Les microvésicules (MVs) sont des petites vésicules membranaires libérées par les cellules, ayant des effets bénéfiques et/ou délétères dans le sepsis. Nous avons déjà démontré que la délétion de l’isoforme non musculaire de la kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCKnm) protège les souris contre le choc endotoxique en réduisant l'inflammation. Ici, nous avons évalué les conséquences de la délétion de MLCKnm sur le phénotype et les effets inflammatoires des MVs au cours du choc endotoxique. La délétion de MLCKnm augmente le taux circulant des MVs et ceux dérivées des cellules progénitrices. Les souris MLCKnm-/- présentent une augmentation du nombre des plaquettes, mais leurs capacité à libérer les MVs est réduite et une diminution du nombre des leucocytes et des MVs leucocytaires. Une diminution du relâchement de l’aorte a été observé chez les souris injectées avec des MVs dérivées des souris MLCKnm+/+ (MVsMLCKnm+/+), mais pas les MVs dérivées des souris MLCKnm-/- (MVsMLCKnm-/-). En présence de lipopolysaccharide (LPS), MVsMLCKnm+/+ augmentent la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires par les cellules endothéliales de l’aorte de souris alors que les MVsMLCKnm-/- induisent la libération des cytokines anti-inflammatoires. L’injection des MVsMLCKnm-/-, prévient partiellement l'augmentation du stress oxydatif, nitrosatif, et la dysfonction endothéliale induites au niveau des souris par le LPS. Ces résultats montrent que MLCKnm joue un rôle important dans l'activation cellulaire, la libération des MVs, ainsi que le nombre des cellules circulantes. La délétion de MLCKnm permet de générer des MVs circulantes moins inflammatoires avec un potentiel protecteur. / Microvesicles (MVs), small membrane vesicles released from cells, have beneficial and/or deleterious effects in sepsis. We previously reported that non-muscle myosin light chain kinase (nmMLCK) deletion protects mice against endotoxic shock by reducing inflammation. Here, we evaluated the consequences of nmMLCK deletion on the phenotype and inflammatory effects of cell-derived MVs during endotoxic shock. nmMLCK deletion increased circulating levels of MVs. In nmMLCK-/- mice, platelet count was increased but the platelet ability to release MVs was reduced, and both leukocyte-derived MVs and leukocyte count were reduced. Endothelium-dependent relaxation of aorta was reduced in mice injected with MVs from nmMLCK+/+ (MVsnmMLCK+/+) but not from nmMLCK-/- mice (MVsnmMLCK-/-). In presence of lipopolysaccharide, MVsnmMLCK+/+ increased pro-inflammatory cytokine release by mouse aortic endothelial cells whereas MVsnmMLCK-/- enhanced anti-inflammatory secretome. Injection of MVsnmMLCK-/-, but not MVsnmMLCK+/+, prevented the increase of oxidative and nitrative stresses and reduced endothelial dysfunction in aorta from lipopolysaccharide-treated mice. Altogether, nmMLCK plays an important role in cellular activation and release of circulating MVs. Moreover, nmMLCK deletion generates MVs with low inflammatory properties and high protective effects.

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La migration des cellules endothéliales est une des étapes nécessaires à l'angiogenèse physiologique et tumorale. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la kinase de stress SAPK2/p38 via le récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR-2. Nous avons étudié les événements moléculaires suivant l'activation du récepteur du VEGF et menant à l'activation de la voie SAPK2/p38 dans les cellules endothéliales. La tyrosine 1214 en C-terminal du VEGFR-2 est un site majeur d'autophosphorylation nécessaire à l'activation de SAPK2/p38 par le VEGF dans les cellules endothéliales. Le résidu phospho-tyrosine 1214 permet le recrutement de la protéine adaptatrice Nck via son domaine SH2. De plus, l'activation de Fyn, une kinase de la famille Src, mais non c-Src même, dépend de la phosphorylation de la tyrosine 1214. L'utilisation d'un dominant négatif de Fyn empêche l'activation de SAPK2/p38, inhibe la formation de fibres de tension et abolit la migration endothéliale. Nck et Fyn s'associent en réponse au VEGF et l'activité de Fyn est nécessaire à la phosphorylation sur tyrosine de Nck et de la kinase PAK-2. La formation de fibres de tension nécessite aussi l'activation de la petite GTPase Cdc42, ce qui permet d'acheminer le signal du VEGF vers SAPK2/p38, sa cible physiologique MAPKAP K2, puis vers l'actine. Ces résultats suggèrent une séquence d'étapes moléculaires précoces suivant l'activation du VEGFR-2 et régulant la dynamique d'actine nécessaire à la migration endothéliale. 11 s'agit de la première description d'une séquence d'événements couplant l'activation d'un récepteur à activité tyrosine kinase à celle d'une kinase de stress. Par ailleurs, l'identification du rôle du site tyrosine 1214 du VEGFR-2 en fait une cible précise pour le développement d'une drogue anti-angiogénique. / Endothelial cell migration is one major step of physiological and pathological angiogenesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent regulator of angiogenesis and induces actin reorganization into stess fibers and cell migration via activation of SAPK2/p38 downstream of the tyrosine kinase receptor VEGFR-2. We studied the molecular events following the activation of the VEGF-receptor that lead to the activation of the SAPK2/p38 pathway in endothelial cells. The tyrosine 1214 residue in C-terminal of the VEGFR-2 is a major autophosphorylation site that is required for the activation of SAPK2/p38 by VEGF in endothelial cells. The adaptor protein Nck is recruited to the phospho-tyrosine 1214 residue via its SH2 domain. Moreover, the activation of the Src-family kinase Fyn, but not c-Src itself, depends on phospho-tyrosine 1214. A dominant negative form of Fyn inhibits SAPK2/p38 activation, stress fibers formation and endothelial cell migration. Nck and Fyn associate in response to VEGF and Fyn activity is required for the tyrosine-phosphorylation of Nck and PAK-2. The activation of the small Rho GTPase Cdc42 downstream of tyrosine 1214 is also required for the activation of SAPK2/p38, its physiological target MAPKAP K2, and stress fiber formation. Altogether, these results suggest a sequence of early molecular steps following VEGFR-2 activation by VEGF that regulate the actin dynamics required for endothelial cell migration. This is the first description of a sequence of events that couple the activation of a tyrosine kinase receptor to that of a stress-activated kinase. The identification of the role of the tyrosine 1214 residue on VEGFR-2 makes it an appealing target for the development of an anti-angiogenic therapy.

Contexte: Les cellules endothéliales cornéennes humaines (CECH) peuvent adopter un phénotype fibroblastique en culture, les rendant inutilisables en génie tissulaire de la cornée. Le facteur de croissance transformant β (TGF-β) serait impliqué dans ce phénomène, mais il est aussi connu pour maintenir les CECH en état de quiescence in vivo. Objectifs: Comparer l’effet du TGF-β1 sur le phénotype des CECH lors des phases de prolifération ou de maturation des cultures et optimiser les conditions de culture des CECH. Méthodes: Des CECH ont été cultivées en présence ou non de TGF-β1 et de facteur de croissance épidermal (EGF) dans une culture à deux phases. La morphologie, l’expression de marqueurs de fonctionnalité, la résistance trans-endothéliale et la perméabilité des cultures ont été analysées à l’approche de la confluence (phase de prolifération) et suivant la phase de maturation post-confluence. Résultats: L’ajout de TGF-β1 lors de la prolifération a généré des CECH fibroblastiques et la perte des marqueurs de jonctions cellulaires, indépendamment de la présence d’EGF. En phase de maturation, les CECH présentaient un phénotype endothélial et des jonctions cellulaires fonctionnelles. Elles avaient une forte résistance trans-endothéliale et une faible perméabilité. Les résultats démontrent que le TGF-β1 favorise la formation d’une barrière endothéliale semi-perméable lors de la maturation des cultures de CECH, se rapprochant ainsi de l’état physiologique des CECH in vivo. / Background: Human corneal endothelial cells (HCEC) easily become fibroblastic when cultured, rendering them unsuitable for tissue engineering of the cornea. Transforming growth factor β (TGF-β) could be a key factor in this phenomenon; however, it is also known to maintain the endothelium in a quiescent state in vivo. Purpose: To compare the effects of TGF-β1 on HCEC’s phenotype during either the proliferation or the maturation phase of the cultures and optimize culture conditions for HCECs. Morphology, functionality markers, trans-endothelial resistance and permeability of the cultures were analyzed at confluency (proliferation phase) and after the post-confluence maturation phase. Results: Adding TGF-β1 during proliferation produced fibroblastic HCECs and loss of the cell junction’s markers, independently from the presence of EGF. On contrast, during the maturation phase, HCECs had an endothelial phenotype and functional cell junctions. They produced a high trans-endothelial resistance and a low permeability. Overall, results show that TGF-β1 promotes formation of a typical leaky endothelial barrier during the maturation phase of cultured HCECs, thus approaching the physiological properties of in vivo HCECs.

Les médicaments botaniques, y compris ceux utilisés en médecine traditionnelle chinoise (MTC), traitent depuis longtemps les maladies cardiovasculaires où la dysfonction endothéliale est un facteur de risque bien établi. Dans la littérature, il existe de nombreux rapports sur les avantages dans la clinique et la santé des médicaments ou des préparations botaniques pour le système cardiovasculaire. Il a été indiqué que des médicaments botaniques, en particulier ceux ayant une capacité antioxydante puissante, protègent les cellules endothéliales (CE) en culture contre les radicaux libres et les oxydants. Cependant, il y a peu de recherches sur les médicaments botaniques dans le contexte de la cicatrisation et de la régénération tissulaire. Cette thèse a étudié quatre médicaments botaniques enregistrés dans la MTC pour explorer leurs effets sur la croissance des CE vasculaires et l'angiogenèse, deux événements activement impliqués dans la cicatrisation et la régénération tissulaire. Dans la première partie de la thèse, des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC) ont été cultivées en présence de différentes doses d'extrait d'astragale en forme de poudre, d'injection d'astragale, d'injection de puerarin et de proanthocyanidine. Parmi les quatre médicaments, la proanthocyanidine a montré un effet puissant sur la viabilité cellulaire et stimulé la croissance cellulaire d'une manière dépendante de la dose. En dehors de la gamme de doses efficaces, la proanthocyanidine était inefficace ou cytotoxique. Fait important, la proanthocyanidine testée était capable de maintenir une viabilité cellulaire comparable aux cellules supplémentées avec le milieu spécifique pour les CE avec un niveau bas ou normal de sérum, ce qui suggère le potentiel de la proanthocyanidine en tant que stimulateur de croissance et réactif angiogénique. Dans la seconde partie de la thèse, des études mécanistiques ont été réalisées en bloquant à la fois les récepteurs du facteur de croissance des cellules endothéliales (VEGFR) et les récepteurs du facteur de croissance des cellules épithéliales (EGFR). Cependant, les bloqueurs ont été inefficaces pour réduire l'effet stimulant de la proanthocyanidine sur les CE. En conséquence, il est conclu que la proanthocyanidine stimule probablement la croissance des CE à travers des récepteurs membranaires autres que VEGFR et EGFR. Dans la troisième partie de la thèse, il a été montré que la proanthocyanidine pouvait être chargée dans un cryogel d'alcool polyvinylique, puis libérée du gel à une concentration dans la gamme de la dose efficace. Ceci a démontré la faisabilité d'une libération lente de proanthocyanidine à partir d'un support polymérique. Enfin, la propriété angiogénique de la proanthocyanidine a été testée sur un modèle de membrane chorioallantoïque d'embryon de poulet (CAM), montrant que ce médicament botanique était capable de stimuler le développement du système vasculaire. Cette thèse a donc démontré pour la première fois que la proanthocyanidine est capable de moduler l'activité des CE humaines, particulièrement de réguler positivement l'activité et la croissance des CE en l'absence de facteurs de croissance, et que la proanthocyanidine peut être utilisée comme réactif angiogénique et libérée d'un support de médicament synthétique. En somme, cette thèse a démontré que les médicaments botaniques en médecine traditionnelle chinoise peuvent être utilisés comme substituts pour produits protéiques pour maintenir les cellules en culture et induire l'angiogenèse pour la cicatrisation et la régénération tissulaire. / Botanic drugs including those used in traditional Chinese medicine (TCM) have a long history of treating cardiovascular diseases, of which endothelial dysfunction is well established as a risk factor. In literature there exist extensive reports about the clinic and healthy benefits of botanic drugs or preparations to the cardiovascular system. Botanic drugs particularly those with potent antioxidative capacity have also been reported to protect endothelial cells (EC) in culture against free radicals and oxidants. However, there is little research about botanic drugs in the context of wound healing and tissue regeneration. This thesis studied four botanic drugs recorded in TCM to explore their effects on vascular EC growth and angiogenesis, two events actively involved in wound healing and tissue regeneration. In the first part of the thesis, human umbilical endothelial cells (HUVEC) were cultured in the presence of different doses of astragalus powder extract, astragalus injection, puerarin injection, and proanthocyanidin. Among the four drugs, proanthocyanidin showed a potent effect on cell viability and stimulated cell growth in a dose dependent manner. Outside the effective dose range proanthocyanidin was either ineffective or cytotoxic. Importantly, the proanthocyanidin under test was able to maintain a cell viability comparable with the cells supplemented with the commercially available EC growth medium at both low and normal serum conditions, which suggests the potential of proanthocyanidin as an EC growth stimulator and an angiogenic reagent. In the second part of the thesis, mechanistic studies were performed by blocking both endothelial cell growth factor receptors (VEGFR) and epithelial cell growth factor receptors (EGFR). However, the blockers were ineffective in reducing the stimulatory effect of proanthocyanidin on EC. Therefore it is concluded that proanthocyanidin stimulates EC growth through membrane receptors other than VEGFR and EGFR. In the third part of the thesis, it was shown that proanthocyanidin could be loaded into polyvinyl alcohol cryogel and then released from the gel at a concentration within the effective dose window. This demonstrated the feasibility of drug releasing of proanthocyanidin. Finally, the angiogenic property of proanthocyanidin was tested in chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model, showing that this botanic drug was capable of stimulating vasculature development. Preliminary data in rat subcutaneous model also support the angiogenic potential of proanthocyanidin. This thesis therefore demonstrated for the first time that proanthocyanidin was capable of modulating the activity of human EC and in particular upregulating EC activity and growth in the absence of growth factors, and that proanthocyanidin may be used as an angiogenic reagent and released from a synthetic drug carrier. Consequently, this thesis has demonstrated that botanic drugs in traditional medicine may be used as substitutes of protein products to maintain cells in culture and to induce angiogenesis for wound healing and tissue regeneration.

Thèse en cotutelle pour un Doctorat en génie des matériaux et de la métallurgie, Université Laval, Québec, Canada et l'Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France / L’absence de croissance en monocouche des cellules endothéliales sur la paroi des prothèses vasculaires est une des causes d’échec de leur implantation chez l’humain. Des études précédentes ont montré que le recouvrement de ces prothèses par un échafaudage de nanofibres d’acide polylactique (PLA), fabriqué par un système de filage par jet d’air innovant, peut être utilisé pour promouvoir la croissance des cellules endothéliales de façon adéquate. Ainsi, le caractère dégradable d’un matériau comme le PLA permettrait son remplacement graduel par la matrice extra-cellulaire produite par les cellules. D’autre part, la réussite d’une transition entre les nanofibres dégradables et la matrice extra-cellulaire nécessite un remplacement contrôlé et approprié. Or, la dégradation des nanofibres de PLA, dépendant de ses séquences stéréochimiques, est généralement trop longue et peut induire une cytotoxicité relative pendant sa dégradation. Dans ce contexte, les études de cette thèse ont pour objectifs de mieux comprendre la formation des fibres lors du filage, d’optimiser la fabrication des échafaudages permettant ainsi la création de nanofibres d’autres polymères, puis, de concevoir des nanofibres provenant d’un polymère mieux adapté à nos besoins, d’évaluer leur mécanisme de dégradation et sa cytotoxicité durant sa dégradation. Les travaux d’optimisation du système de filage ont démontré que la concentration avec un effet prépondérant. Ainsi, la mesure de la viscosité permet de trouver les paramètres adéquats pour le filage de polymère. Ensuite, un poly(L-lactide) semi-cristallin (PLLA) et un terpolymère de poly(lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) dédié pour des applications vasculaires ont été synthétisés et filés par jet d’air. Ces échantillons ont été dégradés en solution aqueuse et caractérisés par des méthodes physico-chimiques afin de mieux comprendre leurs mécanismes de dégradation et mis en présence de cellules endothéliales pour évaluer leur cytotoxicité. La comparaison entre les échafaudages des deux polymères a montré des comportements singuliers en dégradation, dépendants des caractéristiques thermiques des polymères. De plus, ces mécanismes de dégradation des nanofibres ont une influence directe sur la sensibilité des cellules endothéliales face aux produits de dégradation. En conclusion, ces travaux de doctorat présentent une solution prometteuse pour améliorer les prothèses vasculaires et qui pourrait être appliquée pour résoudre plusieurs problématiques en médecine régénératrice. / The absence of neo-endothelium on the intimal surface of vascular substitutes is known to be one cause of failure upon implantation of these prostheses in humans. Previous studies have shown that the coating of these substitutes with a nanofiber scaffold, made with an innovative air spinning device, can be used to promote a suitable endothelial cells growth. On one hand, the degradable feature of material as PLA enable the progressive replacement of the scaffold by the extracellular matrix of cells. On the other hand, the success of this replacement between degradable nanofibers and the extracellular matrix requires to be appropriate and controlled. Yet, the PLA nanofiber degradation process, which depends on its stereosequences, is generally too long for this application and could involve cell sensitivity during the degradation. In this context, studies from this thesis aim to understand the fibers formation during spinning, optimizing the scaffold fabrication as well as to promote the making of novel polymer scaffolds, then, design solution to polymeric nanofiber scaffolds for vascular application, evaluate its degradation mechanism and cytotoxicity during degradation process. The work on spinning device optimisation has demonstrated that the concentration had a dominant effect. Thus, viscosity measurements enable to find suitable parameters for polymer spinning. Then, a semi-cristalline poly(L-lactide) (PLLA) and a poly(lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) terpolymer specifically made for vascular application have been synthesized and air-spun. These samples were degraded in aqueous solution and characterized by physical and chemical methods to better understand their degradation mechanisms and seeded with endothelial cells to evaluate their cytotoxicity. The comparison between the two polymers scaffolds have shown surprising degradation behaviors depending on thermal properties of polymers. Moreover, these nanofiber degradation mechanisms have a direct influence on endothelial cells sensitivity with degradation by-products. To conclude, these works of doctorate display a promising solution to improve vascular prostheses and which could be applied to solve several issues in regenerative medicine field.

Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothéliale, notamment au cours d’exposition aux rayonnements ionisants. L’altération de l’endothélium induite par le stress oxydant est impliquée dans la toxicité radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothéliales est donc un enjeu important des traitements radiothérapeutiques actuels. Cet objectif nécessite une meilleure caractérisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothéliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la réponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractérisée. Par une approche protéomique, nous avons identifié la nucléophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothéliales. La phosphatase PP2a est aussi associée à ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500μM) régule la déphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la présence de NPM déphosphorylée au noyau altère la réponse des cellules aux dommages à l’ADN induits par le stress oxydant. Le céramide sphingolipide membranaire est également un facteur important des voies de stress, particulièrement dans les cellules endothéliales. Notre étude aborde donc l’implication de ce sphingolipide dans la régulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractérisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra d’identifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothéliales et leurs conséquences délétères sur les tissus environnants. / The microvascular compartment is a significant target of oxidative stress that is a major factor in endothelial dysfunction, especially during exposure to ionizing radiation. The alteration of endothelium induced by oxidative stress is involved in radiation-induced toxicity of normal tissues. Limiting endothelial dysfunction is therefore an important issue of current radiotherapeutic treatments. This objective requires a better characterization of oxidative stress signaling in endothelial cells. p38 MAPK pathway is essential in oxidative stress response but still insufficiently characterized. By using a proteomic approach, we identified nucleophosmin (NPM) as a new partner of p38 in the cytoplasm of endothelial cells. PP2a phosphatase is also associated with the NPM/p38 complex. Our work shows that oxidative stress (H2O2, 500μM) regulates the NPM dephosphorylation via PP2a, causes a rapid dissociation of the complex, and promotes its translocation to the nucleus. In addition, we show that the presence of NPM dephosphorylated at T199 in the nucleus alters the cellular response to DNA damage induced by oxidative stress. The membrane sphingolipid ceramide is also an important factor in stress pathways, particularly in endothelial cells. Our study describes the involvement of this sphingolipid in the regulation of NPM/p38 pathway. A better characterization of the p38 pathway and its actors provided by our study will identify potential targets in order to limit endothelial dysfunction and its deleterious effect on surrounding tissues.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La migration des cellules endothéliales est une étape nécessaire à l'angiogenèse. Le facteur pro-angiogénique VEGF {vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à identifier puis à caractériser les fonctions des cibles de p38 dans les cellules endothéliales activées par le VEGF. Suite à une électrophorèse bi-dimensionnelle et à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons isolé l'annexine 1 (ANXA1) comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et est diminuée en inhibant p38. L'ANXAl a d'abord été caractérisée comme une protéine qui module l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes en inhibant la phospholipase A2. En outre, plusieurs études indiquent que l'ANXAl joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaires et qu'elle interagit avec des protéines du cytosquelette comme la tubuline et l'actine. Après avoir identifié l'ANXAl en aval de p38 nous avons caractérisé ses fonctions ainsi que la kinase responsable de sa phosphorylation. En utilisant des essais de phosphorylation in vitro et in vivo, nous avons montré que la MAPKAP kinase-2 activée par le VEGF régule la phosphorylation de l'ANXAl en aval de p38. Dans les cellules non stimulées, l'annexine 1 est prédominante dans le noyau, tandis que lorsque les cellules endothéliales sont stimulées au VEGF, elle se déplace du noyau vers le cytoplasme où elle co-localise avec l'actine F dans les lamellipodes. L'inhibition de la translocation par le SB203580 et la leptomycine B suggère qu'elle nécessite une phosphorylation et le système cargo CRM1. De plus, la migration cellulaire est inhibée à la suite du knockdown de l'ANXAl par l'utilisation d'un ARNi ciblant l'ARNm de la protéine. En outre, la migration cellulaire et la tubulogenèse initiées par le VEGF sont inhibées à la suite du knockdown de l'ANXAl. En conclusion, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de l'ANXAl régule l'effet angiogénique associé à l'activation de la voie de signalisation p38/MAPKAP kinase-2 par le VEGF.

L'angiogénèse est un processus physiologique soutenu par la migration des cellules endothéliales. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à caractériser les mécanismes moléculaires, en aval de p38, impliqués dans la phosphorylation de l'annexine Al (ANXA1) chez les cellules endothéliales activées par le VEGF et de démontrer leur rôle dans la migration cellulaire. Les résultats suggèrent que l'ANXAl est une nouvelle cible du sentier p38/MAPKAP K2 (mitogen-activated protein kinase activated-protein kinase 2) et qu'elle régule la migration des cellules endothéliales stimulées par le VEGF. Premièrement, à l'aide d'une électrophorèse en 2D et d'une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié l'ANXAl comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et diminuée suite à une inhibition de l'activité de p38. Deuxièmement, en utilisant des essais kinases in vitro et des essais de phosphorylation in vivo, nous avons découvert que l'activation de la LIMK1 (lin-ll/Isl-l/Mec-3 domain-containing protein kinase) par le VEGF en aval de p38 entraîne la phosphorylation de l'ANXAl. Troisièmement, nous avons démontré que l'ANXAl joue un rôle dans la migration des cellules endothéliales et dans la tubulogénèse, du fait que ces processus initiés par le VEGF sont inhibés à la suite de l'invalidation de l'ANXAl par un ARNi (ARN interférant). Toutefois, cette inhibition est renversée en ajoutant un plasmide contenant de l'ADN de l'ANXAl insensible au ARNi. En conclusion, nos résultats suggèrent que la LIMK1 activée par le sentier p38 phosphoryle l'ANXAl, une protéine indispensable à la migration des cellules endothéliales et à la formation de tubules induites par le VEGF.

Cette recherche visait à étudier les interactions cellules-cellules qui interviennent entre les cellules du PRP, les cellules endothéliales et les ostéoblastes dans un modèle de co-culture in vitro. Ainsi, des quantités de PRP ou de surnageants de PRP, activés par l'ajout de TRAP-6 ou non, ont été ajoutées à des cellules endothéliales ou des ostéoblastes, séparés par une membrane semi-perméable et la prolifération cellulaire mesurée par une méthode colorimétrique. Les résultats obtenus montrent que les surnageants de PRP et les PRP sont mitogéniques pour les cellules endothéliales et pour les ostéoblastes en mono-culture. Cependant, l'effet mitogénique en co-culture n'est observé qu'en présence de surnageant de PRP et ce, uniquement sur la croissance des cellules endothéliales, suggérant un mode de régulation de la division cellulaire distinct de ces deux lignées cellulaires.