Magíster en Bioquímica en el área de especialización en Bioquímica Clínica Aplicada / Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / En los últimos años, las células troncales han surgido como una promisoria alternativa de terapia regenerativa en la búsqueda de nuevas estrategias para abordar distintas patologías que involucran un daño celular y la consecuente disfunción de un tejido u órgano. En el caso del sistema nervioso central, el recambio celular se encuentra sustentado sobre una población de células multipotentes denominadas células troncales neurales (CTN). Recientes estudios sugieren que este tipo células troncales está presente en la médula espinal, donde el nicho neurovascular jugaría un rol protagónico en la regulación funcional de CTN presentes a través de moléculas angiogénicas y su señalización. En este contexto, las angiopoyetinas (Angs) han sido relacionadas con mecanismos de neuroprotección y/o neurogénesis en zonas encefálicas, aunque se desconoce su eventual participación en médula espinal (ME). Sobre la base de estos antecedentes, esta tesis postula que “Angiopoyetina 1 (Ang1) estimula la diferenciación de CTN aisladas de médula espinal, de manera independiente a su receptor Tie2”. Para evaluar este postulado se generaron cultivos de neuroesferas a partir de ME de ratones, las cuales fueron validadas como modelo de CTN sobre la base de su potencial de proliferación y diferenciación. En estas neuroesferas se detectó la expresión del mRNA de Ang1, sin embargo fue imposible detectar el mRNA del receptor Tie2 tanto en condiciones proliferativas, como de diferenciación. Finalmente se estudió el eventual rol de Ang1 sobre las CTN, para lo cual se agregó Ang1 recombinante sobre los cultivos, y se evaluaron cambios en los patrones de expresión de los marcadores diferenciación. Los resultados obtenidos indican que las células tratadas con con Ang1 mantendrían la expresión, del marcador de troncalidad, SOX2, en comparación a células con el mismo tiempo de diferenciación, pero sin tratamiento. Paralelamente se observó una disminución de la diferenciación astrocítica, reflejada en la baja de la expresión de GFAP. Los resultados de este proyecto podrán entregar valiosa información respecto de los mecanismos involucrados en la regulación funcional de CTN en ME y constituir la base de estrategias dirigidas a la posible modulación de un evento de regeneración en este tejido. / Over the past few years, stem cells have emerged as one promissory alternative of regenerative therapy in the discovery of new therapies to overcome different pathologies than induce tissue or organ malfunction, due to cellular damage. In the case of central nervous system, cellular renewal is sustained by a population of multipotent cells known as neural stem cells (NSC). Recent studies suggest this type of cells are present on the spinal marrow, where the neurovascular center would have an important role on the regulation of the present NSC, through the signaling of angiogenic molecules. In this context, angiopoietins (Angs) have been related with mechanisms of neuroprotection and/or neurogenesis in encephalic zones, although their possible participation in the spinal marrow (SM) is unknown. Considering this background, this thesis postulates that “Agiopoietin 1 (Ang1) stimulates the differentiation of neural stem cells (NSC) isolated from spinal marrow, in a Tie2 receptor independent way”. To evaluate this assumption, neurospheres cultures were grown from mice SM, which were validated as a model of NSC due to their ability to proliferate and differentiate. On these neurospheres, the expression of Ang1 mRNA was detected, however, detection of Tie2 receptor mRNA was impossible, neither on proliferation or differentiation conditions. Finally, the possible role of Ang1 over NSC was studied. In order to do this, recombinant Ang1 was added to the obtained cultures and changes on expression patterns of neural differentiation markers were evaluated. The obtained results indicate that the Ang1 treatment would remain stemness, measure by SOX2 expression, in comparison to cells with the same time of differentiation, but without treatment. At the same time, a decrease in astrocytic differentiation was observed, reflected by the low expression of GFAP. The results of this project may deliver valuable information with respect of the possible mechanisms involved in functional regulation of NSC in SM and, constitute the foundations for directed strategies to the possible modulation of regeneration events on this tissue

Doctor en Bioquímica / La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o desórdenes inflamatorios. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito. El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT, en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta. Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2. Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs. Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana, mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281 y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína. Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos. En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por infecciones tripanosómicas / Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders. Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell. It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin, interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T. cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay, which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with several strains of the parasite. The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT), and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment. The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20- 191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281 and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line. The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate the antiangiogenic gene expression. In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions induced by trypanosomic infections

Orientador: Thais Borges Cesar / Resumo: Objetivos: Investigar o efeito da associação entre um padrão saudável alimentar e a ingestão regular do suco de laranja sobre a função endotelial vascular e parâmetros clínico-nutricionais em indivíduos com síndrome metabólica. Material e Métodos: Estudo clínico randomizado de grupos paralelos, com intervenção dietética de curto prazo. A idade média foi de 48±9 anos, sendo 69% mulheres e 31% homens. Os voluntários foram alocados randomicamente nos grupos: Controle (n=34) e Suco de Laranja (n=34), sendo que todos receberam orientação nutricional para uma dieta saudável. Os indivíduos do grupo Suco de Laranja receberam concomitantemente à dieta 500 mL/dia de suco de laranja 100%. Ao longo de 12 semanas foram realizadas: (1) avaliação antropométrica, (2) avaliação dietética, (3) avaliação bioquímica, (4) avaliação da função endotelial vascular, e (5) risco cardiovascular global. Resultados: Após as 12 semanas de intervenção dietética e suco de laranja foram detectadas para ambos os grupos uma redução média significativa de 2% no peso corporal, 3% no IMC, 5% na massa gorda, 6% na circunferência da cintura e 4% na gordura visceral, sem contudo alterar a massa magra. No grupo Controle foi detectada redução significativa no HDL-C (-10%). Os parâmetros da função endotelial vascular mostraram redução média para ambos os grupos da pressão arterial sistólica e diastólica (-8% e -9%, respectivamente), e melhorias na função endotelial vascular. Além disso, houve redução do risco cardiovas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

A formação de novos vasos sanguíneos é fundamental para o crescimento tumoral e a disseminação metastática, sendo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) uma das chaves reguladoras deste processo. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão imunohistoquímica de VEGF nos hemangiossarcomas e hemangiomas esplênicos, e rever a prevalência das demais afecções esplênicas através da análise retrospectiva do diagnóstico histopatológico de cães submetidos à esplenectomia. Os resultados foram confrontados com os exames laboratoriais, as manifestações clínicas, a presença de arritmias cardíacas e de hemoperitôneo. Participaram do estudo retrospectivo 109 cães atendidos no Serviço de Cirurgia de Pequenos Animais do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, entre os anos de 2002 e 2009. A média de idade foi de 10 anos (± 3), não foi observado predileção sexual. Cães sem raça definida foram os mais acometidos, com peso médio de 22 kg (± 13). Cinqüenta e dois por cento (57/109) dos animais foram esplenectomizados devido a afecções não neoplásicas, enquanto que 48% (52/109), por neoplasias esplênicas. Dentre estes, o diagnóstico mais freqüente foi o hemangiossarcoma, acometendo 28 (54%) animais. Os sintomas mais freqüentes foram disorexia, apatia e emese. Cães com neoplasias malignas apresentaram níveis de hematócrito e hemácias significativamente menores que os acometidos por massas benignas. Do mesmo modo, a presença de hemoperitôneo, secundário à ruptura esplênica, correlacionou-se significativamente com a presença de neoplasia maligna. Arritmias cardíacas não foram fatores preditivos para a diferenciação da esplenomegalia. A avaliação imunohistoquímica da expressão tecidual de VEGF foi realizada em 23 hemangiossarcomas e 7 hemangiomas, revelando-se significativamente maior nas neoplasias malignas. Tal resultado sugere que a expressão deste fator pode estar relacionada à proliferação maligna observada nos hemangiossarcomas. / New blood vessel formation is a fundamental event in the process of tumor growth and metastatic dissemination, being the vascular endothelial growth factor (VEGF) one of the key regulators of this process. The aim of this study was evaluate the VEGF immunohistochemical expression in splenic hemangiosarcomas and hemangiomas, and review the prevalence of canine splenic disorders through retrospective analysis of histological diagnosis after splenectomy. The results were confronted with laboratory findings, clinical signs and presence of cardiac arrhythmia and hemoperitoneum. A hundred nine dogs were included in the retrospective study at Veterinary Hospital of School of Veterinary Medicine, University of Sao Paulo, between 2002 and 2009. The average age was 10 year ± 3, without sexual predilection. Mix breeds were the most frequent, and average weigh was 22kg ± 13. Overall, 52% (57/109) of dogs were splenectomized for nonneoplastic disease, although 48% (52/109) were splenectomized for neoplasia. Among these dogs the most common diagnosis was hemangiossarcoma (28 dogs, 54%). Frequently clinical signs included anorexia, lethargy and vomiting. Dogs with malignant neoplasia had significantly lower red blood cells counts and packed cell volume compared with values for dogs with benign masses. Similarly, hemoperitoneum secondary to splenic rupture had a significant correlation with malignant tumor. Cardiac arrhythmia was not useful in differentiating dogs with splenomegaly. Expression of vascular endothelial growth factor was made by immunohistochemical analyses in 23 hemangiosarcomas and 7 hemangiomas being significantly higher in malignant tumor. These data suggest that VEGF expression may contribute to malignant proliferation of hemangiossarcoma.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:15Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12959.pdf: 1645113 bytes, checksum: 2836abcccc356e427c13763a5a6f708c (MD5) / Objetivo: Analise do fator de crescimento vasculo-endotelial (VEGF) como marcador sorologico no diagnostico da gravidez ectopica. Outrossim, e desiderato deste projeto avaliar se as variantes polimorficas -460 T/C (rs833061), -634 C/G (rs2010963) e +936 C/T (rs3025039) do gene do VEGF podem estar associadas a ocorrencia da gravidez ectopica (GE). Alem disso, procuramos avaliar se os niveis sericos de VEGF estavam correlacionados com o genotipo. Metodo: estudo caso-controle, onde foram selecionadas 35 pacientes com diagnostico de gravidez ectopica, 15 abortamentos e 22 gestacoes intra-uterinas normais. Foram coletados 10 mL de sangue em tubo seco, centrifugados a 2000 rpm e o sobrenadante foi separado em cinco aliquotas de 200 £gL e armazenados a -80 o C, para posterior avaliacao. A dosagem serica do VEGF foi realizada por metodo de ELISA - (human VEGF; R&D systems, Minneapolis). Para a avaliacao dos polimorfismos do gene do VEGF foram incluidas 74 pacientes com historia previa ou em vigencia de GE, em acompanhamento no Ambulatorio de GE da UNIFESP. O grupo controle foi constituido de 134 mulheres na menopausa, com pelo menos duas gestacoes normais, sem abortos ou GE durante a menacme, em seguimento no Ambulatorio de Climaterio da UNIFESP. Foram coletados 10 mL de sangue periferico, retirado buffy-coat, do qual e extraido DNA genomico pela tecnica de DTAB / CTAB. A genotipagem foi realizada digerindo os produtos de PCR com as enzimas de restricao especificas para os polimorfismos do gene de VEGF +936 C/T, -634 C/G e -460 C/T. Os dados foram analisados pelo teste ƒÓ2 ou teste exato de Fisher, sendo considerado significante p<0,05. Resultados: Nos casos estudados a media dos valores sericos do VEGF foi de 297,5 pg/mL na gravidez ectopica, 299,6 pg/mL no abortamento e de 39,9 pg/mL nas gestacoes intra-uterinas normais (p<0,0001). Nao foram identificadas diferencas significantes quanto as frequencias genotipicas e alelicas para os polimorfismos do gene do VEGF +936 C/T (p=0,28), -460 C/T (p=0,70) e -634 G/C (p=0,17). Nao foi identificada relacao entre os valores sericos de VEGF e os genotipos para nenhum dos polimorfismos de VEGF testados. Conclusao: Nossos resultados sugerem que na gravidez ectopica sejam detectados valores sericos mais elevados de VEGF do que na gravidez intra-uterina viável. Por outro lado, quando comparamos os valores de VEGF na gravidez ectópica com os casos de abortamento, não encontramos diferença estatisticamente significante. Não foi identificada associação entre a expressão de polimorfismo +936 C/T, -634 C/G e -460 C/T do gene do VEGF e nem de seus alelos com a ocorrência de gravidez ectópica. Não foi identificada relação entre os níveis séricos de VEGF e os genótipos para nenhum dos polimorfismos de VEGF testados. A produção de VEGF sérico parece não ter correlação com o genótipo. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A formação de novos vasos sanguíneos é fundamental para o crescimento tumoral e a disseminação metastática, sendo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) uma das chaves reguladoras deste processo. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão imunohistoquímica de VEGF nos hemangiossarcomas e hemangiomas esplênicos, e rever a prevalência das demais afecções esplênicas através da análise retrospectiva do diagnóstico histopatológico de cães submetidos à esplenectomia. Os resultados foram confrontados com os exames laboratoriais, as manifestações clínicas, a presença de arritmias cardíacas e de hemoperitôneo. Participaram do estudo retrospectivo 109 cães atendidos no Serviço de Cirurgia de Pequenos Animais do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, entre os anos de 2002 e 2009. A média de idade foi de 10 anos (± 3), não foi observado predileção sexual. Cães sem raça definida foram os mais acometidos, com peso médio de 22 kg (± 13). Cinqüenta e dois por cento (57/109) dos animais foram esplenectomizados devido a afecções não neoplásicas, enquanto que 48% (52/109), por neoplasias esplênicas. Dentre estes, o diagnóstico mais freqüente foi o hemangiossarcoma, acometendo 28 (54%) animais. Os sintomas mais freqüentes foram disorexia, apatia e emese. Cães com neoplasias malignas apresentaram níveis de hematócrito e hemácias significativamente menores que os acometidos por massas benignas. Do mesmo modo, a presença de hemoperitôneo, secundário à ruptura esplênica, correlacionou-se significativamente com a presença de neoplasia maligna. Arritmias cardíacas não foram fatores preditivos para a diferenciação da esplenomegalia. A avaliação imunohistoquímica da expressão tecidual de VEGF foi realizada em 23 hemangiossarcomas e 7 hemangiomas, revelando-se significativamente maior nas neoplasias malignas. Tal resultado sugere que a expressão deste fator pode estar relacionada à proliferação maligna observada nos hemangiossarcomas. / New blood vessel formation is a fundamental event in the process of tumor growth and metastatic dissemination, being the vascular endothelial growth factor (VEGF) one of the key regulators of this process. The aim of this study was evaluate the VEGF immunohistochemical expression in splenic hemangiosarcomas and hemangiomas, and review the prevalence of canine splenic disorders through retrospective analysis of histological diagnosis after splenectomy. The results were confronted with laboratory findings, clinical signs and presence of cardiac arrhythmia and hemoperitoneum. A hundred nine dogs were included in the retrospective study at Veterinary Hospital of School of Veterinary Medicine, University of Sao Paulo, between 2002 and 2009. The average age was 10 year ± 3, without sexual predilection. Mix breeds were the most frequent, and average weigh was 22kg ± 13. Overall, 52% (57/109) of dogs were splenectomized for nonneoplastic disease, although 48% (52/109) were splenectomized for neoplasia. Among these dogs the most common diagnosis was hemangiossarcoma (28 dogs, 54%). Frequently clinical signs included anorexia, lethargy and vomiting. Dogs with malignant neoplasia had significantly lower red blood cells counts and packed cell volume compared with values for dogs with benign masses. Similarly, hemoperitoneum secondary to splenic rupture had a significant correlation with malignant tumor. Cardiac arrhythmia was not useful in differentiating dogs with splenomegaly. Expression of vascular endothelial growth factor was made by immunohistochemical analyses in 23 hemangiosarcomas and 7 hemangiomas being significantly higher in malignant tumor. These data suggest that VEGF expression may contribute to malignant proliferation of hemangiossarcoma.

Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer ovárico epitelial (COE) representa el 90% de los cánceres de ovario. Esta enfermedad presenta un transcurso silencioso y por lo tanto una detección tardía; es altamente angiogénico y tiene una pobre respuesta a la terapia con una baja sobrevida. Existen varias hipótesis sobre la etiología del COE, una de ellas postula que los andrógenos estimulan la proliferación de células epiteliales del ovario dentro de los quiste de inclusión y también del epitelio transformado. Con el fin de dilucidar el mecanismo molecular por el cual los andrógenos contribuyen al desarrollo del carcinoma ovárico, se realizaron estudios relacionando los andrógenos con vías de señalización de moléculas como el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), el cual es un inhibidor de la proliferación celular. Además, existen reportes sobre el efecto de los andrógenos sobre factores pro-angiogénicos como NGF y VEGF. Estos antecedentes, sugieren que los andrógenos podrían estar participando de la génesis del cáncer y podrían ser responsables de cambios importantes en los niveles de expresión de moléculas como TGF-β1, NGF y VEGF. Por este motivo, se planteó la siguiente hipótesis; el andrógeno dihidrotestosterona (DHT) inhibe el efecto antiproliferativo de TGF-β1 e induce la expresión de factores angiogénicos, favoreciendo la proliferación celular y la angiogénesis en células de cáncer ovárico epitelial. El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de DHT en la vía de señalización de TGF-β1 y en la expresión de factores angiogénicos en células de cáncer de ovárico epitelial. Para abordar este objetivo, la metodología fue diseñada en dos partes: 1.- experimentos ex-vivo, para lo cual se trabajó con muestras de ovario normal inactivo (OI) y cáncer ovárico epitelial pobremente diferenciado (COE) en donde se evaluó por IHQ los niveles de AR y de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 por IHQ y W-B. 2.- experimentos in-vitro con dos líneas celulares, HOSE (células epiteliales de la superficie ovárica) y A2780 (células de cáncer ovárico epitelial), las cuales fueron estimuladas con 0, 10 y 100 nM de DHT, por 48 y 72 h para evaluar las mismas proteínas que se evaluaron en tejidos por las técnicas de ICQ y W-B. Además, se realizaron experimentos con siRNA del receptor de andrógenospara confirmar la acción de los andrógenos en cáncer ovárico epitelial. Adicionalmente, se evaluó el ciclo celular por citometría de flujo, así como también, se evaluó los niveles de p21 por WB Resultados de nuestro trabajo, indicarían un aumento de los niveles del AR y una disminución de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 en COE versus OI. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las líneas celulares, donde también encontramos un aumento de los AR y una disminución de estas proteínas (TGFBR1 y TGFBR2) en la línea celular de cáncer ovárico epitelial A2780 versus la línea celular de epitelio normal de la superficie ovárica HOSE. Por otra parte, cuando estimulamos las células A2780 con DHT, observamos que los niveles de mRNA de TGF-β1 no fueron modificados por este andrógeno, sin embargo, los niveles de los receptores I y II de TGF-β1 disminuyeron significativamente (*p<0,05) a las 72 h con 100 nM de DHT. Estos resultados sugieren que el AR y TGF-β1 podrían participar en la regulación de la homeostasis tisular en el COE. Además, la disminución en los niveles de los receptores de TGF-β1 por efecto de DHT, sugiere que los andrógenos alterarían la vía de señalización de TGF-β1, lo que podría explicar el aumento en la proliferación celular de esta patología. El estudio del ciclo celular indicó que hay un aumento del porcentaje de células en fase S en las líneas celulares A2780, sin embargo, no se logró relacionar el efecto de DHT y TGF- β1 en la proliferación, probablemente por la cantidad de factores que están involucrados en este proceso. Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de p21 y se encontró que el tratamiento con DHT provocó una disminución en los niveles de p21, lo que podría relacionarse con una falla en la regulación del ciclo celular en células A2780, sin embargo, este efecto no se observó en las células HOSE. Finalmente, se analizó el efecto de DHT sobre los niveles de expresión de NGF y VEGF sin encontrar cambios en los niveles de mRNA y proteína de NGF en ninguna de las líneas celulares en estudio. Por otro lado cuando se analizó la secreción de VEGF, se observó una mayor secreción de este factor en células A2780 tratadas con DHT en comparación con las células HOSE en las mismas condiciones. En conclusión, los resultados obtenidos en tejido de COE y en la línea celular A2780 sugieren que la vía de señalización canónica de TGF-β estaría alterada en COE, donde los andrógenos podrían desempeñar un papel importante regulando negativamente la expresión de sus receptores (TGFBR1) lo que significaría que DHT al bloquear la vía de señalización canónica de TGF-β podría estar involucrado en la disminución de los niveles de p21. También es importante destacar que DHT tendría una participación importante en el proceso de angiogénesis, aumentando los niveles de VEGF, según lo encontrado en este trabajo. Estas fallas, entre otras, podrían contribuir a la progresión del cáncer de ovárico epitelial, siendo interesante dilucidar los mecanismos implicados en futuros estudios para contribuir con nuevas y efectivas terapias anti-carcinogénicas / Epithelial ovarian cancer (EOC) represents 90% of ovarian cancers. This disease has a silent course, a late detection. It is highly angiogenic and has a poor response to therapy, therefore a low survival. There are several hypotheses about the etiology of the EOC, one of them postulates that androgens stimulate the proliferation of epithelial cells within the ovary inclusion cyst and epithelium transformed. To elucidate the molecular mechanism by which androgens contribute to the development of ovarian cancer, studies were related the androgen with signaling pathway, such as transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), which is a cell proliferation inhibitor. In addition, there are reports on the effect of androgens on pro-angiogenic factors such as VEGF and NGF. These facts suggest that androgens could be involved in the genesis of cancer and could be responsible for significant changes in expression levels of molecules such as TGF-β1, NGF and VEGF. For these reasons, the following hypothesis is raised; the androgen dihydrotestosterone (DHT) inhibits the antiproliferative effect of TGF-β1 and induces the expression of angiogenic factors promoting cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian cancer cells. The objective of this study was to evaluate the participation of DHT in the signaling pathway of TGF-β1 and expression of angiogenic factors in cells of epithelial ovarian cancer. To address this goal, the methodology was designed in two parts: 1. ex-vivo experiments with samples of inactive normal ovary (IO) and poorly differentiated epithelial ovarian cancer (EOC) and 2. Experiments in vitro with two cell lines, HOSE (ovarian epithelial cell surface) and A2780 (epithelial ovarian cancer cells), which were stimulated with 0, 10 and 100 nM DHT for 48 and/or 72 h. To answer each of the objectives, conventional RTPCR, qPCR, blot, immunocytochemistry, immunohistochemistry and western were used. The results indicate an increase of AR levels and a decreased of TGF-β1 receptors I and II (TGFBR2 and TGFBR1) in EOC versus IO. These results are in agreement with those obtained in cell lines, where we also found an increase in AR and a decrease in TGF-β1 receptors (TGFBR1 and TGFBR2) in epithelial ovarian cancer cells A2780 versus HOSE cells. Moreover, when stimulate A2780 cells with DHT, the mRNA levels of TGF-β1 were not modified by this androgen, however, the levels of TGF-β1 receptors I and II decreased significantly (* p <0.05) at 72 h with 100 nM DHT. These results suggest that AR and TGF-β1 may be involved in regulating tissue homeostasis in the EOC. Furthermore, decreased levels of TGF-β1 receptors and the effect of DHT in TGF-β1 canonical sinaling pathway, suggests that androgen could increase cell proliferation in this pathology. The cell cycle studies indicated that there is an increase in the percentage of cells in S phase in the cell lines A2780, however, failed to relate the effect of DHT and TGF-β1 in proliferation, probably because the number of factors are involved in this process. Moreover, the protein levels of p21 were analyzed and was found that the DHT treatment caused a decrease in p21 levels, which could be related to a failure in cell cycle regulation in A2780 cells, this effect was not observed in the HOSE cells. Finally, the effect of DHT on NGF and VEGF expression levels was analyzed. No changes were observed in mRNA levels or of NGF protein levels in both cells lines studied. Furthermore when VEGF protein levels were analyzed, it was found that the secretion of this factor was greater in A2780 cells treated with DHT compared to HOSE cells under the same conditions. In conclusion, these results of tissue and cell line A2780 suggest that the TGF-β canonical signaling pathway would be altered in EOC where androgens may play a role downregulating expression of its receptors (TGFBR1) and this could potentially be involved in the reduction of p21 levels. Is also important highlight as found in this investigation, androgens have an important role in the angiogenesis process, increasing the levels of VEGF. These failures, among others, could contribute to the progression of epithelial ovarian cancer, it is interesting to elucidate the mechanisms involved in future studies to contribute with new and effective anti-carcinogenic therapies / Fondecyt; Fondap

Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B. / There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells.

Objetivo: Avaliar os efeitos da panfotocoagulação a laser (PRP) comparando com a PRP associada com injeção de 0,5 mg de ranibizumabe intravítreo (IVR) em pacientes com retinopatia diabética proliferativa (RDP) com características de alto risco. Métodos: Estudo prospectivo incluindo pacientes portadores de RDP de alto risco sem tratamento prévio, distribuídos aleatoriamente em dois grupos: grupo PRP e grupo PRPplus. Avaliações oftalmológicas padronizadas, incluindo melhor acuidade visual corrigida (MAVC), de acordo com o Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS), medidas da área de vazamento de fluoresceína na angiofluoresceinografia (FLA), medida da espessura do subcampo macular (ESM) na Tomografia de Coerência Óptica (OCT) foram realizadas na visita inicial e nas semanas 16 (±2), 32 (±2) e 48 (±2), além de eletrorretinograma (ERG) de campo total, realizado na visita inicial e na semana 48 (±2). Resultados: Vinte e nove de 40 pacientes (n=29) completaram as 48 semanas do estudo. Na visita inicial, a média ± erro-padrão da média (EPM) de FLA (mm2) foi de 9,0 ± 1,3 e 11,7 ± 1,3 (p=0,1502); MAVC (logMAR), 0,31 ± 0,05 e 0,27 ± 0,06 (p=0,6645) e ESM (µm), 216,3 ± 10,7 e 249,4 ± 36,1 (p=0,3925), nos grupos PRP e PRPplus, respectivamente. Foi notada significativa (p<0,05) redução na FLA em todas as visitas do estudo em ambos os grupos; porém significativamente maior no grupo PRPplus, em relação ao grupo PRP, no final da visita 48 (PRP = 2.9 ± 1.3 mm2; PRPplus = 5.8 ± 1.3 mm2; p = 0.0291). Observou-se piora na MAVC em todas as visitas após o tratamento no grupo PRP (p<0,05), enquanto que no grupo PRPplus não foram encontradas mudanças na MAVC. Aumento significativo na ESM foi observado em todas as avaliações do estudo no grupo PRP e significativa diminuição na ESM foi detectada na semana 16 do grupo PRPplus, e não foi encontrada diferença significativa, em relação à visita inicial, nas semanas 32 e 48. Quanto ao ERG, foi notada significativa diminuição na amplitude da onda-b dos bastonetes para 46 ± 5% (p<0,05) do valor da visita inicial no grupo PRP e para 64 ± 6% no grupo PRPplus. Essa regressão foi significativamente maior no grupo PRP do que no grupo PRPplus (p=0,024). Resultados similares foram observados para resposta máxima combinada (MC) da amplitude da onda-b, com redução na semana 48, comparada com a visita inicial, de 45 ± 4% no grupo PRP e 62 ± 5% no grupo PRPplus. A diminuição deste parâmetro foi significativamente maior no grupo PRP do que no grupo PRPplus (p=0,0094). A MC da amplitude da onda-a, os potenciais oscilatórios (PO) e a resposta ao flicker de 30 Hz mostraram redução estatisticamente significativa na análise intragrupos, mas sem diferenças na análise entre os grupos. Conclusão: Após a PRP foi associado IVR com maior redução na FLA na semana 48, comparado com PRP isoladamente, em olhos com RDP de alto risco, sendo que o uso adicional de IVR à PRP parece proteger contra discreta perda de acuidade visual e espessamento macular observado em olhos tratados com PRP isoladamente. Na análise do ERG, resultados sugerem que o tratamento de RDP de alto risco com PRP associado com IVR é efetivo para o controle da RDP e permite menor uso do laser, que, consequentemente, leva à perda funcional menor da retina do que o tratamento com PRP isoladamente. / Objective: To evaluate the effects of panretinal photocoagulation (PRP) compared with PRP plus intravitreal injection of 0.5 mg of ranibizumab (IVR) in patients with high-risk proliferative diabetic retinopathy (PDR). Methods: Prospective study included patients with high-risk PDR and no prior laser treatment randomly assigned to receive PRP (PRP group) or PRP plus IVR (PRPplus group). Standardized ophthalmic evaluations including best-corrected visual acuity (BCVA) measured according to the methods used in the Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS), fluorescein angiography to measure area of fluorescein leakage (FLA) and optical coherence tomography (OCT) for the assessment of central subfield macular thickness (CSMT), were performed at baseline and at weeks 16 (±2), 32 (±2) and 48 (±2). Eletroretinographic (ERG) was measured according to ISCEV standards at baseline and at week 48 (±2). Results: Twenty-nine of 40 patients (n = 29 eyes) completed the 48-week study follow-up period. At baseline, mean ± SE FLA (mm2) was 9.0 ± 1.3 and 11.7 ± 1.3 (p = 0.1502); BCVA (logMAR) was 0.31 ± 0.05 and 0.27 ± 0.06 (p = 0.6645); and CSMT (µm) was 216.3 ± 10.7 and 249.4 ± 36.1 (p = 0.3925), in the PRP and PRPplus groups, respectively. There was a significant (p < 0.05) FLA reduction at all study visits in both groups, with the reduction observed in the PRPplus group significantly larger than that in the PRP group at week 48 (PRP = 2.9 ± 1.3 mm2; PRPplus = 5.8 ± 1.3 mm2; p = 0.0291). Best-corrected visual acuity worsening was observed at 16, 32 and 48 weeks after treatment in the PRP group (p < 0.05), while no significant BCVA changes were observed in the PRPplus group. A significant CSMT increase was observed in the PRP group at all study visits, while a significant decrease in CSMT was observed in the PRPplus group at week 16, and no significant difference in CSMT from base- line was observed at weeks 32 and 48. ROD b-wave amplitude was significantly reduced to 46 ± 5 % (p<0.05) of baseline in the PRP group and 64±6% (p<0.05) in the PRPplus group. This reduction was significantly larger in the PRP group than in the PRPplus group (p=0.024). Similar results were observed for the dark-adapted Combined Response (CR) b-wave amplitude, with a reduction at 48 weeks compared to baseline of 45 ± 4 % in the PRP group and 62 ± 5 % in the PRPplus group; the reduction in CR b-wave amplitude was significantly larger in the PRP group than in the PRPplus group (p=0.0094). CR a-wave, oscillatory potentials, cone single flash, and 30 Hz flicker responses showed statistically significant within-group reductions, but no differences in between-group analyses. Conclusions: Intravitreal ranibizumab after PRP was associated with a larger reduction in FLA at week 48 compared with PRP alone in eyes with high-risk PDR, and the adjunctive use of IVR appears to protect against the modest visual acuity loss and macular swelling observed in eyes treated with PRP alone. In ERG analyses, the results suggest that treating high-risk PDR with PRP plus IVR is effective for PDR control, and permits the use of less extensive PRP which, in turn, induces less retinal functional loss, than treatment with PRP alone.

Os mediadores do estresse, epinefrina e norepinefrina, participam da modulação de diversos processos celulares como a proliferação, a migração celular e a apoptose durante a tumorigênese, influenciando assim, o crescimento e a progressão tumoral. A presença de receptores beta-adrenérgicos e sua expressiva resposta ao estímulo do neurohormônio norepinefrina foram identificadas em várias linhagens de células tumorais, incluindo o carcinoma espinocelular de boca. O objetivo deste estudo foi investigar a influência da norepinefrina na expressão do fator de crescimento endotelial vascular do tipo C (VEGF-C) em cultura de células de carcinoma espinocelular de boca que continham receptores beta adrenérgicos. As linhagens celulares (SCC-9 e SCC-25) foram estimuladas com norepinefrina em diferentes concentrações (0,1; 1 e 10 M) e com 1M de propranolol, sendo analisadas após 1, 6 e 24 horas. A expressão gênica e proteica de VEGF-C foram avaliadas, respectivamente, por RT-PCR em tempo real e por ELISA. A produção de RNAm para VEGF-C teve um comportamento irregular, com tendências a variações da expressão gênica (aumento e inibição). A dosagem proteica nos sobrenadantes das culturas de células malignas não refletiu a expressão gênica de VEGF-C. Somente na linhagem SCC-25 ocorreu uma inibição significativa da produção de VEGF-C (p<0,001) pelas células neoplásicas no ensaio de 24 horas após o estímulo com 10M de norepinefrina. Estes resultados sugerem que a expressão de VEGF-C nas linhagens de carcinomas espinocelulares humanos de boca, parece não ser mediado pela norepinefrina, via receptores beta-adrenérgicos. / The mediators of stress, epinephrine and norepinephrine, are involved in modulation of many cellular processes such as proliferation, migration and apoptosis influencing the tumor growth and progression. The presence of beta-adrenergic receptors and their significant response to stimulation of neurohormone norepinephrine has been identified in various tumor cell lines, including oral squamous cell carcinoma. The aim of this study was to investigate the influence of norepinephrine on the expression of vascular endothelial growth factor type C (VEGF-C) in oral squamous carcinomas cell lines that contained beta-adrenergic receptors. Cell lines (SCC-9 and SCC-25) were stimulated with different concentrations of norepinephrine (0.1, 1 and 10 mM) and 1 M of propranolol, and analyzed after 1, 6 and 24 hours. Gene and protein expressions of VEGF-C were evaluated, respectively, by real time PCR and by ELISA. The results showed an irregular behavior of the oral squamous carcinoma cell lines, with trends to increase or to inhibit the VEGF-C gene expression. Dosage protein in supernatant cultures of malignant cells did not reflect the gene expression of VEGF-C. Only in the SCC-25 cell line was detected a significant inhibition of VEGF-C production by neoplastic cells, twenty-four hours after stimulation with 10M norepinephrine (p<0,001). These results suggest that VEGF-C expression in oral squamous carcinomas cell lines seems not to be mediated by norepinephrine through the beta adrenergic receptor pathway.