La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau / Multiple Sclerosis is an inflammatory demyelinating disease in which immune cells from the peripheral blood infiltrate the central nervous system (CNS) to cause a pathologic neuroinflammatory reaction. Blood borne leucocytes cross the restrictive cerebral endothelium, the blood brain barrier (BBB), to gain access to the CNS parenchyma and cause cellular damage leading to the characteristic demyelinating lesions. The BBB is the interface between the blood and the CNS and as such is a critical mediator of neuro-immune reactions and an important therapeutic target to modulate neuroinflammation. It is essential to have a better understanding of the molecular mechanisms that regulate the BBB properties to elaborate new therapeutic strategies to modulate the BBB and thus the local neuroinflammation reaction. This Ph.D. thesis describes three distinct molecular mechanisms which regulate key BBB properties. The first section describes a novel role for the renin-angiotensin system (RAS) in the neuro-vascular unit (NVU) as a regulator of paracellular permeability. The second part of this thesis characterises the role of a novel adhesion molecule of the BBB, ALCAM. The third part of this work studies the interactions between neural stem cells (NSC) and the BBB and identifies MCP-1 as a critical factor involved in NSC recruitment to the CNS. In the first experimental section we provide evidence that angiotensinogen (AGT) produced and secreted by astrocytes, is cleaved into angiotensin II (AngII) and acts on type 1 angiotensin receptors (AT1) expressed by BBB endothelial cells (ECs). Activation of AT1 restricts the passage of molecular tracers across human BBB-derived ECs through threonine-phosphorylation of the tight junction protein occludin and its mobilization to lipid raft membrane microdomains. We also show that AGT knockout animals have disorganized occludin strands at the level of the BBB and a diffuse accumulation of the endogenous serum protein plasminogen in the CNS, as compared to wild type animals. Finally, we demonstrate a reduction in the number of AGT-immunopositive perivascular astrocytes in multiple sclerosis (MS) lesions, which correlates with a reduced expression of occludin similarly seen in the CNS of AGT knockout animals. Such a reduction in astrocyte-expressed AGT and AngII is dependent, in vitro, on the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ. Our study defines a novel physiological role for AngII in the CNS and suggests that inflammation-induced downregulation of AngII production by astrocytes is involved in BBB dysfunction in MS lesions. In the second experimental part we focus on adhesion molecules of the BBB. Using a lipid raft-based proteomic approach, we identified ALCAM (Activated leukocyte cell adhesion molecule) as an adhesion molecule involved in leukocyte migration across the BBB. ALCAM expressed on BBB endothelium co-localized with CD6 expressed on leukocytes and with BBB endothelium transmigratory cups. ALCAM expression on BBB cells was up-regulated in active multiple sclerosis and experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE) lesions. Moreover, ALCAM blockade restricted transmigration of CD4+ lymphocytes and monocytes across BBB endothelium in vitro and in vivo, and reduced the severity and time of onset of EAE. Our findings point to an important role for ALCAM in leukocyte recruitment into the brain and identify ALCAM as a potential therapeutic target to dampen neuroinflammation. The third experimental part of this thesis studies the interactions between NCS and BBB. NCS represent an attractive source for cell transplantation and neural tissue repair. After systemic injection, NCS are confronted with the specialized BBB endothelial cells before they can enter the brain parenchyma. We investigated the interactions of human fetal neural precursor cells with human brain endothelial cells in an in vitro model using primary cultures. We demonstrated that human fetal neural precursor cells efficiently and specifically migrate to sub-endothelial space of human BBB-endothelium, but not pulmonary artery endothelial cells. When migrated across BBB-endothelial cells, fetal neural precursor cells spontaneously differentiate to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Effective migration and subsequent differentiation was found to be dependant on the chemokine CCL2/MCP-1, but not CXCL8/IL-8. Our findings suggest that an intact blood-brain barrier is not an intrinsic obstacle to neural stem cell migration into the brain and that differentiation of neural precursor cells occur in a sub-endothelial niche, under the influence of the chemokine CCL2/MCP-1. These three experimental sections demonstrate the crucial roles that the BBB plays in regulating the CNS homeostasis. Under pathological conditions, such as during neuro-immune reactions, the BBB is altered and becomes an important local player. The three different molecular mechanisms described in this thesis, contribute to our understanding of the BBB and may allow for the development of novel therapeutic strategies to limit neuroinflammation.

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par l'accumulation de cholestérol dans la paroi artérielle et associée à une réponse immunitaire anormale dans laquelle les macrophages jouent un rôle important. Récemment, il a été démontré que les vaisseaux lymphatiques jouent un rôle primordial dans le transport inverse du cholestérol (Martel et al. JCI 2013). L’objectif global de mon stage de maîtrise a été de mieux caractériser la dysfonction lymphatique associée à l’athérosclérose, en étudiant de plus près l’origine physiologique et temporelle de ce mauvais fonctionnement. Notre approche a été d’étudier, depuis l’initiation de l’athérosclérose jusqu’à la progression d’une lésion athérosclérotique tardive, la physiologie des deux constituants principaux qui forment les vaisseaux lymphatiques : les capillaires et collecteurs lymphatiques. En utilisant comme modèle principal des souris Ldlr-/-; hApoB100+/+, nous avons pu démontrer que la dysfonction lymphatique est présente avant même l’apparition de l’athérosclérose, et que cette dysfonction est principalement associée avec un défaut au niveau des vaisseaux collecteurs, limitant ainsi le transport de la lymphe des tissus périphériques vers le sang. De plus, nous avons démontré pour la première fois l’expression du récepteur au LDL par les cellules endothéliales lymphatiques. Nos travaux subséquents démontrent que ce défaut de propulsion de la lymphe pourrait être attribuable à l’absence du récepteur au LDL, et que la dysfonction lymphatique observée précocement dans l’athérosclérose peut être limitée par des injections systémiques de VEGF (vascular endothelial growth factor) –C. Ces résultats suggèrent que la caractérisation fonctionnelle de la capacité de pompage des vaisseaux collecteurs serait une condition préalable à la compréhension de l'interaction entre la fonction du système lymphatique et la progression de l'athérosclérose. Ultimement, nos travaux nous ont amené à considérer de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la prévention et le traitement de l’athérosclérose. / Atherosclerosis is driven by the accumulation of cholesterol in the arterial wall, which triggers an inappropriate immune response in which macrophages play an important role. It has now been shown that the lymphatic vessels play an important role in reverse cholesterol transport (Martel et al. JCI 2013). The overall objective of my Master internship was to better characterize lymphatic dysfunction associated with atherosclerosis, studying closely the physiological and temporal origin of this pathological feature. Our approach was to study, from the initiation of atherosclerosis to the progression of the atherosclerotic lesion, the physiology of the two main components that form the lymphatic vessels: the lymphatic capillaries and collectors. Using a mouse model that closely resembles human atherosclerosis (Ldlr-/-; hApoB100+/+) we have demonstrated that lymphatic dysfunction is present before the onset of atherosclerosis, and that this dysfunction is primarily associated with a defect in the collecting vessels, thereby limiting the lymph transport from peripheral tissues to the blood. In addition, we have clearly demonstrated, for the first time to our knowledge, the presence of the LDL receptor on lymphatic endothelial cells. Our subsequent work shows that this reduction in lymph flow could be due to the absence of the LDL receptor, and that lymphatic transport can be restored by systemic injections of VEGF (vascular endothelial growth factor) –C. These results suggest that the functional characterization of the pumping capacity of the collecting vessels would be a prerequisite for the understanding of the interactions between the function of the lymphatic system and the progression of atherosclerosis. Altogether, our work unveils new potential therapeutic targets for the prevention and treatment of atherosclerosis.

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale. / Angiogenesis and increased vascular permeability are key component of tumor growth and progression. Consequently, numberous efforts are currently deployed to illucidate the molecular mecanisms contributing to the formation and remodelling of blood vessels in oder to identify new potential therapeutic targets. In that thought, the work of this thesis was focused on the protein tyrosine phosphatase DEP-1, initially identified as a negative regulator of proliferation and VEGFR2 phosphorylation when highly expressed in endothelial cells. However, using RNAi, it was shown that through its capacity to dephosphorylate the inhibitory tyrosine of Src (Y529), DEP-1 could also positively regulate Src activation in endothelial cells in response to VEGF. As Src is a central promoter of angiogenesis and vascular permeability, we showed that DEP-1 was a promoter of these vascular functions in vitro and that the tyrosine phosphorylation of its C-terminal tail, allowing interaction and activation of Src, was required. Interestingly, the catalytic inactivation of DEP-1 in mice resulted in increased proliferation in endothelial cells, but also in desorganization of vascular structures which contrast the absence of phenotype in DEP-1 complete knock-out mice (KO). The work of this thesis demonstrates for the first time that DEP-1 deletion causes inhibition of Src and one of its substrate, VE-Cadherin, activation in response to VEGF in Dep-1 KO mice, which develop normally. Our results show the crucial role of DEP-1 in VEGF-induced vascular permeability and capillary formation in vivo. Consequently, tumor growth and lung metastases formation were inhibited due to reduced tumor vascularisation causing reduced proliferation and increased apoptosis of tumor cells. Accordingly, high expression of DEP-1 in tumor-associated blood vessels of breast cancer patients correlates with greater tumor vascularisation. In addition to DEP-1 role in post-natal angiogenic response, our work also demonstrates the important role of DEP-1 during retinal vascularisation, an in vivo developmental angiogenesis model. In this context, DEP-1 inhibits proliferation of endothelial cells and limits their sprouting by allowing adequate β-catenin-dependant expression of Dll4, a Notch ligand regulating developmental vascularisation organisation. DEP-1 allows β-catenin stabilisation via inactivation of GSK3β, an important regulator of β-catenin degradation, in response to VEGF through VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β signaling pathway. Thus, this work identifies DEP-1 as an important regulator of retinal vascular sprouting. The positive roles of DEP-1 in endothelial cells depend on it ability to bind and activate the kinase Src. In addition to its contribution to angiogenic response, Src is also a well-characterized oncogene notably for its contribution to invasive program of mammary cancer cells. This work illustrates that DEP-1 is preferentially expressed in invasive mammary cancer cells and that it regulates Src activation, pro-invasive signaling pathways and, consenquetly, cell invasiveness in vitro and in vivo. All these activities are dependant on DEP-1 catalytic activity and ability to bind Src. Interestingly, these results correlate with clinical data where moderate expression of DEP-1 is associated with poor pornostic of survival and relapse. Collectively, the results presented here demonstrate, for the first time, the crucial role of DEP-1 in Src activation in endothelial and breast cancer cells, leading to endothelial sprouting, vascular permeability, normal or pathological angiogenesis, and breast cancer invasiveness and metastases formation.

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées. / Introduction : Despite their growth arrest in vivo, corneal endothelial cells (CEC) can be amplified in vitro. Their subsequent transplantation by cell-injection therapy could overcome the tissue scarcity associated with traditional allo-transplantation, which is the only currently available treatment for irreversible corneal endothelial failure. Objective : To evaluate the functionality of a corneal endothelium reconstituted by cell- injection therapy in the feline. Methods: The right eyes of 16 animals underwent surgery. Eight underwent central endothelial scraping and injection with 2x10e5 (n=4) or 1x10e6 (n=4) feline CEC supplemented with Y-27632 and labeled with SP-DiOC18(3). After total scraping, two eyes were injected with 1x10e6 labeled CEC and Y-27632. The central (n=3) or entire (n=3) endothelium was scraped in six controls followed by Y-27632 injection without CEC. Outcomes included clinical performance, anatomical integrity, functional phenotype and SP-DiOC18(3) expression of the new endothelium. Results: Corneas grafted with 2x10e5 CEC and centrally scraped controls performed the best clinically. Entirely scraped controls remained hazy and thick. Histopathology revealed a confluent, functional endothelial monolayer in corneas grafted with 2x10e5 CEC and centrally scraped controls, a non-uniform, non-functional endothelial multilayer in centrally scraped corneas grafted with 1x10e6 CEC, and a non-functional fibrotic endothelium in entirely scraped grafts and controls. SP-DiOC18(3) was scarce in grafts and absent in controls. Conclusion : Cell-injection therapy reconstituted an incompletely functional endothelium, to which injected CEC contributed little. Y-27632 injection without CEC reconstituted the healthiest endothelium. Further studies investigating the therapeutic effect of Y-27632 alone are warranted.

In vitro, la formation de structures de type tubulaire avec des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) a été étudiée en combinant la fonctionnalisation de la chimie des matériaux et le développement de la géométrie tridimensionnelle. Le polycarbonate (PC) a été utilisé comme modèle pour le développement de l'échafaud. Le film de polysaccharide naturel, basé sur un dépôt alternatif couche par couche (LbL) d’acide hyaluronique (HA) et de chitosane (CHI), a d’abord été appliqué sur une surface PC et caractérisé en termes de croissance d’épaisseur microscopie à balayage lascar (CLSM). Cette première fonctionnalisation se traduit par un revêtement complet de la couche PC. Une biofonctionnalisation supplémentaire avec un peptide adhésif (RGD) et deux peptides angiogénétiques (SVV et QK) a été étudiée, immobilisant ces peptides sur le groupe carboxylique de HA précédemment déposé, en utilisant la chimie bien connue du carbodiimide. La version marquée de chaque peptide a été utilisée pour caractériser l’immobilisation et la pénétration des peptides dans les couches de polyélectrolytes, aboutissant à une greffe réussie avec une pénétration complète dans toute l’épaisseur du LbL. Des tests in vitro ont été effectués à l'aide de cellules HUVEC pour évaluer leur efficacité d'adhésion et leur activité métabolique sur la LbL avec et sans immobilisation de peptides, ce qui a permis d'améliorer l'activité préliminaire lorsque des combinaisons de peptides sont utilisées. Enfin, les micro-canaux PC (μCh) ont été développés et caractérisés pour la première fois, et les autres expériences ont été réalisées sur un micromètre de 25 μm de largeur, fonctionnalisé avec une architecture (HA / CHI) 12,5 (PC-LbL) avec des peptides RGD et QK -RGD + QK) ou avec des peptides RGD et SVV (PC-RGD + SVV). Notre première expérience de tubulogénèse a montré de manière surprenante la formation de structures de type tubulaire déjà après 2h d'incubation en utilisant la combinaison double-peptides, mais uniquement avec PC-RGD + QK. Les tubes étaient également présents après 3 et 4 heures de culture. L'expérience de co-culture avec des péricytes humains dérivés du placenta (hPC-PL) montre comment la stabilisation des tubes a été améliorée après 3 et 4 heures également pour l'échantillon de PC-RGD + SVV. Globalement, notre matériel bio-fonctionnel avec les peptides PC-RGD + QK et PC-RGD + SVV permet la formation d'une structure de type tubulaire à la fois dans une expérience de monoculture et de co-culture. / In vitro, tubular-like structures formation with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was investigated by combining material chemistry functionalization and three-dimensional geometry development. Polycarbonate (PC) was used as a template for the development of the scaffold. Natural polysaccharide’s film based on alternate layer-by-layer (LbL) deposition of hyaluronic acid (HA) and chitosan (CHI), was first applied to PC surface and characterized in terms of thickness growth both, in dry conditions using ellipsometry, and confocal lascar scanning microscopy (CLSM). This first functionalization results in a complete coating of the PC layer. Further biofunctionalization with one adhesive peptide (RGD) and two angiogenetic peptides (SVV and QK) was investigated, immobilizing those peptides on the carboxylic group of HA previously deposited, using the well-known carbodiimide chemistry. The labeled version of each peptide was used to characterize the peptides’ immobilization and penetration into the polyelectrolytes layers, resulting in a successful grafting with complete penetration through the entire thickness of the LbL. In vitro tests were performed using HUVECs to assess their adhesion efficiency and their metabolic activity on the LbL with and without peptide immobilization, resulting in a preliminary improved activity when peptide-combinations is used. Finally, PC micro-channels (μCh) were first developed and characterized, and the rest of the experiments were performed on μCh of 25μm width, functionalized with (HA/CHI)12.5 architecture (PC-LbL) with RGD and QK peptides (PC-RGD+QK) or with RGD and SVV peptides (PC-RGD+SVV). Our first tubulogenesis experiment surprisingly showed the formation of tubular-like structures already after 2h of incubation using the double-peptides combination but only using PC-RGD+QK the tubes were present also after 3 and 4 hours of culture. The co-culture experiment with human pericytes derived from placenta (hPC-PL) demonstrates how the stabilization of the tubes was improved after 3 and 4 hours also for the PC-RGD+SVV sample. Globally our bio-functional material with PC-RGD+QK and PC-RGD+SVV peptides allow the formation of tubular-like structure in both mono and co-culture experiment.

Les taux élevés de mortalité et de morbidité associés aux maladies vasculaires en font des pathologies dont les conséquences physiopathologiques, chirurgicales et socio-économiques sont d’une importance majeure pour le système de santé. Malgré leurs avantages, la disponibilité limitée des vaisseaux autologues a conduit au développement de prothèses synthétiques. Cependant, leur surface hautement thrombogène limite leur utilisation dans la substitution des vaisseaux de petit calibre (< 6 mm). De ce fait, à cause de leur obstruction précoce, la reconstitution d’une surface luminale proche de l’endothélium natif est incontournable. Pourtant, les revêtements de surface actuellement disponibles possèdent de médiocres qualités de rétention des néo-endothélium lorsqu’ils sont soumis à des contraintes de cisaillement physiologiques. Dans ce travail, nous proposons un substitut vasculaire de petit calibre endothélialisé réalisé à partir de trois éléments : 1) une matrice préparée à partir d’une artère ombilicale désendothélialisée, 2) un recouvrement de surface innovant constitué du film multicouche de polyélectrolytes (MPE) (PAH-PSS)3-PAH, et 3) un néo-endothélium constitué de cellules endothéliales matures ou progénitrices. Les études in vitro menées sur ces substituts ont montré que la formation, la rétention sous contraintes de cisaillement et la fonctionnalité du néoendothélium élaboré sur la surface luminale étaient améliorées par le film MPE. L’implantation du substitut par pontage termino-latéral sur le lapin a montré que le cahier des charges imputé aux substituts de petit calibre était rempli, principalement en termes de perméabilité et de diamètre, mais aussi de résistance à la suture et aux infections. En conclusion, le film MPE favorise le développement d’un substitut vasculaire de petit diamètre perméable à « long » terme et qui pourrait répondre aux exigences des chirurgiens / Vascular diseases with their high rate of mortality and morbidity belong to the pathologies involving important socio-economic factors for health system. Despite the advantages of autografts, the limited availability of autologous vessels has led to the development of synthetic prostheses. However, their high thrombogenic surface limits their use as small calibre vascular substitutes (< 6 mm). To prevent narrowing of small diameter vascular grafts, the reconstruction of a luminal surface close to the native endothelium is essential. However, the retention of the neo-endothelium subjected to shear stress is poor on the coatings currently available. In this work, we developed a small calibre endothelialized vascular substitute thanks to three elements: 1) a natural matrix prepared from umbilical artery, 2) an innovative coating based on the polyelectrolytes multilayer film (PEM) (PAH-PSS)3-PAH, and 3) used for cell culture of mature or progenitor endothelial cells. In vitro studies have shown that the formation, the retention under shear stress and the endothelial function of the neoendothelium on the luminal surface were improved by PEM film. The anastomosis of this substitute on rabbits has shown that the specifications essential to small calibre vascular grafts were reached, mainly in terms of permeability and diameter but also of resistance to suture and infections. In conclusion, PEM films helped us to develop a small diameter vascular substitute with long term patency

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la deuxième cause de décès par cancer dans les pays développé. Récemment le rôle du microenvironnement a été mis en évidence dans l’oncogenèse et la progression tumorale. Plusieurs études ont montré que le microenvironnement tumoral est un élément dynamique en constant dialogue avec les cellules tumorales. Parmi les éléments du microenvironnement les cellules endothéliales jouent un rôle particulier. Effectivement ces cellules constituent la paroi des vaisseaux et permettent l’acheminement des nutriments et de l’oxygène vers la tumeur. Ainsi ces dernières années des thérapies visant a détruire les vaisseaux sanguins ont vu le jour mais n’ont pas permis d’atteindre les progrès thérapeutiques escomptés. Notre groupe ainsi que d’autres ont mis en évidence des rôles des cellules endothéliales indépendant de la perfusion tumorale. Dans ce travail de thèse nous avons caractérisé l’interaction entre cellules endothéliales et tumorales et mis en évidence le rôle pro-tumoral de la niche vasculaire. Nous avons tout d’abord pu montrer en utilisant une stratégie de souris transgénique où nous annulons l’expression de Jag1 des cellules endothéliales la réduction drastique de l’occurrence des métastases. Nous avons pu montrer que cela n’est pas dépendant de la perfusion tumorale mais dépend de la modification de nombreux gènes pro-métastatiques dont Id1 dans les cellules tumorales par les cellules endothéliales. Parallèlement nous avons montré que le dialogue entre cellules tumorales et endothéliales induit une transition mésenchymateuse des cellules endothéliales avec pour conséquence une augmentation de leur survie ainsi que de leur migration et de leur capacité angiocrine.Ainsi nous avons montré comment le dialogue entre cellules tumorales et endothéliales induit une modification du phénotype tumoral et endothéliale et le rôle de la voie Notch dans ce dialogue. Notre travail suggère la possibilité de moduler l’agressivité tumorale en interrompant le dialogue entre cellules endothéliales et tumorales. / Breast cancer is a heterogeneous disease, which is characterized by distinct morphological features and clinical behaviors and is the most commonly diagnosed cancer among women in the United States and worldwide and the second cause of cancer-related mortality in women. Several years of investigation have demonstrated that tumor initiation, progression and metastasis are closely regulated by the adjacent non-neoplastic tissues that are collectively referred to as tumor microenvironment (stroma). The components of tumor stroma such as mesenchymal stem cells have been shown to enhance cancer stem cell population in breast tumor. Also, the endothelial cells (ECs) conventional role in tumor angiogenesis is crucial in determining the tumor fate as microscopic and asymptomatic versus aggressive. This outstanding characteristic of ECs has set them as promising targets in cancer therapy. However, failure of anti-angiogenic therapies despite vessel disruption suggests the blood flow-independent ability of ECs to facilitate tumor growth. In this study, we show that ECs promoted breast cancer cell self-renewal, stemness, migratory characteristic and lung metastasis through Jagged1/Notch dependent Id1 modulation. ECs with Jag1 knock down (ECsJag1-) failed to sustain breast cancer cell proliferation and stemness in vitro and during xenografted tumor growth. Furthermore, we established a breast tumor mouse model with EC specific Jag1 mutation, by crossing the MMTV-PyMT mice with Cdh5-Cre+/-Jag1loxP/loxP mice. It demonstrated significant decrease in primary tumor growth and dramatic reduction in lung metastasis in Cdh5-Cre+/-Jag1loxP/loxPPyMT+ mice. Transcriptome sequencing analysis of the sorted primary tumor cells identified Notch downstream targets, specifically, Id1, which was reported to be essential for lung metastasis of breast tumors. Additionally, we were interested in determining the mechanisms that derive the activation of ECs toward supporting tumor growth and expansion. Previous studies have shown that ECs show tremendous degree of plasticity when placed under different conditions. Here, we showed that ECs show EndMT phenotypes upon having contact with tumor cells. Interestingly, the EndMT transforms the ECs into activated entities with increased proliferation, migration and angiogenesis properties. Our results demonstrated that the EndMT was reversible and dependent on EC-tumor cell contacts. Moreover, we were able to show that the tumor-induced EndMT in ECs is synergistically regulated by TGFβ and notch signaling pathways. Overall, our findings implicate the significance of endothelial-tumor cells perfusion-independent interaction in cancer progression, stemness, and metastasis. Besides, this study might have determined novel targets in combating cancer in a more effective way.

L’exposition humaine aux particules atmosphérique (PM) est une préoccupation majeure de santé publique. La pollution particulaire est constituée de particules grossières (PM10 diamètre < 10 μm), de particules fines (PM2.5 diamètre < 2.5 μm) et de particules ultrafines (PUF ou PM0.1 diamètre < 100 nm). L’excès de mortalité constaté par les études épidémiologiques est principalement associé aux pathologies respiratoires et cardiovasculaires. Après inhalation, les particules les plus fines (PM2.5 et PUF) pénètrent profondément dans les voies respiratoires jusqu’aux alvéoles pulmonaires. Des études ont montré qu’elles peuvent franchir la barrière alvéolo-capillaire pour se retrouver dans la circulation systémique et y exercer leurs effets délétères sur les organes cibles tel que le système cardiovasculaire. La circulation pulmonaire constitue donc une cible privilégiée des particules inhalées, particulièrement les cellules endothéliales qui tapissent la lumière des vaisseaux. L’hypertension pulmonaire (HTP) est une pathologie de la circulation pulmonaire caractérisée par un remodelage des vaisseaux pulmonaires, une hyperréactivité et une inflammation. Des études récentes ont montré le rôle prépondérant du calcium et du stress oxydant dans la physiopathologie de cette maladie. Cependant, peu d’études mécanistiques visent à expliquer les effets des PM sur les cellules cibles vasculaires pulmonaires. Dans ce contexte, ce travail vise à mieux caractériser les effets cellulaires et moléculaires des particules sur les cellules endothéliales d’artères pulmonaires humaines (HPAEC). L’impact des PM2.5 et des nanoparticules (NPs) noires de carbone (FW2) sur les cellules endothéliales d’artères pulmonaires humaines entraine des dérégulations de l’homéostasie cellulaire. En effet, nos résultats montrent une augmentation significative du stress oxydant et, notamment, de la production d’anion superoxyde cytoplasmique et mitochondrial, des perturbations de la signalisation calcique, des dommages mitochondriaux, ainsi qu’un déséquilibre de la sécrétion de facteurs vasoactifs tels que le monoxyde d’azote (NO). Nous avons, également, étudié sur ces cellules cibles vasculaires pulmonaires humaines, dans des conditions physiologique et pathologique mimant l’HTP, les effets des particules sur la signalisation calcique ainsi que le rôle du stress oxydant dans les effets observés. Nous avons, dans un premier temps, développé et validé un modèle in vitro qui mime la dynamique vasculaire observée dans l’HTP. Dans une deuxième étape, nous avons observé les effets des NPs FW2, dans les deux conditions expérimentales. Nos résultats montrent, dans les cellules placées en conditions pathologiques, une augmentation significative de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) ainsi qu’une augmentation significative de la réponse pro-inflammatoire caractérisée par la sécrétion d’interleukines telles que l’IL-6 par rapport aux cellules placées en condition physiologique. De plus, la signalisation calcique semble également altérée dans les conditions pathologiques. / Human exposure to airborne particulate matter (PM) is a health risk concern. Particulate air pollution is composed of different PM: coarse particles (PM10 diameter < 10 μm), fine particles (PM2.5 diameter < 2.5 μm) and ultrafine particles (UFP) (PM0.1 diameter < 100 nm). The excess of mortality observed in several epidemiological studies is mainly associated with respiratory and cardiovascular diseases. After inhalation, the finest particles (PM2.5 and UFP) penetrate deeply into the airways, accumulate in pulmonary alveoli, cross the epithelial barrier to reach the pulmonary circulation and exert deleterious effects on the cardiovascular system. Inhaled particles are therefore observed in the pulmonary circulation, in direct contact with endothelial cells lining the inner surface of blood artery. Pulmonary Hypertension (PH) is the main disease of the pulmonary circulation characterized by remodeling of the pulmonary wall, changes in pulmonary vascular hyperactivity and inflammation. Oxidative stress and alteration in calcium signaling are also critical events involved in the physiopathology of PH. However, the effect of PM on these pulmonary vascular cellular targets is poorly described. In this context, the objectives of the present study are to assess the cellular and molecular effects of particle exposures in human pulmonary artery endothelial cells (HPAEC). Our results highlighted various cellular homeostasis alterations of HPAEC in response to PM2.5 and black carbon nanoparticles (FW2 NPs). We observed a significant increase of oxidative stress including cytoplasmic and mitochondrial superoxide anion production in concentration dependent-manner. Moreover, we observed calcium signaling alterations, mitochondrial damages, as well as a deregulation of vasoactive factors secretion such as nitric oxide (NO). Finally, we studied these cellular targets under physiological and pathological conditions mimicking PH. We have first developed a new in vitro model that mimics the vascular dynamics observed in the PH. Then, we investigated the effects of FW2 NPs in both experimental conditions. Our results showed, in pathological conditions, a significant increase in reactive oxygen species (ROS) production and a significant increase in the pro-inflammatory response characterized by interleukin secretion such as IL-6 as compared to cells in physiological condition. In addition, the calcium signaling seemed also be impaired in pathological conditions.

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau / Multiple Sclerosis is an inflammatory demyelinating disease in which immune cells from the peripheral blood infiltrate the central nervous system (CNS) to cause a pathologic neuroinflammatory reaction. Blood borne leucocytes cross the restrictive cerebral endothelium, the blood brain barrier (BBB), to gain access to the CNS parenchyma and cause cellular damage leading to the characteristic demyelinating lesions. The BBB is the interface between the blood and the CNS and as such is a critical mediator of neuro-immune reactions and an important therapeutic target to modulate neuroinflammation. It is essential to have a better understanding of the molecular mechanisms that regulate the BBB properties to elaborate new therapeutic strategies to modulate the BBB and thus the local neuroinflammation reaction. This Ph.D. thesis describes three distinct molecular mechanisms which regulate key BBB properties. The first section describes a novel role for the renin-angiotensin system (RAS) in the neuro-vascular unit (NVU) as a regulator of paracellular permeability. The second part of this thesis characterises the role of a novel adhesion molecule of the BBB, ALCAM. The third part of this work studies the interactions between neural stem cells (NSC) and the BBB and identifies MCP-1 as a critical factor involved in NSC recruitment to the CNS. In the first experimental section we provide evidence that angiotensinogen (AGT) produced and secreted by astrocytes, is cleaved into angiotensin II (AngII) and acts on type 1 angiotensin receptors (AT1) expressed by BBB endothelial cells (ECs). Activation of AT1 restricts the passage of molecular tracers across human BBB-derived ECs through threonine-phosphorylation of the tight junction protein occludin and its mobilization to lipid raft membrane microdomains. We also show that AGT knockout animals have disorganized occludin strands at the level of the BBB and a diffuse accumulation of the endogenous serum protein plasminogen in the CNS, as compared to wild type animals. Finally, we demonstrate a reduction in the number of AGT-immunopositive perivascular astrocytes in multiple sclerosis (MS) lesions, which correlates with a reduced expression of occludin similarly seen in the CNS of AGT knockout animals. Such a reduction in astrocyte-expressed AGT and AngII is dependent, in vitro, on the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ. Our study defines a novel physiological role for AngII in the CNS and suggests that inflammation-induced downregulation of AngII production by astrocytes is involved in BBB dysfunction in MS lesions. In the second experimental part we focus on adhesion molecules of the BBB. Using a lipid raft-based proteomic approach, we identified ALCAM (Activated leukocyte cell adhesion molecule) as an adhesion molecule involved in leukocyte migration across the BBB. ALCAM expressed on BBB endothelium co-localized with CD6 expressed on leukocytes and with BBB endothelium transmigratory cups. ALCAM expression on BBB cells was up-regulated in active multiple sclerosis and experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE) lesions. Moreover, ALCAM blockade restricted transmigration of CD4+ lymphocytes and monocytes across BBB endothelium in vitro and in vivo, and reduced the severity and time of onset of EAE. Our findings point to an important role for ALCAM in leukocyte recruitment into the brain and identify ALCAM as a potential therapeutic target to dampen neuroinflammation. The third experimental part of this thesis studies the interactions between NCS and BBB. NCS represent an attractive source for cell transplantation and neural tissue repair. After systemic injection, NCS are confronted with the specialized BBB endothelial cells before they can enter the brain parenchyma. We investigated the interactions of human fetal neural precursor cells with human brain endothelial cells in an in vitro model using primary cultures. We demonstrated that human fetal neural precursor cells efficiently and specifically migrate to sub-endothelial space of human BBB-endothelium, but not pulmonary artery endothelial cells. When migrated across BBB-endothelial cells, fetal neural precursor cells spontaneously differentiate to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Effective migration and subsequent differentiation was found to be dependant on the chemokine CCL2/MCP-1, but not CXCL8/IL-8. Our findings suggest that an intact blood-brain barrier is not an intrinsic obstacle to neural stem cell migration into the brain and that differentiation of neural precursor cells occur in a sub-endothelial niche, under the influence of the chemokine CCL2/MCP-1. These three experimental sections demonstrate the crucial roles that the BBB plays in regulating the CNS homeostasis. Under pathological conditions, such as during neuro-immune reactions, the BBB is altered and becomes an important local player. The three different molecular mechanisms described in this thesis, contribute to our understanding of the BBB and may allow for the development of novel therapeutic strategies to limit neuroinflammation.

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer. / The implication of protein tyrosine phosphatases (PTPs) in the regulation of cell signalling events and the mediation of cellular functions in response to growth factors such as VEGF has been well-established in the last years. Nonetheless, molecular mechanisms by which PTPs regulate fundamental processes such as angiogenesis are not well-characterized. Expression of the PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) was reported to increase with cell density and was associated with VEGFR2 dephosphorylation contributing to cell contact inhibition in confluent endothelial cells. We previously demonstrated that DEP-1 attenuates VEGFR2 activity by dephosphorylation of its Y1054/1059 leading to decreased activation of major signalling pathways downstream of VEGFR2 with exception of the Src-Gab1-AKT pathway. Increasing Src activity due to DEP-1-mediated dephosphorylation of its Y529 promotes endothelial cell survival. The objective of this thesis was to gain a better understanding of the role of DEP-1 in the regulation of the Src activity and of biological responses in endothelial cells. We identified tyrosine Y1311 and Y1320 in the C-terminal tail of DEP-1 as major phosphorylation sites in response to VEGF. These residues are required for Src activation and mediate the Src-dependent remodelling of endothelial cell junctions inducing permeability, invasion and capillary formation upon VEGF stimulation. We showed that VEGF-induced DEP-1 tyrosine phosphorylation directs DEP-1 specificity towards its substrate Src. Our results thus highlighted for the first time the promoting role of DEP-1 on the angiogenic program in endothelial cells. In addition to tyrosine phosphorylation, DEP-1 is constitutively phosphorylated on a threonine residue (T1318) proximal to Y1320 in its C-terminal tail suggesting it might be involved in the regulation of Y1320. Indeed, we found that DEP-1 T1318 is phosphorylated, potentially by CK2, and regulates the tyrosine phosphorylation of DEP-1 and its ability to bind to and activate Src. Consistent with this, remodelling of endothelial cell junctions and permeability are impaired in endothelial cells expressing the DEP-1 T1318 mutant. Thus, DEP-1 phosphorylation on T1318 displays a regulatory control over DEP-1 tyrosine phosphorylation and subsequently Src activation and endothelial cell functions in response to VEGF. Our results demonstrating that DEP-1 promotes angiogenic cell responses in endothelial cells, prompted us to consider a possible involvement of DEP-1 in cancer cells, where Src activation has been linked to cancer progression. Thus, although, DEP-1 is believed to act as a tumour suppressor in different cancer types, we hypothesized that it might also promote Src-dependent functions such as migration and invasion in cancer cells. Interestingly, we found that DEP-1 is higher expressed in more invasive basal-like breast cancer cells than in luminal-like cell lines. Moreover, DEP-1 is implicated in the regulation of Src activity, Src-mediated cell motility and appropriate localization of proteins mediating cytoskeletal organization in basal-like breast cancer cell lines. To further support these results, analysis of a breast cancer tissue microarray revealed that DEP-1 expression is associated with a tendency towards reduced overall survival. Thus, our results provide first evidence for a tumour-promoting role of DEP-1 in breast cancer. Altogether, the work performed in the context of this thesis revealed that DEP-1 can similarly behave as a promoter of the angiogenic response and of the pro-invasive phenotype in basal-like breast cancer cell lines, most likely due to its ability to activate Src. This suggests for the first time that DEP-1 expression could contribute to tumour progression and the formation of metastases, and as such, represent a potential new target for anti-angiogenic and anti-cancer therapy.