Le gène Egfl7 codant une protéine majoritairement sécrétée par les cellules endothéliales a été découvert au sein du laboratoire. Ce gène a la particularité d’héberger dans sa séquence intronique deux microARNs complémentaires nommés miR126-3p et miR-126-5p. Les microARNs sont de petites séquences de 20 à 25 nucléotides régulant l’expression de leurs cibles en se fixant sur leurs ARNm pour induire leur dégradation ou l’inhibition de leur traduction. L’expression endothéliale et les fonctions du microARN miR126-3p (microARN principal du duplex miR126-3p/126-5p) ont déjà été très largement abordées alors que celles de miR126-5p (microARN secondaire du duplex) restent inconnues. Les objectifs de notre étude ont donc été d’établir le patron d’expression de miR-126-5p lors du développement vasculaire et de caractériser ses fonctions dans les cellules endothéliales. Par hybridation in situ, miR-126-5p a été détecté dans les vaisseaux sanguins embryonnaires de souris principalement dans les cellules endothéliales. Cette spécificité endothéliale a été retrouvée dans différents organes tels que le cœur et les poumons et est maintenue in vitro. L’inhibition et la surexpression de miR-126-5p dans des cellules endothéliales veineuses (HUVEC) in vitro n’affectent pas les capacités de prolifération, de migration ou d’organisation en pseudocapillaires de ces cellules. En revanche, l’inhibition de miR-126-5p dans les HUVECs entraine une répression de l’adhérence des leucocytes à la surface d’un tapis de cellules endothéliales ainsi qu’une augmentation de la transmigration de monocytes à travers une monocouche endothéliale. A l’inverse, sa surexpression génère des phénotypes opposés. Des analyses in silico de recherche de cibles pour miR-126-5p en lien avec le recrutement leucocytaire ont permis d’identifier une protéine participant à la transmigration des leucocytes in vitro et in vivo nommée ALCAM. A l’aide de test de transactivation, nous avons pu démontrer que miR-126-5p était capable de se fixer au 3’UTR de l’ARNm d’ALCAM afin de réprimer l’expression de la protéine. De plus, l’augmentation de la transmigration induite par la chute d’expression de miR-126-5p dans les cellules endothéliales est inhibée suite au blocage direct de la protéine ALCAM montrant ainsi que l’effet répresseur de miR-126-5p sur ce mécanisme est établi via ALCAM. Une étude par microarray, réalisée sur des HUVECs où miR-126-5p a été inhibé, a permis d’identifier une seconde cible pour miR-126-5p nommée SetD5 pour laquelle aucune fonction n’est connue à ce jour. Des tests de transactivation ont permis de confirmer que SetD5 était une cible de miR-126-5p. De plus, l’effet de miR-126-5p sur l’adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales est directement lié à la modulation d’expression de ce gène. Enfin, l’analyse de l’inhibition de miR-126-5p in vivo a permis de montrer que notre microARN d’intérêt contrôle effectivement les expressions d’ALCAM et de SetD5. Cependant, alors que miR-126-5p régule uniquement l’expression d’ALCAM dans les poumons, celle de SetD5 est sous le contrôle de miR-126-5p dans la rétine.Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence l’expression endothéliale de miR-126-5p et d’identifier deux de ses cibles lui permettant de jouer un rôle dans le recrutement des leucocytes au niveau de l’endothélium. / The Egfl7 gene which was identified within the laboratory codes for a protein mainly secreted by endothelial cells. This gene harbors in its intronic sequence two complementary microRNAs named miR-126-3p and miR-126-5p. MicroRNAs are 20-25 nucleotides-long non coding RNAs which repress protein expression through binding to a complementary sequence of their target mRNAs, leading to mRNA degradation or translation inhibition. Endothelial expression and functions of miR-126-3p (The main miRNAs of the miR-126-3p/miR-126-5p duplex) was widely described while those of miR-126-5p remain unknown. The goal of our study was to establish the expression of miR-126-5p during the vascular development and to characterize its functions in endothelial cells. By in situ hybridization, miR-126-5p was detected in mouse embryonic vessels mainly in endothelial cells. This miR-126-5p endothelial specific expression was also found in different organs such as in the heart or lungs and is maintained in vitro. The inhibition and overexpression of miR-126-5p in vein endothelial cells (HUVECs) did not affect HUVECs proliferation, neither their migration nor their ability to form pseudocapillaries in vitro. On the other hand, miR-126-5p inhibition in HUVEC led to a repression of leukocyte adhesion onto endothelial cells as well as an increase of leukocyte transmigration across an endothelial cell monolayer. Interestingly, opposite phenotypes were observed after miR-126-5p overexpression. In silico analyses of miR-126-5p targets led to identify ALCAM as a potential mRNA transcript that could be regulated by miR-126-5p and which was already involved in leukocyte transmigration in vitro and in vivo. By transactivation assays, we showed that miR-126-5p was able to bind the 3’UTR of ALCAM mRNA and to repress ALCAM protein expression. Furthermore, endothelial cell treatment with an ALCAM blocking antibody abolished the effect of miR-126-5p inhibition on leukocyte transmigration indicating that miR-126-5p controls this process via ALCAM. A microarray analysis performed on HUVEC after miR-126-5p inhibition allowed the identification of another target for miR-126-5p named SetD5, a gene with unknown function. Transactivation assays confirmed that SetD5 is a target for miR126-5p. Furthermore, we showed that miR-126-5p controls leukocyte adhesion onto endothelial cells by regulating SetD5 expression. Finally, the inhibition of miR-126-5p in vivo demonstrated that miR-126-5p controls ALCAM and SetD5 expression in mouse. However, while miR-126-5p exclusively regulates ALCAM expression in lungs, SetD5 expression is controlled by miR-126-5p in the retina.In this study, we demonstrated that miR-126-5p is a functional microRNA expressed in endothelial cells. We identified two targets for this microRNA indicating that miR-126-5p participates in the control of leukocyte trafficking onto endothelial cells.

Le pancréas est une glande mixte à composantes endocrine et exocrine. Le tissu endocrine, essentiellement composé de cellules bêta productrices d’insuline, joue un rôle prépondérant dans le maintient de l’homéostasie glucidique. La perte qualitative ou quantitative des cellules bêta conduit au développement de pathologies caractérisées par une hyperglycémie chronique et connues sous le nom de diabète. Le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, thérapie cellulaire ou médecine régénérative, pour guérir le diabète repose sur une connaissance précise des mécanismes développementaux impliqués dans la formation des cellules bêta. Ainsi, au delà de l’intérêt cognitif, il est primordial de comprendre au mieux les évènements cellulaires et moléculaires qui régissent l’organogénèse pancréatique pour offrir des thérapies alternatives. Le développement embryonnaire s’effectue dans un environnement où la pression partielle en oxygène (pO2) est faible. Par ailleurs, une étude menée au sein du laboratoire a montré que la pO2 influence la différenciation des cellules bêta pancréatique in vitro. En effet, lorsque des pancréas embryonnaires sont cultivés sur filtre en hypoxie (pO2=3%), le développement des cellules bêta est drastiquement diminué comparativement à une condition de 21% d’O2. Le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1), composé d’une sous-unité alpha sensible au niveau d’oxygène et d’une sous-unité bêta constitutivement présente, permet à la cellule de s’adapter à un environnement pauvre en O2, notamment en favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au cours d’un processus appelé angiogénèse. L’objectif de ma thèse était d’étudier le rôle de HIF-1alpha au cours du développement embryonnaire du pancréas in vivo. Pour cela, nous avons utilisé des lignées murines génétiquement modifiées permettant de stabiliser constitutivement la protéine HIF-1alpha dans l’épithélium pancréatique. En utilisant ce modèle murin, nous avons montré que la différenciation endocrine et le développement des cellules bêta est altéré dans les pancréas mutants comparativement aux contrôles. Par ailleurs, en utilisant une approche pharmacologique in vitro conduisant à l’ablation des cellules endothéliales du pancréas, nous avons pu restaurer une différenciation endocrine comparable aux contrôles. Ce travail a permis d’éclaircir le rôle de HIF-1 et de la vascularisation au cours du développement embryonnaire du pancréas. Nos résultats indiquent que ces paramètres doivent être pris en compte pour améliorer les protocoles actuels permettant de générer des cellules bêta in vitro. / The pancreas is an endoderm-derived organ which is composed by both an exocrine and an endocrine compartment. Within the endocrine tissu, insulin-producing beta-cells are essential for the regulation of glucose homeostasis. The loss of beta-cells can lead to pathologies such as diabetes. Currently, people suffuring from diabetes can be treated but not permanently cured. The development of innovating therapeutical approaches, like cellular therapy or regenerative medecine, relies on the precise knowledge of the mechanisms regulating the ontogenesis of pancreatic beta-cells. Different studies have linked proper embryonic development and low-oxygen tension (pO2). Specifically, when embryonic pancreases are cultured in vitro under a hypoxic condition (pO2=3%), the beta-cells development is impaired compared to a normoxic condition (pO2=21%). Different pathways are involved in the cell adaptation to hypoxia, such as the ubiquitous Hypoxia Inducible Factor 1-alpha (HIF-1alpha). The aim of my PhD project was to elucidate the role of HIF-1alpha during pancreatic development in vivo. To do so, we used genetically modified mice allowing the constitutive stabilization of HIF-1alpha in pancreatic epithelial cells. We have shown that HIF-1alpha stabilization leads to a reduction of endocrine differentiation and beta-cells development. Moreover, using a pharmacological approach in vitro consisting in deleting endothelial cells, we rescued the endocrine differentiation in the mutant pancreases. In conclusion, my data demonstrated the negative influence of both HIF-1 and endothelial cells on endocrine differentiation processes.

Au cours de l'obésité, le Tissu Adipeux blanc (TAB) est le siège d'un important remaniement de sa Matrice Extracellulaire avec des amas fibrotiques autour des adipocytes et des vaisseaux. Cette organisation caractéristique semble avoir une incidence dans la physiopathologie de l'obésité. Les composés spécifiques à la Membrane Basale ont été mis en évidence autour des adipocytes et des cellules endothéliales et leur expression est fortement induite dans l'adipocyte obèse. L'expression de COL4A1 est positivement corrélée à l'insulino-résistance de sujets présentant une obésité modérée. De plus, dans un autre groupe de sujets massivement obèses candidats à la chirugie bariatrique, la diminution de l'expression génique de COL4A1 est à relier avec l'amélioration de l'insulino-résistance après l'intervention. Enfin, nous observons que, dans le TAB, l'expression de COL4A1 est positivement associée à l'expression génique de deux facteurs de croissance pro-fibrotiques, le TGF 1 et le TGF 3, dans le TAB. La culture tridimensionnelle d'adipocytes ou de cellules endothéliales exposés à ces deux facteurs induit un phénotype fibro-inflammatoire dans ces types cellulaires. Néanmoins, le traitement par le TGF 1 ou TGF 3 induit uniquement dans les cellules endothéliales une sur-expression de COL4A1 et non dans les adipocytes.En conclusion, nos données proposent un nouvel acteur de la fibrose du TAB au cours de l'obésité, la Membrane Basale adipocytaire et vasculaire, participant ainsi à la dysfonction tissulaire et métabolique. / During obesity, White Adipose Tissue (WAT) undergoes an important remodeling of its Extracellular Matrixwith fibrotic depots around adipocytes and vessels. This typical organization seems to have an impact in the pathophysiology of obesity. Basement Membrane components were detected around adipocytes and endothelial cells and their expression were significantly increased in obese adipocytes. COL4A1 expression in WAT is positively correlated to insulin-resistance parameters in moderate obese subjects, and its reduction is associated to insulin-resistance improvement after gastric bypass in a group of morbidly obese subjects. Finally, we demonstrated a postive correlation between COL4A1 expression and two pro-fibrotic growth factor (TGF1 and TGF3) in obese WAT. In vitro treatment of isolated adipocytes and endothelial cells with these TGF isoforms induced inflammatory and fibrotic phenotype. However, TGF1 and TGF3 exposure only provoked COL4A1 over-expression in endothelial cells, and not in adipocytes. In conclusion, our work have highlighted a new actor in WAT fibrosis during obesity, adipocytes and endothelial cells Basement Membrane, participating in the pathological alterations of obese adipose tissue and metabolism.

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Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque. / Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis.

La forme non musculaire de la kinase de la chaine légère de la myosine (MLCKnm) est une kinase principalement exprimée par les cellules endothéliales dont le rôle principal est de phosphoryler la chaine légère de myosine. Cette phosphorylation modifie la conformation des têtes de myosine, augmente l’interaction actine/myosine, et induit une rétraction des cellules endothéliales. Ce processus augmente la perméabilité de la barrière endothéliale. L’activation de MLCKnm permet l’infiltration de cellules inflammatoires en réponse à certains stimuli dont le lipopolysaccharide (LPS) bactérien. Dans ce modèle expérimental de sepsis, la déficience de MLCKnm dans un modèle murin protège les souris injectées avec du LPS, associée à une prévention des stress oxydant et nitrosant ainsi que de l’activation de voies de signalisation inflammatoire. Cependant les mécanismes moléculaires mis en jeu ne sont pas totalement connus. Dans le contexte inflammatoire, le syndrome d’apnées/hypopnées obstructives du sommeil, caractérisé par une obstruction des voies aériennes lors du sommeil menant à une hypoxie intermittente (HI), partage certaines caractéristiques dans l’activation inflammatoire observée lors du sepsis. L’HI modifie le métabolisme des cellules endothéliales en diminuant la biodisponibilité du monoxyde d’azote, augmentant le stress oxydant ainsi que la production de certains facteurs inflammatoires. A long terme, une réponse inflammatoire systémique est observée augmentant les risques d’athérosclérose. L’objectif de ce travail est d’étudier l’implication de MLCKnm dans l’inflammation vasculaire dans deux modèles physiopathologiques, induits par le LPS et l’HI. / Non muscular myosin light chain kinase (nmMLCK) is aprotein mainly expressed by endothelial cells whose roleis to phosphorylate myosin light chain. This phosphorylation modifies the conformation of myosin heads, increasing actin/myosin interaction, and inducing endothelial cells retraction. This process increases endothelial barrier permeability. The activation of nmMLCK increases inflammatory cell infiltration in response to several stimuli such as the bacterial lipopolysaccharide (LPS). In this experimental model of sepsis, nmMLCK deficiency in a murine model protects mice injected with LPS, associated with oxidative and nitrative stresses prevention as well as inflammatory pathway inhibition. However, molecular mechanisms are not fully known. In this inflammatory context, obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, characterized by obstruction of upper airway during sleep leading to intermittent hypoxia (IH), share several characteristics in inflammatory activation observed during sepsis. IH modifies the metabolism of endothelial cells decreasing nitric oxide bioavailability, increasing oxidative stress aswell as inflammatory mediators. Long-term, systemic inflammatory response is observed increasing atherosclerosis risk. The objective of this work is to study the implication of nmMLCK in vascular inflammation in two pathophysiological models induced by LPS and IH.

Le système lymphatique joue un rôle clé dans le transport du cholestérol hors de la paroi artérielle et une dysfonction lymphatique précède l'apparition de l'athérosclérose. Cette dysfonction est associée à une diminution de l’expression du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et est à priori indépendante des taux de cholestérol circulant. Il a été démontré que les souris dépourvues de la proprotéine subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une proprotéine qui mène à la dégradation du LDLR, ont une fonction lymphatique améliorée, tandis que les souris dépourvues de LDLR développent une dysfonction lymphatique. Nous visons maintenant à mieux comprendre les mécanismes par lesquels la présence de PCSK9 dans la lymphe ou la modulation du LDLR sur les cellules endothéliales lymphatiques (CEL) affecte la fonction lymphatique. Les CEL sont incubées avec du PCSK9 ou traitées avec un ARN inhibant spécifiquement l’expression du LDLR afin d’évaluer comment la présence de PCSK9 ou la modulation du LDLR affecte l'intégrité des CEL. Nos résultats démontrent que le PCSK9 n’induit pas la sécrétion de cytokines inflammatoires et n'affecte pas l'expression des marqueurs lymphatiques. L’inhibition de l’expression du LDLR entraîne une diminution des marqueurs lymphatiques membranaires endothéliaux. La diminution du LDLR a aussi entrainé une diminution des taux de certains lipides intracellulaires et en particulier des phospholipides, des sphingolipides et des triglycérides. Ces résultats suggèrent qu'une perte du LDLR, mais pas la présence de PCSK9 en circulation, pourrait induire à une altération de l'endothélium lymphatique causée par une diminution de l’expression de protéines membranaires essentielles au bon transport de la lymphe. / The lymphatic system plays a key role in the removal of cholesterol from the artery wall and lymphatic dysfunction is known to occur prior to the onset of atherosclerosis. This dysfunction is associated with reduced expression of the low-density-lipoprotein receptor (LDLR) and is first independent of circulating cholesterol levels. It has been shown that mice lacking proprotein subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), a proprotein that degrades LDLR, have improved lymphatic function while mice lacking LDLR had a lymphatic dysfunction. We now aim to better understand the mechanisms by which the presence of PCSK9 in lymph or the modulation of LDLR on lymphatic endothelial cells (LECs) affects lymphatic function. Incubation of LECs with PCSK9 and specific targeting of LDLR expression with silencing RNAs were used to further evaluate how PCSK9 or modulation of LDLR affect the metabolism and integrity of LECs. Our results demonstrate that PCSK9 does not induce the secretion of inflammatory cytokines and does not affect the expression of lymphatic markers. LDLR silencing RNA leads to a decrease of membrane-bound lymphatic endothelial cell markers. A decrease in LDLR expression also led to a decrease in the content of some intracellular lipids and particularly phospholipids, sphingolipids and triglycerides. These results suggest that loss of LDLR expression, but not circulating PCSK9, could lead to alterations in the lymphatic endothelium caused by loss of membrane integrity which could in turn affect lymph transport.

La néphropathie diabétique est l’une des complications les plus fréquentes chez les patients diabétiques à long terme, et est la première cause du besoin de dialyse. Les lésions glomérulaires semblent jouer un rôle clé dans le développement de la néphropathie diabétique. L’épaississement de la membrane basale glomérulaire, l’hypertrophie des cellules glomérulaires et la perte de podocytes font partie des principaux changements pathologiques survenant au cours de la néphropathie diabétique et peuvent conduire à une protéinurie. Il a été suggéré que le dysfonctionnement endothélial joue un rôle important dans la pathogenèse des lésions glomérulaires au cours de la maladie rénale diabétique. En effet, l’altération de la fonction et de l’intégrité des cellules endothéliales glomérulaires est l’une des principales causes de la microalbuminurie observée dans l’insuffisance rénale diabétique précoce. Les lésions des cellules endothéliales glomérulaires peuvent endommager les podocytes et même induire une perte podocitaire ce qui aggrave d’avantage les liaisons des cellules endothéliales glomérulaires et ainsi de suite. Actuellement, les traitements de la néphropathie diabétique visent le contrôle de la glycémie et de la pression artérielle dans le but de maintenir un bon débit de filtration glomérulaire. Cependant, l’étude de traitements pouvant cibler les lésions endothéliales ou les interactions podocyte-cellule endothéliales, qui jouent un rôle essentiel dans la progression de la maladie rénale diabétique, est nécessaire. Les traitements ciblant l’endothélium glomérulaire pourraient offrir des avantages thérapeutiques pour la néphropathie diabétique. En effet, des facteurs anti-angiogéniques tels que les inhibiteurs du VEGF pourraient prévenir les lésions rénales et les altérations glomérulaires sur des modèles de souris diabétiques. Cependant, d’autres données ont montré que des injections d’inhibiteurs du VEGF pouvaient être néfastes pour les cellules endothéliales et podocytaires. Ainsi, de nouvelles molécules ciblant l’endothélium vasculaire pourraient améliorer le pronostic et la qualité de vie chez les patients présentant une insuffisance rénale diabétique à un stade précoce. Nous avons précédemment montré que Alk1, avec son ligand BMP9, joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité vasculaire chez les animaux diabétiques. En effet, 4 la perte de signalisation d’Alk1 chez les animaux diabétiques conduit à la dissociation des jonctions vasculaires et à une augmentation des fuites vasculaires dans la rétine. Compte tenu de son rôle dans le maintien de la quiescence et de l’intégrité de l’endothélium, nous avons évalué les effets de la surpression d’Alk1 sur l’intégrité de l’endothélium glomérulaire et la fonction rénale chez la souris diabétique. Nous avons utilisé des souris avec délétion conditionnelle de Alk1 dans l’endothélium (Alk1ΔEC) pour évaluer le rôle de Alk1 dans la filtration glomérulaire chez des souris diabétiques induits par le STZ. Les souris ont été euthanasiées quatre mois après le début du diabète et des analyses sérologiques et urinaires ont été effectuées, ainsi que des études immunohistochimiques. Nous avons démontré que l’haplo-insuffisance d’Alk1 aggrave la microalbuminurie et induit une perte de podocytes chez des souris diabétiques. De plus, une augmentation significative de l’apoptose glomérulaire a été observée chez les souris Alk1ΔEC hétérozygotes diabétiques. L’analyse de souris Alk1ΔEC homozygotes non diabétiques a également révélé une perte importante de cellules endothéliales glomérulaires. Ensemble, ces données suggèrent que la signalisation du récepteur Alk1 joue un rôle essentiel dans le maintien des cellules endothéliales glomérulaires et participe au maintien de l’intégrité glomérulaire à travers un mécanisme de podocyte-endothelial cross-talk. / Diabetic kidney disease one of the most frequent microvascular long-term complications in diabetic patients and is the first cause for the need for dialysis. The glomerular damage seems to play a key role in the development of diabetic nephropathy. Thickening of the glomerular basement membrane, glomerular cell hypertrophy, and podocyte loss is among the main pathological changes occurring during diabetic nephropathy and can lead to proteinuria. Endothelial dysfunction has been suggested to play an important role in the pathogenesis of glomerular damage during diabetic kidney disease. Indeed, alteration of the glomerular endothelial cell function and integrity is a leading cause of microalbuminuria observed in early diabetic kidney disease. Injury to glomerular endothelial cells may lead to podocyte damage, while podocyte loss further exacerbates glomerular endothelial cell injury, forming a vicious cycle. Currently, therapies in diabetic nephropathy are focusing on glycemia control and adequate arterial pressure levels in order to maintain an adequate glomerular filtration rate. However, the study of some treatments that may target endothelial lesions or podocyte-endothelial cell interactions, which play a vital role in the progression of diabetic kidney disease is necessary. It has been suggested that antiangiogenic treatments for diabetic kidney disease could provide therapeutic benefits. Indeed, anti-angiogenic factors such as VEGF inhibitors have been demonstrated to suppress renal damage and glomerular alterations in a diabetic mouse model. However, some other data have shown that anti-VEGF injections could be detrimental for podocytes and endothelial cells. Thus, new molecules targeting the vascular endothelium could possibly improve prognosis and quality of life in patients with early stages of diabetic kidney disease. We have previously shown that Alk1, along with its ligand BMP9, plays an important function to maintain vascular integrity in diabetic animals. Loss of Alk1 signaling in diabetic animals led to dissociation of vascular junctions and increased vascular leakage. Given its role in the maintenance of endothelial quiescence and integrity, we evaluated the effects of Alk1 suppression on kidney integrity and renal function in diabetic mice. 6 We used mice with conditional deletion of Alk1 in the endothelium (Alk1ΔEC) to evaluate the role of Alk1 in glomerular filtration in STZ-induced diabetic mice. Mice were euthanized four months after the onset of diabetes and urine, and serological analyzes were performed, along with immunohistochemical studies. We demonstrated that Alk1 haploinsufficiency worsens microalbuminuria and induces podocyte loss. Furthermore, a significant increase in glomerular apoptosis was observed in Alk1ΔEC mice. Analysis of homozygous Alk1ΔEC mice also revealed a significant loss of glomerular endothelial cells. Together, these data suggest that Alk1/BMP9 signaling plays a critical role in the maintenance of glomerular endothelial cells and has important functions to maintain glomerular integrity through a crosstalk podocyte-endothelial mechanism.

"Thèse en cotutelle présentée pour obtenir le grade de docteur de l'Université de Bordeaux et de l'Université Laval"--Page de titre / Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de mortalité dans le monde, engendrant le décès de plus de 17 millions de personnes par an. Ce chiffre éloquent augmentera jusqu’à atteindre selon l’OMS 23,4 millions de décès en 2030. Ces maladies sont associées à un rétrécissement de la lumière des vaisseaux sanguins qui peut entrainer une occlusion partielle ou complète du vaisseau. Le traitement le plus souvent utilisé est un traitement chirurgical visant à créer un pont qui va contourner la section obstruée, ou une section lésée. Actuellement, les conduits les plus utilisés pour les greffes sont les vaisseaux autologues, à savoir la veine saphène ou l’artère thoracique interne. Seulement, ces substituts ne peuvent être utilisés en remplace ment que s ’ils sont sains. L’alternative aux vaisseaux autologue s est l’utilisation de substituts synthétiques. Compte tenu du manque de biocompatibilité de ces greffons synthétiques, après quelques années seulement, une thrombose peut apparaitre. Une des cause s e st l’absence de cellules endothéliales (CEs) dans la lumière du substitut. Le point clé réside ici dans la fabrication d’un matériau capable de fournir au CEs un environnement favorable à leur adhésion et leur prolifération pour permettre la génération d’un endothélium dans la lumière du substitut synthétique. In vivo, les cellules capables de coloniser de tels matériaux sont les cellules progénitrices endothéliales, ces cellules sont capables de se différencier en cellules endothéliales matures et possèdent une capacité de prolifération supérieure aux cellules matures. Elles sont capables de réparer les vaisseaux et pourront donc être ciblées afin d’être recrutées in situ et ainsi endothélialiser le biomatériau. C’est dans ce contexte que nous avons choisi de modifier de façon chimique la surface d’un matériau modèle, un film de polyéthylène téréphtalate avec quatre principes actifs innovants sélectionnés pour leur capacité à induire l’adhésion des cellules ou leur différentiation pour permettre la régénérat ion d’un endothélium à la surface du matériau. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à concevoir et élaborer une méthode de fonctionnalisation homogène de ce polymère (par un lien covalent principe actif/matériau) par différents principes actifs avec une densité contrôlée et reproductible. Puis, ces principes actifs ont été disposés sous la forme de micro - patrons en surface du polymère par le biais de la technique de photolithographie. Ici, les peptides GRGDS et GHM ont été greffés pour améliorer l’adhésion des cellules, le dernier étant spécifique aux cellules endothéliales progénitrices. Le peptide SFLLRN et la sitagliptine ont été greffés pour induire ou accélérer la différenciation des EPCs en CEs matures. Toutes les surfaces ont été caractérisées pour valider le greffage covalent et connaitre la densité de molécules bioactives greffée. D’autre part avec une caractérisation approfondie des EPCs issues du sang de cordon ombilical, certains gènes et leur expression caractéristique des cellules souches et endothéliales ont été suivis par immunofluorescence et RT-qPCR pour déterminer leur état de différenciation. Ce travail n’aura été possible qu’après avoir déterminé quels gènes de références nous pouvions utiliser pour étudier le phénotype de trois types cellulaires à savoir, les cellules mononucléées CD34+, les EPCs et des CEs matures (extraites de la veine saphène). Finalement, ce projet de recherche a permis de mettre en évidence que certaines molécules bioactive s permettent d’améliorer l’adhésion de cellules mais peuvent aussi avoir un rôle pour accélérer ou retarder la différenciation des cellules. Aussi, la taille des micromotifs (micropatrons) a un impact sur l’expression de certains gènes spécifiques de la lignée endothéliale. En conclusion générale, ce projet prouve que la modification de surfaces des substituts avec des molécules bioactives est indispensable pour rendre le matériau attractif et pour régénérer un endothélium à la surface de celui-ci. Ce travail nous a aidé s à souligner l’importance de comprendre le comportement des EPCs et leur cinétique de différenciation pour leur utilisation en ingénierie vasculaire. / Cardiovascular disease is one of the leading causes of death in the world, killing more than 17 million people a year. This eloquent figure will increase to 23.4 million deaths in 2030, according to the WHO. These diseases are associated with a narrowing of the lumen of the blood vessels that may cause partial or complete occlusion of the vessel. The treatment most often used is a surgical treatment designed to create a bridge that will bypass the obstructed section or an injured section. Currently, the most used conduits for transplants are autologous vessels, namely the saphenous vein or the internal thoracic artery. Only these substitutes can only be used as a replacement if they are healthy. The alternative to autologous vessels is the use of synthetic substitutes. Due to a certain lack of biocompatibility of these synthetic grafts, after only a few years, a phenomenon of thrombosis sets in; the absence of endothelial cells (ECs) that cover the interior of t he substitute. The key point her e lies in the manufacture of a material capable of providing the ECs with a favorable environment for their adhesion and proliferation to allow the generation of an endothelium within a synthetic substitute. In vivo, cells capable of colonizing such materials are endothelial progenitor cells, these cells are capable of differentiating into mature endothelial cells and possess a higher proliferation capacity than mature cells. They are able to repair the vessels and can, therefore, be targeted to be recruited in situ and thus endothelialize the biomaterial. It is in this context that we have chosen to chemically modify the surface of a model material, a PET film with four innovative active ingredients selected for their ability to induce cell adhesion or differentiation to allow regeneration. an endothelium on the surface of the material. This project has initially made it possible to develop a protocol for grafting active ingredients covalently with a reproducible density and in a microstructured manner using photolithography. Here, the GRGDS and GHM peptides were grafted to enhance cell adhesion, the latter being specific to endothelial progenitor cells. The SFLLRN peptide and sitagliptin have been grafted to induce or accelerate the differentiation of EPCs into mature ECs. All surfaces have been characterized to validate covalent grafting and to know the density of grafted bioactive molecules. On the other hand, with a thorough characterization of EPCs from umbilical cord blood, some characteristic genes and proteins expression of stem and endothelial cells were followed by immunofluorescence and RT-qPCR to determine their state of differentiation. This work will have been possible only after determining which reference genes we could use to study the phenotype v of three cell types namely, CD34 + mononuclear cells, EPCs and mature ECs (saphenous vein extract). Finally, this research project has shown that some bioactive molecules can improve cell adhesion but can also have a role to accelerate or delay cell differentiation. Also, the size of the micropatterns has an impact on the expression of certain genes specific to the endothelial line age. As a general conclusion, this project proves that surface modification of substitutes wit h bioactive molecules is essential to make the material attractive and to regenerate an endothelium on the surface of it. This work has helped us emphasize the importance of understanding the behavior of EPCs and their kinetics of differentiation for their use in vascular engineering.

L'accident vasculaire cérébral (AVC) déclenche une perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et entrave la récupération des tissus en altérant le microenvironnement cérébral local. L'administration de l'activateur tissulaire du plasminogène (rtPA) dans une fenêtre thérapeutique étroite de 4,5 heures après l'AVC demeure le seul traitement existant. Au-delà de cette fenêtre, le tPA aggrave la perturbation de la BHE et provoque des transformations hémorragiques. La voie canonique Wnt est connue comme induisant la formation et la maturation de la BHE pendant l'ontogenèse. Nous émettons l'hypothèse que la voie est nécessaire pour maintenir l'intégrité de la BHE après un AVC et que son activation pourrait constituer une approche prometteuse pour améliorer le traitement par rtPA. Ainsi, nous avons d'abord évalué l'activité de la voie dans le cerveau de souris soumises à un modèle d’AVC. Ensuite, nous avons évalué l’effet de la désactivation de la voie sur l’intégrité de la BHE ainsi que son activation dans un contexte d'administration retardée de rtPA. Nos résultats montrent que l'activité de la voie est induite spécifiquement dans les cellules endothéliales cérébrales après un AVC ischémique. La désactivation de la voie par un inhibiteur aggrave la dégradation de la BHE et augmente l'incidence des transformations hémorragiques spontanées sans affecter l’infarct. En revanche, l'activation de la voie par un activateur spécifique, la 6-bromoindirubine-3'-oxime (6-BIO), atténue la dégradation de la BHE et réduit l'incidence des transformations hémorragiques associées à l'administration retardée du rtPA en induisant l’expression d’une protéine des jonctions serrées (claudine 3) et atténue la perméabilité basale endothéliale en réprimant l'expression de PLVAP, sans affecter l'infarctus, la vascularisation ou l'inflammation du cerveau. Notre étude démontre que l'activation de la voie canonique Wnt constitue une stratégie cliniquement pertinente pour étendre la fenêtre thérapeutique du rtPA en atténuant la dégradation de la BHE via la régulation des mécanismes spécifiques à la BHE. / Stroke triggers blood-brain barrier (BBB) disruption and hampers tissue recovery by impairing the local brain microenvironment. Administration of recombinant tissue plasminogen activator (rtPA) within a therapeutic window of 4.5 hours after onset constitutes the only existing treatment. Beyond this window, tPA worsens BBB disruption and causes haemorrhagic transformation. Canonical Wnt pathway induces BBB formation during ontogeny. We hypothesize here that pathway activity is required to maintain BBB integrity after stroke and that its activation might constitute a promising approach to improve rtPA therapy via protection of the BBB. Therefore, we have first assessed pathway activity in the brain of mice subjected to transient middle cerebral artery occlusion (MCAo). Next, we have evaluated the effect of pathway deactivation early after stroke on BBB integrity Finally, we have assessed the potential of pathway activation on BBB breakdown associated to the delayed administration of rtPA. Our results show that pathway activity is induced specifically in brain endothelial cells early after ischemic stroke. Early deactivation of the pathway using a potent inhibitor, XAV939, aggravates BBB breakdown, and increases the incidence of spontaneous haemorrhagic transformation, without affecting brain infarct. On the other hand, pathway activation using a potent specific activator, 6-Bromoindirubin-3’-oxime (6-BIO), attenuates BBB breakdown, and reduces the incidence of haemorrhagic transformation associated to delayed rtPA administration by inducing expression of the tight junction claudin-3, and attenuates endothelial basal permeability by repressing the expression of PLVAP, without affecting brain infarct, vascularization and inflammation. Our study demonstrates that activation of the canonical Wnt pathway constitutes a clinically relevant strategy to extend the therapeutic window of rtPA by attenuating BBB breakdown via regulation of BBB-specific mechanisms