio de DEAE-Sephacel e Octyl-Sepharose, e se revelou um heteroagregado de fosfatase ácida com ß-glicosidase, que se mostrou estável e ativo em ampla gama de temperaturas e pH, com ótimos de 55ºC e 5,5, respectivamente. Entretanto, os perfis das curvas foram distintos entre as enzimas componentes. Somente concentrações superiores a 0,8mM de cloreto de cobalto apresentaram efeito desagregador, podendo ser empregado em conjunto com DEAE-celulose para purificação das enzimas isoladas. Quando separadas, fosfatase mostrou-se 260% mais ativa e ß-glicosidase, 50% menos ativa. Nesta condição, as faixas de pH se restringiram, acidificando-se, localizando-se entre pH 4,0 e 5,5. Aparentemente, a agregação reforça a atividade celobiásica. Fosfatase foi ativa sobre farelo de trigo e fitato de sódio e adsorveu fortemente em farelo de trigo. ß-glicosidase apresentou atividade sobre farelo de trigo, xilana e Avicel (liberando apenas glicose desta última), revelando-se enzima com atividade celobioidrolásica inespecífica, embora ávida por celobiose. As atividades foram determinadas como oriundas do mesmo sítio catalítico. ß-glicosidase não foi seqüestrada por farelo de trigo quando desagregada, resultado invertido quando reagregada. O seqüestro por farelo de trigo, aparentemente, deveu-se a interações entre sítio catalítico da fosfatase e substrato. / This study explored enzyme multiplicity on hemicelllulose and cellulose degrading systems. It first demonstrates the differences of PNGaseF deglycosylation and EndoH deglycosylation on forms of two ß-glicosidase activities present on surface of mycelia from Aspergillus versicolor grown on several carbon sources. Aspergillus versicolor produces ß-xylosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation, when grown on xylan or xylose. Were investigated the biochemical properties of these ß-xylosidases after deglycosylation. The purified enzymes were deglycosylated with endo-H or PNGase F. After this treatment both enzymes migrated faster in PAGE exhibiting the same Rf. On SDS-PAGE both enzymes showed similar migration. The optima temperature of xylan-induced and xylose-induced ß-xylosidases was 45 ºC and 40 ºC, respectively, and of 35 ºC after deglycosylation. The xylan-induced enzyme was more active at acidic pH than the xylose-induced enzyme. After deglycosylation the optimum pH of both enzymes was 6.0. The thermal resistance of the enzymes at 55 ºC showed a half-life of 15 min and 9 min for xylose-and xylan-induced enzymes, respectively. After deglycosylation both exhibited half-lives of 7.5. Native enzymes exhibited different response to ions, while deglycosylated enzymes exhibited identical sensitivity to ions. Limited proteolysis yielded coincident profiles in SDS-PAGE for both deglycosylated enzymes. All data suggest that the two A.versicolor ß-xylosidases share a common polypeptide core with differential glycosylation, apparently responsible for their biochemical and biophysical differences. Aspergillus versicolor also produced ß-glucosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation independently of carbon source. ß-Glucosidase I differed from ß-glucosidase II principally considering the amount and composition of carbohydrate, sensitivity to ions and pH. The purified enzymes shared the same tripitic maps and molecular masses after deglycosylations. All results showed that the biochemical differences observed for two enzymes were directly linked to PNGaseF- deglycosylation. Considering that Rfs, elution profiles on Con-A and residual glycosylation of both enzymes treated with EndoH or PNGaseF were the same, but differed on the mannose/galactose ratio, we inferred differences on proportion of hybrid-type/high-mannose-type glycans. The significance of this glycoform diversity was stressed in analysis of the action of mixture of both ß-glucosidases on celooligosoccharides and on cellobiose. This synergism was abolished after PNGaseF deglycosylation. These results are the first to show synergism between glycoforms of glycosil-hydrolases, representing a new class of synergistic type. The work also described a new form of aggregation between enzymes. Generally, ß-glycosidases are described as soluble components, attached to cell wall or free in the culture medium. This work verified that it could be extracelular adsorbed to wheat straw when aggregated with an acid phosphatase. The results strongly suggested that phosphatase is the component responsible for the process of adsorption on the substrate. The disaggregation was cobalt mediated, being not observed for another ions. The aggregation state has positive effects on glycosidase activity, extending pH ratio and increasing hydrolysis velocity. The opposite was found to phosphatase activity.

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

Durante a maturação da semente, a partir da fertilização do óvulo, há alterações inerentes à formação da semente, com destaque para as variações do tamanho, do teor de água, das massas da matéria fresca e seca e da germinação das sementes. Paralelamente, para os frutos carnosos há alterações visíveis nos frutos relacionados à forma, à cor e à senescência. Não há, todavia, relatos de quais mudanças (morfológica, anatômica, fisiológica e bioquímica) ocorrem nas sementes que se desenvolvem no interior de frutos carnosos mantidos em repouso por diferentes períodos de tempo. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a fase final da formação das sementes de pimentão, considerando as variações da morfologia externa dos frutos e do parâmetro fisiológico, da morfologia interna, da enzima endo-?-mananase, da anatomia e do acúmulo de substâncias de reservas e do ciclo celular das sementes, visando verificar se essas mudanças explicam as alterações fisiológicas das sementes de pimentão após o repouso pós-colheita do fruto e durante o armazenamento das sementes. As sementes foram extraídas de frutos em diferentes estádios de maturação, (cores verde, verde-avermelhada e vermelha), mantidos em repouso por 3, 7 ou 14 dias ou sem repouso, e avaliadas logo após a colheita e durante o armazenamento. Os frutos foram avaliados quanto à coloração, dimensões e massa. As sementes foram avaliadas quanto ao teor de água, massa de matéria seca, massa de 1000 sementes, germinação e vigor, além da avaliação de imagens de raios X para o estudo da morfologia interna das sementes, da atividade da enzima endo-?-mananase pelo método da difusão em gel, análises histoquímicas para o estudo da anatomia e de substâncias de reserva e a avaliação do ciclo celular. A colheita das sementes de pimentão pode ser caracterizada pela coloração dos frutos. Em função do repouso há alteração da cor do fruto, do ciclo celular das sementes hidratadas, da atividade da enzima endo-?-mananase e de algumas substâncias de reserva, interferindo positivamente na qualidade das sementes de pimentão. Entretanto, o repouso de frutos, que estão em estágio avançado de desenvolvimento, causa redução da qualidade das sementes. O teor de água, a massa de matéria seca e a morfologia interna da semente, a anatomia das células do endosperma e a presença de substâncias de reservas das sementes não são alterados durante o repouso do fruto, mas estão relacionados ao estádio de formação das sementes. Na medida em que há a deterioração natural das sementes durante o armazenamento, há redução da germinação e do vigor, da atividade da endo-?-mananase, da quantidade de lipídios, proteínas e polissacarídeos das células do embrião e do endosperma. Durante o repouso do fruto por 14 dias, as sementes extraídas de frutos verdes têm tolerância à desidratação, caracterizada principalmente pelo aumento da germinação após a secagem das sementes. A maturidade fisiológica das sementes é caracterizada pela coloração verde-avermelhada dos frutos e também pela estabilização do teor de água das sementes (30%), pela quantidade de matéria seca e pelo conteúdo de DNA 4C; não há coincidência entre maturidade fisiológica e máxima germinação. / During seed maturation there are some significant alterations in seed size, moisture content, fresh and dry matter and germination. Furthermore, for fleshy fruits, visible alterations occur as the fruit shape, color and senescence. There are not reports about which morphological, anatomical, physiological and biochemical alterations occur in seeds that develop inside fleshy fruits during the rest of them, for different periods of time. The objective of this research was to evaluate the final stage of the bell pepper seed formation and it was considered the variations of the external morphology of the fruit, and the physiological parameter, internal morphology, activity of endo-?-mannanase, anatomy and the reserve substances accumulation, and cell cycle of the seeds to verify if these changes explain the physiological changes of the bell pepper seeds after the fruit resting and during the seed storage. The seeds were extracted from fruits at different maturation stages (colors green, reddish-green and red), with (3, 7 or 14 days) or without fruit resting, and during the seed storage. The fruits were evaluated by color, and the measurements and weight. The seeds were evaluated for moisture content, dry mass, mass of 1000 seeds, germination and vigor and X-ray imaging to study the internal morphology of the seeds, endo-?-mannanase activity by gel diffusion assay, histochemical analyzes to study seed anatomy and reserve substances, and flow cytometry to assess the cell cycle. The harvest of bell peppers seeds can be made by the color of the fruits. The fruit resting alters the fruit color, germination, vigor, endo-?-mannanase activity, some storage substances and cell cycle improving bell pepper seed quality. However it has a negative role when the fruits are in advanced stage of development (red fruits and resting time more than 7 days). The moisture content, dry matter and the internal morphology of the seeds do not change by the fruit resting, but because of the seed maturation stage. It was observed reduction of all the physiological parameters, including the amount of lipids in the cells and endo-?-mannanase activity. During fruit resting, the endo-?-mannanase activity and the 4C DNA content of the cells decrease and there is an increased rate of germination and vigor. The water content, dry matter, internal morphology and anatomy of the cells of the endosperm and the presence of reserves substances in the seeds are not changed due to the rest of the fruit, but are related to the seed formation stage. There is natural seed deterioration during storage and a reduction of germination and vigor, endo-?-mannanase activity, amount of lipids, proteins and polysaccharides in the embryo and endosperm cells. During the fruit resting (14 days), the seeds extracted from green fruits have desiccation tolerance, characterized by increased of the seed germination after drying. The physiological maturity is reached when the fruits are reddish-green, characterized by stabilizing the water content of the seeds (30 %), amount of dry matter and the 4C DNA content. There is not a coincidence between physiological maturity and maximum germination.

La découverte du rôle des insectes en tant que vecteurs de pathogènes, établi depuis plus d'un siècle, a été l'élément moteur de la discipline « entomologie médicale et vétérinaire ». Malgré le succès de nombreuses campagnes de prévention et de programmes de lutte, nous assistons depuis une trentaine d'années à l'émergence et à la recrudescence de maladies à transmission vectorielle. Le virus de la fièvre catarrhale ovine (FCO) (Reoviridae : Orbivirus) est un très bon exemple de virus émergent en Europe dont les mécanismes de transmission sont encore peu connus dans cette région. Ce virus est transmis par des moucherons hématophages du genre Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) aux ruminants sauvages et domestiques. En Europe, la FCO a été pendant longtemps considérée comme une maladie exotique. À partir de 1998, plusieurs incursions apparaissent dans l'ouest du bassin méditerranéen en lien avec la remontée vers le nord de populations de Culicoides imicola, le principal vecteur afrotropical. À partir d'août 2006, l'apparition et la transmission du sérotype 8 dans le nord de l'Europe, dans des zones où C. imicola est absent, révèle l'importance des espèces autochtones et la nécessité de comprendre leur rôle vecteur. Ce travail s'intéresse aux mécanismes de transmission du virus de la FCO en Europe non méditerranéenne, en i) présentant un état de l'art de la biologie et l'écologie des Culicoides adultes, ii) en évaluant les conditions possibles d'utilisation de pièges pour estimer le taux de piqûre et iii) en décrivant les comportements trophiques pour les espèces d'intérêt vétérinaire. / The discovery of insects as pathogens vectors was established for over a century and was the driving force behind the discipline “medical and veterinary entomology”. Despite the success of some prevention and control program campaigns, the emergence and spread of vector-borne diseases occurred dramatically during this last thirty years. Bluetongue virus (BTV) (Reoviridae: Orbivirus) is a good example of emerging virus in Europe, with a little understanding of the epidemiology of this disease. This virus is transmitted by blood-sucking midges of the genus Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) to wild and domestic ruminants. In Europe, BT was considered an exotic disease. In 1998, several incursions appeared in the western Mediterranean Basin in line with the northward progression of C. imicola populations, the main afrotropical vector. From August 2006, the emergence and transmission of serotype 8 in northern Europe, in areas where C. imicola is absent, revealed the importance of autochthonous species and the urgent need to understand their role as vector. This work gives new insights into the understanding of BTV transmission in northern Europe: i) presenting a state of the art review of the biology and ecology of Culicoides adults, ii) assessing different methods to study the biting rate and iii) highlighting trends in host-seeking behavior.

Cellulosabaserade material är världens rikligast förekommande förnyelsebara råvara. Växters cellväggar är naturliga kompositmaterial där den kristallina cellulosan är inbäddad i en väv av hemicellulosa, strukturproteiner och lignin. Xyloglukaner är en viktig hemicellulosagrupp som omger och korslänkar den kristallina cellulosan i cellväggarna. I denna avhandling undersöks undersöks sambanden mellan struktur och funktion hos olika xyloglukan-aktiva enzymer. En modell för effektiv enzymatisk omvandling av biomassa ges av cellulosomen hos den anaeroba prokaryota organismen Clostridium thermocellum. Cellulosomen är ett proteinkomplex med hög molmassa och flera olika enzymaktiviteter, bl.a. det inverterande xyloglukan-endohydrolaset CtXGH74A. Proteinstrukturen för CtXGH74A har lösts i komplex med xyloglukanoligosackarider, som stabliliserar vissa loopar/slingor som är oordnade i apostrukturen. Ytterligare detaljerade kinetiska och produktananalyser har genomförts för att entydigt visa att CtXGH74A är ett endoxyloglukanas vars slutliga nedbrytningsprodukt är Glc4-baserade xyloglukanoligosackarider. Som jämförelse innehåller glykosidhydrolasfamilj 16 (GH16) såväl hydrolytiska endoxyloglukanaser som xyloglukantransglykosylaser (XETs) från växter. För att utreda vad som bestämmer förhållandet mellan transglykosylering och hydrolys i xyloglukanaktiva enzymer från familj GH 16 jämfördes struktur och kinetik hos ett strikt transglykosylas, PttXET16-34 från hybridasp, med ett nära besläktat hydrolytiskt enzym, NXG1 från krasse. I NXG1 identifierades en viktig förlängningsloop, som vid trunkering gav ett muterat enzym med högre transglykosyleringshastighet och minskad hydrolytisk aktivitet. Kinetikstudierna genomfördes med hjälp av nyutvecklade känsliga provmetoder med väldefinerade XGO:er och ett antal kromogena XGO-arylglykosider. En detaljerad förståelse av enzymologin inom GH16 möjliggjorde utvecklingen av en ny kemoenzymatisk metod för biomimetisk fiberytmodifiering med hjälp av PttXET16-34s translgykosyleringsaktivitet. Aminoalditolderivat av xyloglukanoligosackarider användes som nyckelintermediärer för att introducera ny kemisk funktionalitet hos xyloglukan, såsom kromoforer, reaktiva grupper, proteinligander och initiatorer för polymeriseringsreaktioner. Tekniken innebär ett nytt och mångsidigt verktyg för fiberytmodifiering. / Zellulosehaltige Materialien sind die häufigsten erneuerbaren Rohmaterialien auf der Welt. Pflanzenzellwände sind natürliche Kompositmaterialien, sie enthalten kristalline Zellulose, die in einer Matrix aus Hemizellulosen, Proteinen und Lignin eingebettet sind. Xyloglukane sind eine wichtige Gruppe der Hemizellulosen, sie ummanteln und verbinden Zellulose in der pflanzlichen Zellwand. In dieser Abhandlung werden Strukturen von drei Xyloglukanaktiven Enzymen in Beziehung zu ihrer Funktion untersucht. Ein Paradigma für effizienter Nutzung von Biomasse ist das Cellulosom des anaerob lebenden Bakteriums Clostridium thermocellum. Das Cellulosom ist ein hochmolekularer Komplex von Proteinen mit vielen verschiedenen Aktivitäten, darunter ist auch die invertierende Xyloglukan Endohydrolase CtXGH74A. Die Proteinstruktur von CtXGH74A wurde im Komplex mit Xyloglukanoligosacchariden (XGO) gelöst, welche ungeordnete Loops der apo-Struktur stabilisierten. Durch weitere detaillierte Analyse der Kinetik und Reaktionsprodukte konnte schlüssig gezeigt werden, daß CtXGH74A eine Endoglukanase ist, die Glc4-basierte XGO produziert. Im Vergleich dazu enthält die retentierende Glykosidhydrolasefamilie 16 (GH16) sowohl hydrolytische Endoxyloglukanasen als auch Transglykosidasen von Pflanzen. Um zu erklären welche Faktoren das Verhältnis zwischen Transglykosidase und Hydrolase Aktivität bei GH16 Xyloglukanaktiven Enzymen bestimmen wurde eine reine Transglykosidase PttXET16-34 von Hybridaspen mit einem nah verwandten hydrolytischen Enzym NXG1 von Kapuzinerkresse strukturell und kinetisch verglichen. Als Schlüsselstelle wurde eine Verlängerung eines Loops in NXG1 identifiziert, Verkürzung des Loops führte zu einer Mutante mit erhöhter Transglykosylierungsrate bei verminderter hydrolytischer Aktivität. Kinetische Studien wurden erleichtert durch neu entwickelte hochempfindliche Methoden für Aktivitätsmessung, die auf XGO oder chromogene Aryl-XGO als definierte Substrate zurückgreifen. Detailliertes Verständnis von GH16 Enzymologie hat den Weg für die Entwicklung für eine neuartige Methode für biomimetische Oberflächenmodifikation von Zellulosefibern geebnet, dafür wurde die transglykosylierende Aktivität von PttXET16-34 angewendet. Aminoalditol-derivate von XGO wurden als wichtigste Zwischenprodukte angewendet, um neue chemische Funktionalitäten in Xyloglukan einzuführen, darunter waren Chromophore, reaktive Gruppen, Proteinliganden und Initiatoren für Polymerisationsreaktionen. Die modifizierten Xyloglukane wurden an eine Reihe von verschiedenen Zellulosematerialien gebunden und veränderten die Oberflächeneigenschaften dramatisch. Diese Methode ist ein neues wertvolles Werkzeug für Oberflächenmodifikation von Zellulosen. / Cellulosic materials are the most abundant renewable resource in the world; plant cell walls are natural composite materials containing crystalline cellulose embedded in a matrix of hemicelluloses, structural proteins, and lignin. Xyloglucans are an important group of hemicelluloses, which coat and cross-link crystalline cellulose in the plant cell wall. In this thesis, structure-function relationships of a range of xyloglucan-active enzymes were examined. A paradigm for efficient enzymatic biomass utilization is the cellulosome of the anaerobic bacterium Clostridium thermocellum. The cellulosome is a high molecular weight complex of proteins with diverse enzyme activities, including the inverting xyloglucan endo-hydrolase CtXGH74A. The protein structure of CtXGH74A was solved in complex with xyloglucan oligosaccharides (XGOs) which stabilized disordered loops of the apo-structure. Further detailed kinetic and product analyses were used to conclusively demonstrate that CtXGH74A is an endo-xyloglucase that produces Glc4-based XGOs as limit digestion products. In comparison, the retaining glycoside hydrolase family 16 (GH16) contains hydrolytic endo-xyloglucanases as well as xyloglucan transglycosylases (XETs) from plants. To elucidate the determinants of the transglycosylase/hydrolysis ratio in GH16 xyloglucan-active enzymes, a strict transglycosylase, PttXET16-34 from hybrid aspen, was compared structurally and kinetically with the closely related hydrolytic enzyme NXG1 from nasturtium. A key loop extension was identified in NXG1, truncation of which yielded a mutant enzyme that exhibited an increased transglycosylase rate and reduced hydrolytic activity. Kinetic studies were facilitated by the development of new, sensitive assays using well-defined XGOs and a series of chromogenic XGO aryl-glycosides. A detailed understanding of GH16 xyloglucan enzymology has paved the way for the development of a novel chemo-enzymatic approach for biomimetic fiber surface modification, in which the transglycosylating activity of PttXET16-34 was employed. Aminoalditol derivates of XGOs were used as key intermediates to incorporate novel chemical functionality into xyloglucan, including chromophores, reactive groups, protein ligands, and initiators for polymerization reactions. The resulting modified xyloglucans were subsequently bound to a range of cellulose materials to radically alter surface properties. As such, the technology provides a novel, versatile toolkit for fiber surface modification. / QC 20100624

As endo-1,4-?-xilanases (EC 3.2.1.8) formam o maior grupo de enzimas hidrolíticas envolvido na degradação da xilana, visto que catalisam a hidrólise aleatória de ligações glicosídicas do tipo ?-1,4 no interior da sua cadeia principal, produzindo xilooligossacarídeos de diferentes tamanhos. Na natureza, essas enzimas estão intimamente relacionadas ao fornecimento de energia para o desenvolvimento dos organismos que as produzem. Em geral, as xilanases são isoladas preferencialmente de bactérias e fungos, e têm demonstrado grande potencial na produção de pães, ração animal, alimentos, bebidas, xilitol e bioetanol. O presente trabalho propôs o isolamento de uma nova endo-1,4-?-xilanase por meio de técnicas de produção e purificação acessíveis que pudessem viabilizar economicamente a integração desse biocatalisador aos processos industriais. O fungo Aspergillus tamarii Kita, oriundo de uma amostra de solo da Mata Atlântica, mostrou-se um bom produtor de xilanases em meio de cultura Adams suplementado com bagaço de cevada, um subproduto das indústrias cervejeiras. Após a otimização do processo de fermentação submersa, o extrato enzimático exibiu duas xilanases em gel de atividade para proteínas nativas, identificadas por espectrometria de massas como glicosil hidrolases pertencentes às famílias 10 e 11. A sacarificação enzimática de três resíduos agroindustriais, com base em um delineamento experimental de misturas, demonstrou que a combinação ternária desses componentes, em iguais proporções, possui considerável relevância para a produção de açúcares fermentáveis, tais como glicose e xilose. Em ensaios de imobilização, a xilanase GH11 foi satisfatoriamente estabilizada em matrizes de caráter iônico e covalente. A imobilização por ligação covalente multipontual em glioxil-agarose elevou a temperatura ótima de atividade de 60 para 65 °C e ofertou um considerável ganho de termoestabilidade ao derivado, que apresentou meia vida de 60 minutos a 80 °C. Além disso, a estabilização da enzima nesse suporte permitiu a produção dos seguintes xilooligossacarídeos: xilobiose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose. A purificação da xilanase GH11 foi realizada por meio de uma única etapa cromatográfica de troca catiônica, com rendimento final de 36,72% e um fator de purificação de 7,43 vezes. A massa molecular da enzima foi estimada em 19,5 kDa. Ademais, a sua estrutura tridimensional foi predita por modelagem comparativa, exibindo como modelo final uma arquitetura do tipo ?-jelly roll, comum às xilanases da família 11. Em ensaios de caracterização, a xilanase apresentou melhor atividade em pH 5,5 e manteve atividade residual superior a 80% na faixa de pH compreendida entre 4,0 e 9,0, durante 24 horas. Em relação à temperatura, a sua atividade ótima foi observada a 60 °C, contudo, a sua termoestabilidade foi mais expressiva a 50 °C, retendo cerca de 70% da sua atividade inicial por 480 minutos. Para a xilana beechwood, os valores de velocidade máxima e constante de dissociação aparente foram iguais a 1.330,20 µmol/min/mg e 8,13 mg/mL, respectivamente. Na concentração de 5 mM, os metais pesados Co2+, Hg+, Pb2+ e Zn2+ apresentaram um ponderável efeito de inibição sobre a xilanase GH11, enquanto que os íons Ba2+ e Ni2+, assim como os compostos ?-mercaptoetanol e DTT, exibiram um aumento superior a 20% em sua atividade. Por fim, a análise em tempo real da atividade xilanásica revelou que o substrato xilopentaose corresponde ao menor xilooligossacarídeo capaz de ser eficientemente hidrolisado. Sendo assim, a nova endo-xilanase GH11 isolada do fungo A. tamarii Kita exibe uma série de propriedades físico-químicas favoráveis a sua aplicabilidade em escala industrial. / The endo-1,4-?-xylanases (EC 3.2.1.8) form the largest group of hydrolytic enzymes involved in the degradation of xylan, since they catalyze the random hydrolysis of ?-1,4 glycosidic bonds within the main chain of this polysaccharide, producing xylooligosaccharides of different sizes. In nature, these enzymes are closely related to supplying energy for the development of the organisms that produce them. In general, xylanases are preferentially isolated from bacteria and fungi, which show great potential in industries as brewing, animal feed, food, beverage, xylitol and bioethanol. The present work proposed the isolation of a new endo-1,4-?-xylanase by available techniques of production and purification that can economically make feasible the integration of this biocatalyst to industrial processes. The fungus Aspergillus tamarii Kita, obtained from a soil sample of the Atlantic Forest, showed to be a good xylanase producer in Adams culture medium supplemented with barley bagasse, a byproduct of breweries. After the optimization of the submerged fermentation process, the crude enzymatic extract exhibited two xylanases in activity gel for native proteins, identified by mass spectrometry as glycosyl hydrolases belonging to families 10 and 11. The enzymatic saccharification of three agroindustrial residues, based on an experimental mixture design, showed that the ternary combination of these components, in equal proportions, has considerable relevance for the production of fermentable sugars, such as glucose and xylose. The xylanase GH11 was satisfactorily stabilized on matrices of ionic and covalent character in immobilization assays. Covalent multipoint immobilization on glyoxyl agarose raised its optimum temperature of activity from 60 to 65 °C and offered a considerable gain in thermostability to the derivative, which presented a half-life of 60 minutes at 80 °C. In addition, enzyme stabilization on this support allowed the production of the following xylooligosaccharides: xylobiose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose. Xylanase GH11 purification was carried out by means of a single cation exchange chromatographic step, with final yield of 36.72% and purification factor of 7.43 times. The molecular mass of this xylanase was estimated as 19.5 kDa. Moreover, its three-dimensional structure was predicted by comparative modeling, exhibiting a ?-jelly roll type folding as a final model, common to xylanases of family 11. In characterization tests, xylanase presented better activity at pH 5.5 and was considerably stable in the pH range of 4.0 to 9.0. Regarding temperature, its optimum activity was observed at 60 °C, however, its thermostability was more expressive at 50 °C, retaining about 70% of its initial activity for 480 minutes. In the presence of beechwood xylan, the values of maximum velocity and the constant of apparent dissociation were 1,330.20 µmol/min/mg and 8.13 mg/mL, respectively. At concentrations of 5 mM, the heavy metals Co2+, Hg+, Pb2+ and Zn2+showed an inhibition effect on the xylanase, whereas Ba2+ and Ni2+ ions, as well as ?-mercaptoethanol and DTT, exhibited an increase of more than 20% in their activity. Finally, the real-time analysis of xylanase activity revealed that the xylopentose substrate corresponds to the lowest xylooligosaccharide capable of being hydrolyzed. Thus, the new endo-xylanase GH11 isolated from the fungus A. tamarii Kita exhibits a series of physicochemical properties favorable to its applicability on an industrial scale.

The aim of this study was to evaluate the efficacy of heat-treated nickel-titanium reciprocating instruments and complementary techniques in retreatment of flattened canals. Material and methods: Twenty-six mandibular incisors were prepared up to size 25/.08 rotary file and filled using the single-cone technique. Subsequently, the teeth were divided into 3 groups (n=12) according to retreatment procedures: Reciproc Blue: R25 and R40; ProDesign R: PDR 25/.06 and PDR 35/.05; WaveOne Gold: WOG Primary and WOG Medium. The apically extruded material was collected in microtubes and the volume (mm³) was measured by Micro-CT. After this, the specimens received complementary cleaning with XP-Endo Shaper, PUI and 60° oscillatory instrumentation with #30 Hedströem file. Micro-CT scans were performed before and after removing filling material. After quantification of the volume of remaining filling material, the teeth were sectioned and scanning electron microscopy (SEM) images of the cervical, middle and apical thirds were obtained with a 700X magnification, and evaluated by scores based on the amount of filling material in the surface of dentine walls. Results: No reciprocating instrument promoted complete removal of filling material. All systems showed extrusion, however, WOG25 presented the higher extrusion of material (P<.05). XP-Endo Shaper significantly reduced the amount of filling material in the apical and middle thirds (P<.05). In the SEM analysis, there was no statistical difference among the cleaning methods (P> .05). Conclusions: The reciprocating instruments studied did not promote complete removal of root canal filling materials. XP-Endo Shaper, used as a complementary instrument in retreatment, improved removal of filling material. / O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de instrumentos reciprocantes em níquel-titânio tratados termicamente e métodos complementares no retratamento de dentes com raízes achatadas. Materiais e métodos: Trinta e seis incisivos inferiores foram preparados com instrumentos rotatórios até o diâmetro 25./08 e obturados pela técnica do cone único. Em seguida, os dentes foram divididos em 3 grupos (n=12) de acordo com os sistemas utilizados para desobturação no retratamento: Reciproc Blue: R25 e R40; ProDesign R: PDR 25./06 e PDR 35/.05; WaveOne Gold: WOG Primary e WOG Medium. O material extruído apicalmente foi coletado em microtubos e o volume (mm³) foi mensurado com Micro-CT. Na sequência, os espécimes receberam limpeza complementar com XP-Endo Shaper ou com irrigação passiva ultrassônica (PUI) ou com instrumentação com lima #30 Hedströem em movimento oscilatório. Escaneamentos em Micro-CT foram realizados antes e após a remoção do material obturador. Após quantificação do volume de remanescente de material obturador, os dentes foram seccionados e imagens com microscópio eletrônico de varredura (MEV), dos terços cervical, médio e apical, foram obtidas com aumento de 700X, e avaliadas através de escores baseados na quantidade de material obturador remanescente nas paredes dentinárias. Resultados: Nenhum instrumento reciprocante promoveu remoção completa do material obturador. Todos os sistemas demonstraram extrusão, no entanto, WOG25 proporcionou maior extrusão (P<.05). XP-Endo Shaper reduziu significantemente a quantidade de material obturador nos terços médio e apical (P<.05). Na análise da limpeza das paredes dentinárias, em MEV, não houve diferença estatística entre os métodos de limpeza (P>.05). Os instrumentos reciprocantes estudados não promoveram a remoção completa do material obturador. XP-Shaper, utilizado como instrumento complementar no retratamento, aumentou a remoção de material obturador.