No presente estudo, a diversidade bacteriana endofítica fixadora de nitrogênio foi pesquisada utilizando métodos microbiológicos e moleculares. Isolaram-se microrganismos de raiz, caule e folha de cana-de-açúcar. Análises por seqüenciamento do 16S rDNA identificaram 150 endófitos. No total, foram identificados 18 gêneros. Destes, apenas 4 estavam presentes em cana-de-açúcar submetida aos 3 tratamentos. A maior diversidade de gêneros foi encontrada em cana sob adubação orgânica: 10 gêneros, em cana sob adubação inorgânica foram 11 gêneros e 8 em cana sem adubação. A maior parte dos gêneros pertence à família Enterobacteriaceae, como Klebsiella, Pantoea e Enterobacter. A enzima endoglicanase foi produzida por 82% dos isolados de cana sob adubação orgânica, (54%) inorgânica e (48%) sem adubação. Quanto à atividade de pectinase: 42%, 60% e 36% foram apresentadas por isolados de cana orgânica, inorgânica e sem adubação, respectivamente. A capacidade de solubilizar fosfatos inorgânicos foi detectada em 76,6% dos isolados, sendo a maior capacidade de solubilização de fosfatos encontrada em bactérias isoladas de cana-de-açúcar sob adubação orgânica (71%), de cana submetida a adubação convencional (78%) e sem adubação (88%). Foram realizados estudos de colonização em plântulas de cana-de-açúcar com 4 endofitos geneticamente modificados (EGMs) capazes de expressar os genes gfp e dsred. A avaliação da colonização na cana pela microscopia de fluorescência, mostrou que os (EGMs) gfp e dsred colonizaram as raízes e caules das plantas inoculadas, sem causar qualquer sintoma de doença. / In the present study, endophytic bacterial diversity has been searched using both microbiologic and molecular methods. Microorganisms were isolated from sugarcane root, shoot and leaf. 150 isolates were identified by 16S rDNA sequencing. 18 genera were found and only 4 were present in sugarcane submitted to the three treatments. The greatest genera diversity was found in sugarcane submited to organic fertlization: 10 genera in sugarcane submitted to inorganic fertilization were found 11 genera and 8 genera in sugarcane without fertilization. Great part of the found genera belongs to the Enterobacteriaceae family: Klebsiella, Pantoea and Enterobacter. Some physiological characteristics were determined in the isolates. Endoglucanase was produced by 82% of the isolates from sugarcane submitted to organic fertilization. Lower activities were found in bacteria isolated from inorganic fertilization and no fertilization, respectively 54% and 48%. As far as pectinase activity is concerned, a percentage of 42%, 60% and 36% was presented by the isolates from organic fertilization, inorganic fertilization and no fertilization, respectively. The hability of phosphate solubilization was detected in 76.6% of the isolates. In sugarcane under organic fertilization a percentage of 71% was found, in bacteria from inorganic fertilization, 78%, and without fertilization, 88%. Plant colonization was determined using sugarcane plantlets inoculated with four genetically modified bactéria (GMEs), able to express the genes gfp and dsred. The colonization was evaluated by fluorescence microscopy, which showed that the endophytic bacteria expressing gfp and dsred genes had invaded roots and shoots from inoculated plants, without causing any disease symptom.

Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos / Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In southern Brazil is unknown the effect of diazotrophs inoculation in sugarcane (Saccharum officinarum). The evaluation of this practice and the selection of genotypes with high potential for biological N fixation (BNF) are essential for obtaining high yields of sugarcane in Rio Grande do Sul (RS). This study investigated the effect of diazotrophic bacteria inoculation and nitrogen fertilization on growth and productivity of sugarcane genotypes in RS. Two experiments were carried out in field conditions. In the experiment I, conducted in São Francisco de Assis/RS, the RB835089 genotype was grown on a Quartzipsament soil with and no-inoculation under two nitrogen levels (0 and 120 kg N ha-1). In the second experiment, conducted in Jaguari/RS on a Hapludalf, 10 genotypes were evaluated (RB835054, RB855156, RB925211, RB925345, RB986419, RB867515, RB975038, RB945177, RB947625 and RB987935) in three managements: nitrogen fertilization (120 kg N ha-1), without N and diazotrophic bacteria inoculation and control (without N and no-inoculation). In both experiments the diazotrophic bacteria inoculation in stems of genotypes was conducted with Embrapa-Agrobiology inoculant, composed of five diazotrophic strains. The evaluated parameters were: biometric variables, dry matter and total nitrogen accumulation and stems productivity. In the first experiment, inoculation increased growth and N accumulation. The stems productivity of the RB835089 inoculated was similar to the treatment that received nitrogen and was 50% higher than the control. In experiment II, sugarcane productivity ranged from 57 to 118 Mg ha-1. Four genotypes did not respond to fertilization and inoculation. Tillering was the variable most responsive to diazotrophic bacteria inoculation with a direct influence on the stems productivity. The response to inoculation varied among genotypes and was observed in genotypes RB855156, RB945177 and RB947625. These genotypes showed stems productivity that exceeded those of the control treatment, respectively, in 13 (18%), 21 (36%) and 13 (22%) Mg ha-1. The results of this study indicate that diazotrophic bacteria inoculation increases the stems productivity of the cane plant in responsive genotypes to practice, saving of nitrogen fertilizer through BNF. / Na região sul do Brasil é desconhecido o efeito da inoculação de bactérias diazotróficas em cana-de-açúcar (Saccharum officinarum). A avaliação desta prática e a seleção de genótipos com elevado potencial de fixação biológica de N (FBN) é indispensável para obtenção de altos rendimentos de cana no Rio Grande do Sul (RS). O presente trabalho objetivou estudar o efeito da inoculação de bactérias diazotróficas e da adubação nitrogenada sobre o crescimento e a produtividade de genótipos de cana-de-açúcar no RS. Foram realizados dois experimentos de campo. No experimento I, realizado no município de São Francisco de Assis/RS, o genótipo RB835089 foi cultivado em Neossolo Quartzarênico distrófico com e sem inoculação sob dois níveis de adubação nitrogenada (0 e 120 kg ha-1 de N). No experimento II, realizado no município de Jaguari/RS o solo foi um Argissolo Vermelho distrófico arênico, onde foram avaliados 10 genótipos (RB835054, RB855156, RB925211, RB925345, RB986419, RB867515, RB975038, RB945177, RB947625 e RB987935) sob três formas de manejo: com adubação nitrogenada (120 kg de N ha-1), sem N e com inoculação de bactérias diazotróficas e testemunha (sem N e sem inoculação). Nos dois experimentos a inoculação das bactérias diazotróficas nos colmos dos genótipos foi realizada com inoculante da Embrapa-Agrobiologia, composto por cinco estirpes diazotróficas. Foram avaliadas variáveis biométricas de crescimento, massa seca e nitrogênio total acumulado e a produtividade de colmos. No experimento I, a inoculação promoveu aumento no crescimento e no acúmulo de N. O genótipo RB835089 inoculado apresentou produtividade de colmos semelhante ao tratamento que recebeu adubação nitrogenada e superou a testemunha em 50%. No experimento II, a produtividade de cana planta variou de 57 a 118 Mg ha-1. Entre os genótipos avaliados quatro não responderam a adubação e nem a inoculação. O perfilhamento foi a variável mais responsiva a inoculação de bactérias diazotróficas com influência direta na produtividade de colmos. A resposta à inoculação variou entre os genótipos avaliados, sendo observada resposta ao inoculante nos genótipos RB855156, RB945177 e RB947625. Esses genótipos apresentaram produtividade de colmos que superaram aquelas dos tratamentos testemunhas em 13 (18%), 21 (36%) e 13 (22%) Mg ha-1, respectivamente. Os resultados do presente trabalho indicam que a inoculação de bactérias diazotróficas aumenta a produtividade de colmos de cana planta em genótipos responsivos a essa prática, gerando economia de fertilizante nitrogenado através da FBN.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-29T13:49:53Z No. of bitstreams: 1 Andresa Priscila Souza Ramos.pdf: 3687585 bytes, checksum: 03a2a3149474293923ca08c0db68bc60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T13:49:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andresa Priscila Souza Ramos.pdf: 3687585 bytes, checksum: 03a2a3149474293923ca08c0db68bc60 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / The association between bacteria and plants is considered extremely important because it may promote the plant development by providing nutrients, protection, and production of plant growth promoting substances like indole acetic acid (IAA). The sugarcane production is under a great economic and agricultural importance, and increasing its production still depending on several chemical inputs that are expensive and environmentally damaging. A sustainable alternative is the use of beneficial bacteria that may diminish or abolish the use of these inputs and increase agricultural production. Therefore, the objectives of this study were: i) selecting and evaluating IAA producing bacteria, dependent and independent pathway of tryptophan, sugarcane roots plant association in crop fields in Pernambuco, ii) evaluate the influence of niche isolation, the place of cultivation, the cultivation time and host plant genotype on frequency and IAA-producing bacteria; iii) Analyze the genetic variability of IAA-producing bacteria by BOX-PCR, and iv) assess the noncultivable bacterial community sugarcane ratoon-associated v) Evaluate the production of IAA, two endophytic bacteria according to the time. Isolates were studied at four and ten months sugarcane plant cultivation, collected in EECAC Carpina-PE and Petribú factory,Lagoa de Itaenga-PE and isolates from three months on sugarcane plant-ratoon regrowth, collected in EECAC. The results showed that plants from sugarcane crop fields in Pernambuco have a high frequency of bacteria producing IAA in vitro by a tryptophan-dependent and independent pathways, the crop place, cultivation time of the host plant and niche colonization. Bacterial influence on the distribution of IAA-producing bacteria. In addition, the location, time of cultivation of the host plant genotype and bacterial niche colonization influenced the production levels. The strains showed high genetic variability. In sugarcane plant-ratoon, the bacterial population density was higher than in the rizhosphericsoil and root-endophytic bacteria also showed a high frequency capacity to produce IAA in vitro. Analysis of variability and genetic diversity revealed high genetic variability among bacteria producing IAA and the predominance of dominant bacterial groups not grown in soil and inside the roots of sugarcane plant-ratoon grown in Pernambuco. Some strains of root endophytic sugarcane plant, with capacity to produce IAA, were identified as belonging to the genus Enterobacter and Burkholderia / A associação entre bactérias benéficas e plantas é considerada extremamente importante, pois pode promover o desenvolvimento do vegetal através da disponibilização de nutrientes, proteção e produção de substâncias promotoras de crescimento vegetal, como o ácido indol acético (AIA). A canade- açúcar é uma cultura de grande importância agrícola e econômica, e sua produção crescente ainda depende de diversos insumos químicos que são onerosos e prejudicam o ambiente. Uma alternativa sustentável seria a utilização de bactérias benéficas que possam diminuir ou anular o uso desses insumos e incrementar a produção agrícola. Diante disso, os objetivos deste trabalho foram: i) selecionar e avaliar bactérias produtoras de AIA, via dependente e independente de triptofano, associadas a raízes de plantas de cana-de-açúcar cultivadas em Pernambuco; ii) avaliar a influência dos nichos de colonização, do local e tempo de cultivo e do genótipo da planta hospedeira sobre a frequência e produção de bactérias produtoras de AIA; iii) analisar a variabilidade genética de bactérias produtoras de AIA por BOX-PCR; iv) avaliar a comunidade bacteriana não cultivável associada a cana soca; v) e avaliar a produção de AIA, de duas bactérias endofíticas, em função do tempo. Foram estudadas bactérias isoladas aos quatro e dez meses de cultivo de cana planta, coletadas na EECAC- Carpina-PE e na Usina Petribú- Lagoa de Itaenga-PE e linhagens isoladas aos três meses de rebrota na cana soca, coletadas na EECAC. Os resultados demonstraram que as plantas de cana-deaçúcar cultivadas em Pernambuco apresentam alta frequência de bactérias com capacidade de produzir AIA in vitro, via dependente e independente de triptofano, e que o local, tempo de cultivo da planta hospedeira e o nicho de colonização bacteriana influenciaram na distribuição das bactérias produtoras de AIA. Além disso, o local, tempo de cultivo, genótipo da planta hospedeira e o nicho de colonização bacteriana influenciaram nos níveis de produção e as linhagens apresentaram alta variabilidade genética. Na cana soca, a densidade populacional bacteriana foi maior no solo rizosférico do que endofítica de raiz e também apresentaram alta frequência de bactérias com capacidade de produzir AIA in vitro. A análise da variabilidade e diversidade genética revelaram alta variabilidade genética entre as bactérias produtoras de AIA e a predominância de grupos bacterianos dominantes, não cultivados, no solo e no interior das raízes de cana soca, cultivadas em Pernambuco. Algumas linhagens endofíticas de raiz de cana planta, com capacidade de produzir AIA, foram identificadas como pertencentes aos gêneros Burkholderia e Enterobacter

Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos / Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

No presente estudo, a diversidade bacteriana endofítica fixadora de nitrogênio foi pesquisada utilizando métodos microbiológicos e moleculares. Isolaram-se microrganismos de raiz, caule e folha de cana-de-açúcar. Análises por seqüenciamento do 16S rDNA identificaram 150 endófitos. No total, foram identificados 18 gêneros. Destes, apenas 4 estavam presentes em cana-de-açúcar submetida aos 3 tratamentos. A maior diversidade de gêneros foi encontrada em cana sob adubação orgânica: 10 gêneros, em cana sob adubação inorgânica foram 11 gêneros e 8 em cana sem adubação. A maior parte dos gêneros pertence à família Enterobacteriaceae, como Klebsiella, Pantoea e Enterobacter. A enzima endoglicanase foi produzida por 82% dos isolados de cana sob adubação orgânica, (54%) inorgânica e (48%) sem adubação. Quanto à atividade de pectinase: 42%, 60% e 36% foram apresentadas por isolados de cana orgânica, inorgânica e sem adubação, respectivamente. A capacidade de solubilizar fosfatos inorgânicos foi detectada em 76,6% dos isolados, sendo a maior capacidade de solubilização de fosfatos encontrada em bactérias isoladas de cana-de-açúcar sob adubação orgânica (71%), de cana submetida a adubação convencional (78%) e sem adubação (88%). Foram realizados estudos de colonização em plântulas de cana-de-açúcar com 4 endofitos geneticamente modificados (EGMs) capazes de expressar os genes gfp e dsred. A avaliação da colonização na cana pela microscopia de fluorescência, mostrou que os (EGMs) gfp e dsred colonizaram as raízes e caules das plantas inoculadas, sem causar qualquer sintoma de doença. / In the present study, endophytic bacterial diversity has been searched using both microbiologic and molecular methods. Microorganisms were isolated from sugarcane root, shoot and leaf. 150 isolates were identified by 16S rDNA sequencing. 18 genera were found and only 4 were present in sugarcane submitted to the three treatments. The greatest genera diversity was found in sugarcane submited to organic fertlization: 10 genera in sugarcane submitted to inorganic fertilization were found 11 genera and 8 genera in sugarcane without fertilization. Great part of the found genera belongs to the Enterobacteriaceae family: Klebsiella, Pantoea and Enterobacter. Some physiological characteristics were determined in the isolates. Endoglucanase was produced by 82% of the isolates from sugarcane submitted to organic fertilization. Lower activities were found in bacteria isolated from inorganic fertilization and no fertilization, respectively 54% and 48%. As far as pectinase activity is concerned, a percentage of 42%, 60% and 36% was presented by the isolates from organic fertilization, inorganic fertilization and no fertilization, respectively. The hability of phosphate solubilization was detected in 76.6% of the isolates. In sugarcane under organic fertilization a percentage of 71% was found, in bacteria from inorganic fertilization, 78%, and without fertilization, 88%. Plant colonization was determined using sugarcane plantlets inoculated with four genetically modified bactéria (GMEs), able to express the genes gfp and dsred. The colonization was evaluated by fluorescence microscopy, which showed that the endophytic bacteria expressing gfp and dsred genes had invaded roots and shoots from inoculated plants, without causing any disease symptom.

A cana-de-açúcar é um dos cultivos mais importantes no Brasil. Estima-se que uma parte do nitrogênio total de algumas variedades de cana-de-açúcar seja obtida pela interação com microrganismos endofíticos diazotróficos. Na maior parte de sua vida, os endofíticos habitam o interior de plantas sem causar nenhum sintoma aparente de doença. O estudo de interação microrganismos/plantas foi realizado utilizando-se co-culturas entre bactérias endofíticas diazotróficas e calos de cana-de-açúcar. Em presença do calo: Enterobacter sp. ICB113, ICB117 e ICB481 foram estimuladas e mantidas em elevadas populações; Klebsiella sp. ICB375 e Pseudomonas sp. ICB383 tiveram seu número reduzido e mantiveram-se em números estáveis; e Pantoea sp. ICB409 foi totalmente eliminada, demonstrando, assim, que a planta exerce um controle sobre os microrganismos. O modelo calo de cana-de-açúcar/bactéria endofítica diazotrófica foi capaz de evidenciar diferentes interações entre vegetal e bactéria, assim como, diferentes níveis de resposta de defesa da célula vegetal. / The sugarcane is one of the most important crops in Brazil. It is estimated that a portion of the total nitrogen of some varieties of sugarcane is obtained by interaction with diazotrophic endophytic microorganisms. In most of his life, the endophytes inhabit the interior of plants without causing any obvious signs of disease. The interaction study microorganisms/plants was performed using co-cultures among endophytic diazotrophic bacteria and sugarcane calluses. In the presence of callus : Enterobacter sp . ICB113 , ICB117 and ICB481 were stimulated and maintained in large populations ; Klebsiella sp . ICB375 and Pseudomonas sp. ICB383 had their numbers reduced and remained in stable numbers, and Pantoea sp. ICB409 was completely eliminated, thus demonstrating that the plant has a control over microorganisms. The model sugarcane callus/endophytic diazotrophic bacteria was able to show different interactions between plants and bacteria , as well as different levels of defense response of the plant cell.

Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:57:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4754.pdf: 2758448 bytes, checksum: d835472f08e0eb0186e418b47de028a5 (MD5) Previous issue date: 2012-08-02 / The endophytic microorganisms inhabit the interior of the plants, being found in organs and tissues such as leaves, stems and roots without causing disease or producing visible external structures. The endophytic community consists mainly of bacteria and fungi that unlike pathogens, can benefit the plants, however, depending on conditions such as interaction between bacterial communities, competition for nutrients, it can become pathogenic. The endophytic community has been evaluated in many plants, especially in studies with diazotrophic bacteria. In this study, endophytic bacterial diversity of leaves, stems and roots of physic nut (Jatropha curcas) were studied using morphologic, physiological, biochemical and molecular markers, such as 16S rDNA. The samples were disinfected (removing epiphytic microorganisms), macerated and serially diluted to obtain the suspensions that were inoculated into culture media selective for diazotrophic microorganisms. The plates were incubated at 30°C for seven days. Forty-six colonie s were isolated, with 19 in the leaves, 11 in the stems and 16 in the roots. DNA of these endophytic bacteria purified was isolated, purified and the Y1-16S805 portion of the 16S rRNA gene was amplified and sequenced. Analysis of sequence identity were made by the programs BLASTn, CLUSTALW and phylogenetic analyzes by MEGA5. The roots showed greater diversity of endophytic microorganisms, with seven of the eight genera identified. In the leaves and in the stem, six genera were identified, respectively. In leaves, the exception was the genus Salmonella and Serratia. In the stem, Serratia, and in the roots more than one species of the genera Acinetobacter were found. The genera Bacillus and Burkholderia were found more frequently in all regions sampled. The genus Bacillus in the leaves, stems and roots accounted 20, 4 and 4%, respectively, of the total endophytic microorganisms identified. From the total isolates of the genus Bacillus, 73% belonged to the species B atrophaeus, B. brevis and B. sphaericus, the other 27% belonged to group B. cereus. These results suggest that the endophytic bacteria diversity of physic nut is large. Microorganisms identified in this work have potential for growth promotion, biological control and nitrogen fixation, as they were isolated in selective media with low concentration of nitrogen, in addition there are reports in the literature about the benefits of them for different plants. / Os microrganismos endofíticos habitam o interior das plantas, sendo encontrados em órgãos e tecidos como folhas, caules e raízes sem causar doenças ou produzir estruturas externas visíveis. A comunidade endofítica é constituída principalmente por bactérias e fungos que ao contrário dos patogênicos, podem beneficiar as plantas, entretanto, dependendo das condições como interação entre comunidades bacterianas, competição por nutrientes, pode se tornar patogênica. A comunidade endofítica tem sido avaliada em muitas plantas, principalmente nos estudos com bactérias diazotróficas. No presente estudo, a diversidade bacteriana endofítica de folhas, colmos e raízes do pinhão manso (Jatropha curcas) foram estudadas utilizando marcadores morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e molecular do tipo 16S rDNA. As amostras foram desinfectadas para eliminar os microrganismos epifíticos, maceradas e diluídas em série para a obtenção das suspensões, que foram inoculadas em meios de cultura seletivos para microrganismos diazotróficos. As placas foram incubadas a 30°C por sete dias. Quarenta e seis colônias de bactérias endofíticas purificadas foram isoladas sendo 19 nas folhas, 11 no caule e 16 nas raízes. O DNA dessas estirpes foi isolado, purificado e a porção Y1-16S805 do gene 16S rRNA foi amplificada e sequenciada. Análises de identidade das sequências foram feitas pelos programas BLASTn, CLUSTALW e análises filogenéticas pelo MEGA5. As raízes apresentaram maior diversidade de microrganismos endofíticos, com sete dos oito gêneros identificados. Nas folhas e no caule foram identificados seis gêneros, respectivamente. Nas folhas, a exceção foi os gêneros Salmonella e Serratia, no caule Serratia, já nas raízes foi o gênero Acinetobacter. Os gêneros Bacillus e Burkholderia foram encontrados com maior frequência em todas as regiões amostradas. O gênero Bacillus nas folhas, caule e raízes representou 20, 4 e 4%, respectivamente, do total de microrganismos endofíticos identificados. Do total de isolados do gênero Bacillus, 73% pertenciam as espécies B atrophaeus, B. brevis e B. sphaericus, os outros 27% pertenciam ao grupo B. cereus. Esses resultados sugerem que a diversidade bactériana endofítica do pinhão manso é grande. Os organismos identificados nesse trabalho têm potencial para promoção de crescimento, controle biológico e fixação de nitrogênio, por serem isolados em meios seletivos com baixa concentração de nitrogênio, além de existirem relatos na literatura sobre os benefícios dos mesmos para diferentes plantas.

Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants