La fibrilline-1, composant majeur des microfibrilles et second composant majeur des fibres élastiques, est une glycoprotéine dont la mutation du gène chez l'humain est responsable du syndrome de Marfan, caractérisé par des anévrismes et des dissections aortiques. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié d'une part le rôle de la fibrilline-1 dans la physiologie des cellules endothéliales vasculaires humaines et d'autre part la conséquence du déficit quantitatif de la fibrilline-1 sur la structure et la fonction du système cardiovasculaire au cours du vieillissement chez la souris. Le fragment de fibrilline-1 "PF14" induit une signalisation calcique via les intégrines α5β1 et αvβ3, l'activation de la phospholipase C et la mobilisation des réserves intracellulaires de calcium, ainsi que la prolifération et la migration des cellules endothéliales humaines. La déficience quantitative sévère ou totale de la fibrilline-1 entraîne une létalité chez la souris dans les deux semaines après la naissance alors que celle, partielle, due à la délétion hétérozygote hypomorphique des exons 19 à 24 du gène de la fibrilline-1 (délétion mgΔ) n'affecte pas la longévité des souris. Les souris Fbn-1+/mgΔ présentent une hypertrophie cardiaque et une hypotension ainsi que des anévrismes aortiques qui deviennent plus fréquents avec l'âge. La paroi aortique de ces souris présente des altérations structurales (fragmentations des lames élastiques), biomécaniques (l'augmentation de la rigidité) et de la vasomotricité, qui s'accentuent avec l'âge. Nos résultats suggèrent que la déficience quantitative de la fibrilline-1 pourrait altérer la signalisation que cette protéine déclenche normalement dans les cellules endothéliales dès la phase de morphogénèse artérielle, et induire en conséquence une pathologie anévrismale de la paroi aortique au cours du vieillissement. Les effets opposés des déficiences quantitatives en fibrilline-1 et en élastine sur la fonction vasculaire suggèrent des rôles opposés pour ces deux composants majeurs des fibres élastiques. Ce travail permet par ailleurs de valider les souris Fbn-1+/mgΔ, tant sur le plan structural que fonctionnel, comme modèle du syndrome de Marfan.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Haemophilus parasuis est un pathogène porcin causant la maladie de Glässer caractérisée par de la polysérosite fibrineuse, polyarthrite, méningite et septicémie. La pathogenèse de l’infection et les facteurs de virulence sont encore mal connus. Le site de colonisation de Haemophilus parasuis dans le tractus respiratoire supérieur est controversé. Pour accéder à la circulation sanguine, H. parasuis doit envahir la muqueuse. H. parasuis adhère à des cellules épithéliales porcines de trachée (NPTr). Pour accéder au système nerveux central et causer la méningite, H. parasuis doit traverser la barrière hémato-méningée. H. parasuis adhère à et envahit des cellules endothéliales porcines de microvaisseaux cérébraux (PBMEC) provenant de la BBB. Le but de cette étude était d’étudier certaines interactions entre H. parasuis et son lipooligosccharide (LOS), et des cellules endothéliales et épithéliales porcines. Les résultats démontrent que l’adhésion de H. parasuis Nagasaki aux NPTr et aux PBMEC est en partie médiée par son LOS. H. parasuis induit l’apoptose des NPTr et des PBMEC, mais le LOS ne semble pas impliqué. H. parasuis, et à un niveau moindre son LOS, stimulent la sécrétion d’interleukine- (IL) 6 et d’IL-8. Différentes souches de H. parasuis sérotypes 4 et 5 (sérotypes les plus prévalents en Amérique du Nord) stimulent également les NPTr et PBMEC à produire IL-6 et IL-8. Les résultats suggèrent que le LOS de H. parasuis joue un certain rôle dans la pathogenèse de l’infection, mais d’autres composantes bactériennes sont également impliquées. / Haemophilus parasuis is a swine pathogen that causes Glässer’s disease characterized by fibrinous polyserositis, polyarthritis, meningitis and septicemia. The pathogenesis of the infection and virulence factors are not well known. Whether the upper respiratory tract is the site of colonization of H. parasuis is still a controversial issue. H. parasuis must invade the mucosa to gain access to the bloodstream. H. parasuis is able to adhere to newborn pig trachea cells (NPTr). H. parasuis must then cross the blood-brain barrier to gain access to the central nervous system in cases of meningitis. H. parasuis is able to adhere to and invade porcine brain microvascular endothelial cells (PBMEC). The aim of this work was to study the interactions between H. parasuis, its lipooligosccharide (LOS), and porcine endothelial and epithelial cells. Results showed that adhesion of H. parasuis Nagasaki to NPTr and PBMEC was partially mediated by its LOS. H. parasuis induced NPTr and PBMEC apoptosis, although purified LOS does not seem to be involved. H. parasuis, and to a lesser extent its LOS, stimulated the release of interleukin- (IL) 6 and IL-8. Field strains of H. parasuis serotypes 4 and 5 (the most prevalent serotypes in North America) also induced the production of IL-6 and IL-8. Results suggest that H. parasuis LOS plays a role in the pathogenesis of the infection, but other bacterial components are also involved.

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.

Les cellules dérivées de la moelle osseuse, principalement les cellules endothéliales progénitrices, sont réduites chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Leur mobilisation et leur incorporation aux sites de lésion vasculaire sont des évènements prépondérants dans l’accélération des processus de réendothélialisation. Dans un modèle murin, le 17β-estradiol favorise les processus de guérison vasculaire par la mobilisation et le recrutement des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse. Il existe présentement plusieurs stratégies afin d’augmenter la mobilisation des cellules progénitrices ainsi que leur incorporation à la paroi vasculaire. Cependant, peu d’études privilégient la livraison locale d’un nombre élevé de cellules progénitrices fonctionnelles par un véhicule biodégradable et leur maintien au site de lésion afin de favoriser la réendothélialisation ciblée. Un polymère d’intérêt pour cette application s’avère être le chitosan. Ce biopolymère non toxique et biodégradable est couramment utilisé dans l’ingénierie tissulaire et, depuis peu, est utilisé dans la guérison vasculaire. Le chitosan complexé à la phosphorylcholine voit sa solubilité s’accroître dans les solutions aqueuses ainsi que sa biocompatibilité cellulaire en condition physiologique. Le projet de ce mémoire visait donc : 1) à étudier in vitro, la capacité d’un polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine à influencer l’adhésion, la survie, la différenciation et la fonctionnalité cellulaire dans un modèle murin de culture mixte de cellules dérivées de la moelle osseuse et 2) de déterminer l’impact de la présence du 17β-estradiol sur ces mêmes comportements cellulaires. Nos travaux démontrent que la matrice de chitosan-phosphorylcholine s’avère compatible avec notre modèle de culture cellulaire. En effet, ce polymère est capable de promouvoir l’organisation et le développement des cellules dérivées de la moelle osseuse de façon comparable à la matrice normalement utilisée dans la croissance in vitro des cellules endothéliales progénitrices, la fibronectine. De plus, ce polymère n’a nullement compromis l’activité migratoire des cellules, laissant supposer qu’il pourrait éventuellement être un véhicule approprié pour effectuer une livraison cellulaire à un site de lésion. Il s’avère que le 17β-estradiol, lorsqu’ajouté au milieu de culture ou complexé au polymère de chitosan phosphorylcholine, est capable de moduler le comportement cellulaire, et ce, de façon différente. Le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine démontre, par rapport à sa forme soluble, une plus grande aptitude à accroître le nombre de cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. De plus, le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine permet une amplification marquée des cellules endothéliales progénitrices et leur offre un support adéquat afin de favoriser la guérison vasculaire. L’ensemble de nos travaux suggère que le polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine en présence ou non de 17β-estradiol est une matrice compatible avec les cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. Le 17β-estradiol complexé au polymère est toutefois plus efficace que sa forme soluble à promouvoir l’amplification du nombre de cellules progénitrices. Ce polymère représente un outil thérapeutique attrayant et une matrice de livraison d’agent bioactif prometteuse pour le recrutement cellulaire dans l’accélération de la guérison vasculaire. / Bone marrow derived cells, including endothelial progenitor cells, are reduced in numbers in patient with cardiovascular disease or risk factors. Mobilization and incorporation of these cells at the vascular lesion site are important events in the reendothelialization process. 17β-estradiol was shown in a mouse model of injury, to favour this healing process through mechanisms which involve the mobilization and incorporation of endothelial progenitor cells derived from the bone marrow. At the moment, there are many strategies to increase endothelial progenitor cells mobilization as well as recruitment into the vascular wall. However, few studies favour local delivery of a large number of functional progenitor cells on a biodegradable scaffold and to maintain them at the lesion site in order to promote reendothelialization. An interesting biopolymer for this application is chitosan. This non toxic and biodegradable biopolymer is commonly used in tissue engineering and was recently used in vascular healing. Phosphorylcholine modified chitosan can increase the water solubility and cell biocompatibility of the biopolymer in physiological condition. This master project was thus designed to :1) evaluate, in vitro, the capacity of phosphorylcholine modified chitosan to influence cell adhesion, survival, differentiation and functionality in a mouse model of bone marrow mixed culture and 2) determine the impact of 17β-estradiol on these cell behaviours. Our results suggest an adequate biocompatibility of phosphorylcholine modified chitosan with our cell culture system. Indeed, this polymer was able to promote cell organization and development of bone marrow derived cells in the same way that fibronectin, the most commonly matrix used in the progenitor cells in vitro culture. Moreover, cell migratory activity was not compromised by the chitosan polymer. It appears that 17β-estradiol, when added to cell culture media or attached on phosphorylcholine modified chitosan is able to modulate differently cell behaviour. Our data suggest that 17β-estradiol coupled to the chitosan polymer was superior to increase the number of haematopoietic and endothelial progenitor cells derived from bone marrow in vitro compared to the soluble form. 17β-estradiol coupled to the polymer of phosphorylcholine modified chitosan allowed an increased amplification of progenitor cell number and provided adequate scaffold to favour vascular healing. We propose that phosphorylcholine modified chitosan in presence or not of 17β-estradiol is a compatible matrix with bone marrow derived progenitor cells in vitro. 17β-estradiol enhances the amplification of progenitor cell in vitro when associated to the polymer compared to its soluble form. This biopolymer may be an attractive matrix and a promising vehicle in a drug delivery therapeutic system for progenitor cells recruitment and to promote vascular healing.

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène. / Evidence supports the contribution of immune responses in atherosclerosis development in part by alterations in the endothelium activation status and by the recruitment of inflammatory cells triggered by cardiovascular risk factors. These alterations are the principal cause of endothelial dysfunction defined as the key step contributing to the development of atherosclerosis. Via the transcription of genes related to inflammation, the Toll-like receptor-2 (TLR2) is involved in endothelial cell activation. It generally recognizes microbial molecules but also non-infectious endogenous factors such as those secreted by damaged tissues from the endothelial dysfunction. Thus, activation and signalization of the TLR2 are closely linked with the development of atherosclerosis. Epidemiological studies have confirmed the atheroprotective role of estrogen through multiple mechanisms of action. Thus, to better interpret the potential benefits of estrogen on the cardiovascular system, we sought to identify new molecular targets such as TLR2 regulation. For the first time in mouse vascular endothelial cells (EC), our results have confirmed the anti-inflammatory effect of estrogen via the decreased expression and activity of TLR2. We also determined the influence of estrogen on the profile of the inflammatory response triggered through this receptor by measuring endothelial migration and adhesion potentials. Furthermore, we demonstrated the interaction between estrogen and TLR2 signalling pathways with a negative influence of estrogen on the phosphorylation level of kinases activated by this receptor. Thus, our study brings new insights into the endothelial regulation of TLR2 and highlights rapid anti-inflammatory and cardioprotective effects from estrogen.

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques. / When atherosclerotic vascular obstructions are so extensive that direct revascularization techniques cannot be undertaken successfully, the severity of residual tissue ischemia will depend in large part on the ability of the organism to spontaneously develop new blood vessels (neovascularization). The mechanisms involved in neovascularization depend on the oxidative stress balance. Increased oxidative stress is a common feature of all cardiovascular risk factors and particularly aging. In the vascular wall, CuZnSOD is the predominant antioxidant enzyme. Nevertheless, its specific role in vascular aging and new blood vessels formation is currently unknown. Accordingly, we hypotheze that 1) CuZnSOD deficiency reduces neovascularization in response to ischemia 2) this reduction is partly due to vascular aging affecting mature endothelial cells and endothelial progenitor cells. We have demonstrated that CuZnSOD deficiency significantly reduces neovascularization in response to ischemia. This reduction is associated with increased oxidative stress and reduced NO bioavailability. CuZnSOD deficiency significantly decreases EPCs number (bone marrow, spleen). Moreover, these EPCs present significant increased oxidative stress levels, reduced NO production and decreased migration and incorporation into tubular-like structures capacities. Importantly, neovascularization in CuZnSOD deficient-mice can be rescued by an EPCs supplementation from control mice. vii We have also demonstrated that the blood flow recovery following ischemia was significantly reduced with aging. Both in old and young mice, CuZnSOD deficiency led to a further reduction of neovascularization. Interestingly, the resulting neovascularization potential in young CuZnSOD-deficient mouse was similar to that of an older wild type mouse. Oxidative stress levels were also increased to similar levels in these two groups. Both aging and CuZnSOD deficiency were associated with reduced number of bone marrow and peripheral EPCs. The effect of moderate aging alone on specific functional activities of EPCs was modest. However, CuZnSOD deficiency was associated with severe age-dependent defect in EPC fucntional activities. In summary, our resultats suggest that CuZnSOD protection against oxidative stress is essential for EPC functional activities and neovascularization in response to ischemia. The defective neovascularization observed in CuZnSODdeficient mice is associated with accelerated vascular aging. Our results suggest that in aging context, CuZnSOD has a critical role limiting increased oxidative stress and protecting both EPC functional activities and ischemic tissues integrity.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

De nombreuses études ont contribué à dévoiler les mécanismes à la base de l’athérosclérose. Cette maladie est médiée par un important déséquilibre homéostatique, qui entraine une inflammation vasculaire contribuant à sa progression. Plusieurs équipes de recherche ont axé leurs investigations sur l’étude d’importants biomarqueurs inflammatoires telle que la protéine C-réactive (CRP). Considérée comme facteur de risque de maladies cardiovasculaires, cette dernière participe aussi aux différents stades du développement de l’athérosclérose. Notre étude révèle pour la toute première fois un processus d’auto-induction de l’expression de la CRP régit par les CE vasculaires. Ce mécanisme représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour la prévention de l’athérosclérose. L’estrogène (E2) est une hormone féminine qui possède un rôle athéroprotecteur via entre autres, la modulation de la réponse inflammatoire. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si elle avait un effet bénéfique sur le profil athérogénique de la CRP exprimée par les cellules endothéliales (CE). En effet, nos travaux ont démontré que l’E2 a la capacité de moduler le rétrocontrôle positif de l’expression de la CRP, contribuant à diminuer également le profil inflammatoire de cette dernière. De plus, nous avons établi que l’E2 restitue une importante voie pro-angiogénique impliquant la réponse migratoire des CE au VEGF, en contrant l’effet d’inhibition de la CRP. Cette nouvelle découverte nous a permis d’éclaircir un important mécanisme de guérison vasculaire de cette hormone dans un contexte inflammatoire. Ainsi, ces données contribuent à mieux comprendre la production endogène de la CRP par les CE vasculaires et l’activité cardioprotectrice de l’E2. / Numerous studies have contributed to reveal the mechanisms underlying cardiovascular diseases such as atherosclerosis. This disease is mediated by an important homeostatic imbalance, which causes vascular inflammation contributing to its progression. Several research groups have focused their studies on inflammatory biomarkers such as C-reactive protein (CRP). Considered as a risk factor for cardiovascular diseases, it also participates in various stages of atherosclerosis development. Our study shows for the first time a process of self-induction of the CRP expression regulated by vascular EC. This mechanism represents a new potential therapeutic target for the prevention of atherosclerosis formation. Estrogen (E2) is a female hormone which has an atheroprotective role through various vascular regulation mechanisms including modulation of the inflammatory response. Thus, we sought to determine whether it had a beneficial effect on atherogenic profile of CRP expressed by endothelial cells (EC). Indeed, our work has demonstrated for the first time that E2 has the ability to modulate the CRP expression positive feedback identified in our study, which also helps to reduce the inflammatory profile of the latter. In addition, we determined that E2 restores an important proangiogenic response involving migration of vascular EC to VEGF, by countering the inhibition effect of CRP. This new discovery has enabled us to clarify an important vascular healing mechanism of this hormone in an inflammatory context. Thus, these data provide further advances that contribute to a better understanding of the endogenous CRP production by vascular EC and the cardioprotective activity of E2.