Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La migration des cellules endothéliales est une étape nécessaire à l'angiogenèse. Le facteur pro-angiogénique VEGF {vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à identifier puis à caractériser les fonctions des cibles de p38 dans les cellules endothéliales activées par le VEGF. Suite à une électrophorèse bi-dimensionnelle et à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons isolé l'annexine 1 (ANXA1) comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et est diminuée en inhibant p38. L'ANXAl a d'abord été caractérisée comme une protéine qui module l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes en inhibant la phospholipase A2. En outre, plusieurs études indiquent que l'ANXAl joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaires et qu'elle interagit avec des protéines du cytosquelette comme la tubuline et l'actine. Après avoir identifié l'ANXAl en aval de p38 nous avons caractérisé ses fonctions ainsi que la kinase responsable de sa phosphorylation. En utilisant des essais de phosphorylation in vitro et in vivo, nous avons montré que la MAPKAP kinase-2 activée par le VEGF régule la phosphorylation de l'ANXAl en aval de p38. Dans les cellules non stimulées, l'annexine 1 est prédominante dans le noyau, tandis que lorsque les cellules endothéliales sont stimulées au VEGF, elle se déplace du noyau vers le cytoplasme où elle co-localise avec l'actine F dans les lamellipodes. L'inhibition de la translocation par le SB203580 et la leptomycine B suggère qu'elle nécessite une phosphorylation et le système cargo CRM1. De plus, la migration cellulaire est inhibée à la suite du knockdown de l'ANXAl par l'utilisation d'un ARNi ciblant l'ARNm de la protéine. En outre, la migration cellulaire et la tubulogenèse initiées par le VEGF sont inhibées à la suite du knockdown de l'ANXAl. En conclusion, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de l'ANXAl régule l'effet angiogénique associé à l'activation de la voie de signalisation p38/MAPKAP kinase-2 par le VEGF.

L'angiogénèse est un processus physiologique soutenu par la migration des cellules endothéliales. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à caractériser les mécanismes moléculaires, en aval de p38, impliqués dans la phosphorylation de l'annexine Al (ANXA1) chez les cellules endothéliales activées par le VEGF et de démontrer leur rôle dans la migration cellulaire. Les résultats suggèrent que l'ANXAl est une nouvelle cible du sentier p38/MAPKAP K2 (mitogen-activated protein kinase activated-protein kinase 2) et qu'elle régule la migration des cellules endothéliales stimulées par le VEGF. Premièrement, à l'aide d'une électrophorèse en 2D et d'une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié l'ANXAl comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et diminuée suite à une inhibition de l'activité de p38. Deuxièmement, en utilisant des essais kinases in vitro et des essais de phosphorylation in vivo, nous avons découvert que l'activation de la LIMK1 (lin-ll/Isl-l/Mec-3 domain-containing protein kinase) par le VEGF en aval de p38 entraîne la phosphorylation de l'ANXAl. Troisièmement, nous avons démontré que l'ANXAl joue un rôle dans la migration des cellules endothéliales et dans la tubulogénèse, du fait que ces processus initiés par le VEGF sont inhibés à la suite de l'invalidation de l'ANXAl par un ARNi (ARN interférant). Toutefois, cette inhibition est renversée en ajoutant un plasmide contenant de l'ADN de l'ANXAl insensible au ARNi. En conclusion, nos résultats suggèrent que la LIMK1 activée par le sentier p38 phosphoryle l'ANXAl, une protéine indispensable à la migration des cellules endothéliales et à la formation de tubules induites par le VEGF.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 janvier 2024) / La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une pathologie qui touche la couche postérieure de la cornée, l'endothélium cornéen. Ce dernier fait office de barrière physique entre l'humeur aqueuse et le reste de la cornée. De ce fait, lorsqu'il est défectueux, une accumulation de l'humeur aqueuse dans le stroma entraîne l'apparition d'un œdème stromal et de bulles épithéliales. Il s'en suit une opacification cornéenne menant à une perte de vision irréversible. Cliniquement, la pathologie est associée à l'épaississement de la membrane de Descemet (DM) dû à un dépôt accru de matrice extracellulaire (MEC), entraînant la formation d'excroissances, appelées guttae. Puis, une perte de densité des cellules endothéliales cornéennes (CECs) se produit contribuant aux difficultés de maintenir la déturgescence du stroma. En Amérique du Nord, la FECD est la principale cause de transplantation de cornées qui représente son seul traitement. De nouveaux traitements sont à l'étude mais nécessitent une bonne compréhension de la maladie et des dérégulations de l'endothélium cornéen. La FECD étant une pathologie multifactorielle, son étiologie reste difficile à déterminer. La recherche a mené à la proposition de différentes hypothèses d'explications au développement de la maladie. Parmi elles, la transition endothélio-mésenchymateuse ou épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ce processus cellulaire consiste au passage d'un phénotype endothélial ou épithélial vers un phénotype mésenchymateux. Malgré quelques mises en évidence de la TEM dans la FECD, des signes clés de cette transition manquent dans la maladie, tels que le passage à une morphologie fibroblastique et un changement de cadhérines. C'est pourquoi notre laboratoire a décidé de clarifier la présence de la TEM dans la FECD. L'objectif de ce projet est de comprendre comment la TEM est activée dans la FECD et son impact sur les CECs. De ce fait, notre laboratoire a étudié la TEM à un niveau intracellulaire et extracellulaire en utilisant aussi bien des CECs primaires que des modèles tissulaires. Notre attention s'est d'abord portée sur l'étude des protéines impliquées dans les voies TGF-β/Smad et Wnt/β-caténine (connues pour activer la TEM) dans les CECs *ex vivo* et *in vitro*. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressées au dépôt anormal de MEC, un des signes d'une TEM. En effet, nous avons proposé que les protéines matricielles anormalement déposées seraient impliquées dans la perte cellulaire endothéliale dans la FECD. Nous avons donc étudié l'expression de protéines matricielles dans les stades précoces et avancés de la FECD et leur influence sur l'adhésion et la migration des CECs en culture. Pour répondre au premier objectif, des données transcriptomiques et l'expression des protéines liées à la TEM ont été étudiées *ex vivo*. Les protéines d'intérêt ont également été étudiées *in vitro* avec ou sans irradiation chronique d'UVA. Nos travaux en *ex vivo* FECD ont révélé l'absence de l'activité des voies Wnt/β-caténine et TGF-β/Smad. *In vitro*, ces deux voies de signalisations étaient actives et une augmentation de TGF-β2 a également été observée. Néanmoins, l'exposition aux UVA n'a pas modifié le profil d'expression des protéines. Pour le deuxième objectif, les données transcriptomiques du matrisome de CECs *ex vivo* et *in vitro* ont été analysées. Nous avons ensuite étudié la morphométrie des guttae en *ex vivo* et l'expression de nos protéines d'intérêt en *ex vivo* et sur les endothélia cornéens reconstruits sains et pathologiques. Des tests d'adhésion et de migration ont ensuite été réalisés. Les gènes *SPP1* (Ostéopontine), *FN1* (Fibronectine) et *TNC* (Ténascine-C) étaient régulés à la hausse en *ex vivo* et SPP1 était régulé à la hausse aussi bien *ex vivo* qu'*in vitro*. La fibronectine (FN), ténascine-C (TN-C), ostéopontine (OPN) et le collagène de type XIV (COL XIV) étaient exprimés dans les DM FECD mais seules la TN-C et la FN se retrouvaient dans les endothélia reconstruits FECD. La FN et la TN-C n'ont pas modifié l'adhésion des CECs mais l'OPN l'a diminuée. La FN et la combinaison de FN et TN-C ont augmenté significativement la migration des CECs. Les travaux de cette thèse permettent d'apporter plus de connaissances sur l'activation de la TEM dans la FECD et mettent en évidence une chronologie du dépôt de MEC anormale dans la pathologie ainsi que la façon dont les CECs y réagissent. Une meilleure compréhension du développement de la FECD pourrait apporter des clés pour la conception de nouveaux traitements. / Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a pathology that affects the posterior layer of the cornea, the corneal endothelium. The endothelium acts as a physical barrier between the aqueous humor and the rest of the cornea, so when it is defective, an accumulation of aqueous humor in the stroma leads to stromal edema and epithelial bullae. This leads to corneal opacification and irreversible vision loss. Clinically, the pathology is associated with thickening of Descemet's membrane (DM) due to an increase of extracellular matrix (ECM), leading to the formation of outgrowths known as guttae. This is followed by a loss of corneal endothelial cell (CEC) density, making it difficult to maintain stromal deturgescence. In North America, FECD is the leading cause of corneal transplantation, which is its only treatment. New treatments are under study but require a good understanding of the disease and corneal endothelium dysregulation. As FECD is a multifactorial pathology, its etiology remains difficult to determine. Research has led to the proposal of various hypothesis to explain the development of the disease. One of these is endothelial to mesenchymal or epithelial to mesenchymal transition (EMT). This cellular process is characterized by the transition from an endothelial or epithelial phenotype to a mesenchymal one. Despite some evidence of EMT in FECD, key signs of this transition are missing in the disease, such as the transition to a fibroblastic morphology or the cadherins switch. Therefore, our laboratory decided to clarify the presence of EMT in FECD. The aim of this project is to understand how EMT is activated in FECD and its impact on CECs. Accordingly, our laboratory has studied EMT at both intracellular and extracellular levels, using both primary CECs and tissue models. Our first focus was on the study of proteins involved in the TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin pathways (known to activate EMT) in *ex vivo* and *in vitro* CECs. In a second step, we focused on abnormal ECM deposition, one of the key signs of EMT. Indeed, we proposed that abnormally deposited matrix proteins would be involved in endothelial cell loss in FECD. We therefore studied the expression of matrix proteins in the early and late stages of FECD and their influence on the adhesion and migration of cultured CECs. To address the first objective, transcriptomic data and the expression of EMT-related proteins were studied *ex vivo*. Proteins of interest were also studied *in vitro* with or without chronic UVA irradiation. Our *ex vivo* FECD work revealed the absence of Wnt/β-catenin and TGF-β/Smad pathway activity. *In vitro*, both signaling pathways were active, and an increase in TGF-β2 was also observed. Nevertheless, UVA exposure did not alter the protein expression profile. For the second objective, transcriptomic data from the *ex vivo* and *in vitro* matrisome were analyzed. We then studied guttae morphometry in *ex vivo* specimens and the expression of our proteins of interest in *ex vivo* specimens and on healthy and pathological tissue engineered corneal endothelia. Adhesion and migration assays were then performed. *SPP1* (Osteopontin), *FN1* (Fibronectin) and *TNC* (Tenascin-C) genes were up-regulated *ex vivo*, and *SPP1* was up-regulated both *ex vivo* and *in vitro*. Fibronectin (FN), tenascin-C (TN-C), osteopontin (OPN) and collagen type XIV (COL XIV) were expressed in FECD DMs, but only TN-C and FN were found in reconstructed FECD endothelia. FN and TN-C had no impact on CEC adhesion, but OPN did. FN and the combination of FN and TN-C significantly increased CEC migration. The studies of this thesis provide further insight into the activation of EMT in FECD, highlight the chronological abnormal ECM deposition in the pathology and how CECs respond to it. A better understanding of the FECD development could bring keys to design new treatments.

L'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA) et le récepteur B₁. (RBO des kinines jouent des rôles essentiels dans la régulation de la pression artérielle et l'inflammation. Bien que les mécanismes par lesquels ils exercent leurs effets soient bien connus, leurs modes de régulation et d'expression au niveau cellulaire restent encore mal compris. La première partie de notre étude visait particulièrement à élucider l'ensemble des voies de signalisation responsables de la modulation de l'ECA. Dans la seconde partie, nous avons tenté de caractériser le RB₁ en identifiant les facteurs et les mécanismes intracellulaires essentiels à son expression. Les cellules vasculaires endothéliales et musculaires lisses, ainsi que des essais de contractilité d'aortes de lapin isolées étaient exploités pour répondre à nos objectifs. Les cytokines pro-inflammatoires régulent négativement l'expression de l'ECA tandis que le PMA augmente plutôt sa densité membranaire. L'effet des cytokines semble tributaire de l'activation du facteur de transcription NF-KB ainsi que de la MAP kinase p38. Le PMA, en activant les protéines kinase C (PKC), conduit à la mobilisation des voies de signalisation impliquant MEK1, ERK 1/2 et accessoirement, l'activation de la protéine c-Fos. Les PKC classiques, à l'exclusion de l'isoforme β joueraient un rôle essentiel dans cette expression. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons montré que l'isolation de l'aorte de lapin activait la signalisation du récepteur EGF (R-EGF) et que cette signalisation serait responsable de la sensibilisation spontanée de cet organe en réponse aux agonistes du RBi, . L'EGF induirait la sécrétion de l'interleukine 1 qui, de façon autocrine, augmenterait le RBi. Au niveau des cellules vasculaires humaines, l'interféron-γ potentialise l'effet d'autres cytokines telles que le TNF-α et cause une augmentation considérable de l'expression membranaire du RB₁. L'interféron-y semble agir au niveau transcriptionnel en augmentant l'ARN messager codant pour ce récepteur. Cet effet serait la conséquence de la mobilisation, par cette cytokine, d'une voie de signalisation atypique impliquant l'interaction de Tyk2 et STAT1 dans les cellules vasculaires. Ainsi, notre étude nous à permis de mieux comprendre les mécanismes responsables de la modulation de l'ECA et du RB₁ au niveau vasculaire. Nous espérons que ces résultats permettront de mieux comprendre leur régulation en physiopathologie cardiovasculaire et inflammatoire.

En France, les dysfonctions endothéliales représentent environ la moitié des indications de greffes de cornée réalisées chaque année. Cependant, les problématiques liées à la pénurie de greffon, aux difficultés des techniques chirurgicales de greffes endothéliales ainsi qu’aux risques d’échec ou de rejet de greffe poussent les chercheurs à développer de nouvelles thérapies moins invasives et plus efficaces. La thérapie cellulaire cornéenne endothéliale est une des voies de recherche actuellement explorées dont le but est de s’affranchir des aléas de la greffe de cornée. La cornée humaine est un tissu idéal pour la thérapie cellulaire. Grâce à ses caractéristiques d’organe à la fois avasculaire et immunitairement privilégié, les cellules transplantées sont ainsi bien mieux tolérées par rapport aux autres tissus et organes vascularisés. Les avancées dans le domaine des cellules souches, de l'ingénierie, particulièrement avec l’arrivée des greffes de cellules souches épithéliales pour le traitement des pathologies sévères de la surface oculaire, ont suscité un intérêt massif afin d’adapter ces techniques aux cellules endothéliales / In France, around half of all corneal keratoplasties are performed to treat corneal endothelial dysfunction each year. However, the use of endothelial keratoplasty is limited by the technical difficulty of the procedure, a shortage of available grafts, and the potential for graft failure or rejection. These limitations are driving researchers to develop new, less invasive, and more effective therapies. Corneal endothelial cell therapy is being explored as a potential therapeutic measure, to avoid the uncertainty associated with grafting. The human cornea is an ideal tissue for cell therapy as owing to its avascular characteristics, transplanted cells are better tolerated compared with other vascularized tissues and organs. Advances in the field of stem-cell engineering, particularly the development of corneal epithelial stem cell therapy for the treatment of severe diseases of the ocular surface, have aroused a massive interest in adapting cell-therapy techniques to corneal endothelial cells

Toward the objective to create or to replace impaired tissues, it is essential to establish a culture process allowing tissue growth in vitro . The Petri dish culture or the traditional 2D culture has only a limited potential, mainly caused by a poor oxygen mass transfer to feed larger tissue constructs. In this project, an autonomous and complete bioprocess has been built to fullfill these needs. The developed reactor is versatile because many cell culture chamber designs can be connected to it. Two proportional-integral algorithms (PI) can control the dissolved oxygen concentration and the pH. The pressure, the temperature and mass flow rate are recorded in real time. An actuator allows mimicking the cardiac output flow. In this mémoire , it will be demonstrated how the reactor has been optimized to reduce the risk of bioburden. Also, the procedures to develop the control tools of the PI algorithm will be detailed. To characterize the reactor, a RTD study will be presented. To characterize the cell culture chamber, a permeability analysis using fluorescent microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) will be exposed. Finally, two cell culture chamber designs to orient microvessel formation have been tested and these results will be presented.

La neuroradiologie Interventionnelle est devenue une spécialité médicale à part entière en évolution permanente avec l'amélioration des technologies radiologiques et endovasculaires. Néanmoins, de trop nombreuses complications liées à la technique elle-même sont encore rapportées. Basés sur notre expérience clinico-radiologique, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux complications thromboemboliques grâce à de nouvelles technologies biologiques permettant d'envisager une analyse des lésions vasculaires à l'échelle cellulaire (Cellsearch®). Ainsi au cours de différents examens diagnostiques et thérapeutiques nous avons analysé les taux artériels et veineux de cellules endothéliales circulantes à différents temps de la procédure. Nous avons démontré l'agression du matériel endovasculaire sur les parois artérielles induisant un relargage immédiat de CECs unitaires et en amas de taille variable, parfois géants (300 µm). Les amas présentant une taille supérieure aux diamètres des microcapillaires ne peuvent pas migrer dans le compartiment veineux et sont donc potentiellement à l'origine d'une occlusion artérielle très distale responsable de lésions microischémiques qualifiées de silencieuses car asymptomatique dans l'ensemble des cas observés. Les lésions pariétales artérielles induites sont ensuite probablement réparées par un mécanisme dynamique mettant en jeu une augmentation lente et progressive des CEPs jusqu'à l'obtention d'une réparation de l'endothélium. Au delà des facteurs mécaniques endovasculaires, l'analyse cellulaire de cette cinétique destruction-régénération des parois artérielles pourrait s'avérer intéressante dans l'évaluation de l'endothélialisation des endoprothèses intracrâniennes. / Permanents Improvements in radiological and endovascular devices made the Interventional Neuroradiology considered as a complete medical specialty. However, too many procedural complications due to the devices remain observed in all reported series. On the basis of our clinical center experience we decided to analyze thromboembolic complications by using new biological tests allowing to the detection of circulating endothelial cells. During cerebral diagnostic or therapeutic angiography, arterial and venous CECs rates were analyzed before, during, and after endovascular procedures. Thus, we demonstrated the potential arterial wall injury following catheterization that induced unit and cluster of CECs, some of them were giants (300 µm). Clusters presenting with a size up than those described from microcapillary lumen cannot go through venous compartment, and potentially block into a distal artery inducing microischemic stroke (silent embolism) as observed in this work. In addition, the induced arterial wall injury is probably regenerated by a dynamic mechanism involving a delayed increase of CEPs rates, until the new endothelialization. Over endovascular mechanism factor analysis, the CECs-CEPs investigations could be an interesting strategy in the monitoring of intracranial endoprothesis endothelialization.

Dans le glioblastome (GBM), la radiothérapie est un outil thérapeutique essentiel. Néanmoins, la récidive post-irradiation est quasiment inévitable, en raison de l’émergence d'une sous-population de cellules cancéreuses particulièrement radiorésistantes présentant une meilleure capacité proliférative, invasive et pro-angiogénique. Notre étude in vitro a cherché à déterminer comment les cellules cancéreuses survivantes à l’irradiation pouvaient affecter la fonction des cellules tumorales voisines et les cellules endothéliales non irradiées, en focalisant notre attention sur l’échange des signaux intercellulaires, à savoir, les facteurs solubles et les microvésicules tumorales (TMVs). La radiothérapie induit principalement un ralentissement de la prolifération des cellules de glioblastome (T98G et U87) et une mort cellulaire retardée (clonogénique) de 50-60%, sans engendrer d’apoptose. Grâce au suivi de la croissance cellulaire à long terme (via le système xCELLigence) et un test de blessure, nous avons confirmé que les cellules de glioblastome survivantes après irradiation libèrent des signaux qui peuvent modifier les fonctions de cellules endothéliales HUVEC et de cellules tumorales non-irradiées. Outre la sécrétion de certains facteurs solubles connus (VEGF, uPA), nous avons pu objectiver, en utilisant la microscopie électronique à balayage, le Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), la libération de microvésicules tumorales (TMVs), dont la taille était globalement inférieure à 500 nm. Par NTA et cytométrie en flux, nous avons montré que cette libération de TMVs (exosome + "shedding vesicles"), peut être significativement stimulée par l’irradiation dans les 2 lignées, de façon temps-dépendant. D’après nos analyses protéomiques, les facteurs solubles tels que le VEGF ou l’IL-8, connus pour être des facteurs pro-angiogéniques, contribueraient plutôt à favoriser la survie, voire la prolifération, des cellules HUVEC, tandis que les TMVs libérées après irradiation, ont significativement modifié la capacité de migration des HUVEC et des cellules tumorales non-irradiées. Les propriétés pro-migratoires des TMVs pourraient en ce sens, contribuer aux processus de récidive dans les glioblastomes après irradiation / Radiation therapy is a major therapeutic tool for glioblastoma (GBM). However, the post-radiation recurrence is almost inevitable, due to the emergence of a subpopulation of radioresistant cancer cells with greater proliferative, invasive, and proangiogenic capacities. The objective of this study was to investigate in vitro how irradiated cancer cells affect the function of untreated neighboring tumor cells and endothelial cells, focusing on signals exchange initiated by irradiation, such as soluble factors and tumor microvesicles (TMVs). Radiotherapy has slowed down the proliferation of GBM cells (T98G, U87) and induced mitotic death of 50-60%, without significant apoptosis. Through long-term monitoring of cell growth (xCELLigence) and wound-healing assay, we have confirmed that surviving GBM cells after irradiation release signals that can change the functions of endothelial cells HUVEC and non-irradiated tumor cells. In addition to the secretion of known soluble factors (VEGF, uPA), we were able to show using scanning electron microscopy and the Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), the release of tumor microvesicles (TMVS), whose size was generally less than 500 nm. By NTA and flow cytometry, we have shown that the release of TMVs (exosome + "shedding vesicles") can be significantly stimulated by irradiation in two lines, in a time-dependent manner. According to the proteomics analysis, soluble factors such as VEGF or IL-8, well known as pro-angiogenic factors, rather contribute to promote the survival or proliferation of HUVEC, while the released TMVs after irradiation, significantly altered the migration abilities of non-irradiated HUVEC and tumor cells. The pro-migratory properties of TMVs could thus contribute to glioblastoma recurrence after irradiation

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoiétique (CSH) caractérisées par une prolifération accrue de cellules sanguines. Une mutation activatrice de la protéine JAK2 (JAK2V617F) a été identifiée chez plus de 50% des patients. La survenue de thromboses au niveau artériel et veineux constitue une des principales complications au cours de ces maladies. Au cours d’un premier axe de travail, nous avons souhaité étudier les conséquences sur la physiopathologie de la thrombose de la présence de la mutation JAK2V617F dans les cellules endothéliales (CE). Utilisant deux approches complémentaires, in vitro avec l’utilisation de cellules endothéliales veineuses, et in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin permettant la présence de la mutation JAK2V617F dans le compartiment endothélial, nous avons démontré que la présence de CE JAKV617F favorisait la survenue de thrombose. Cette augmentation de la survenue de thrombose était médiée par une augmentation de l’adhésion des leucocytes au niveau des CE JAK2V617F, secondaire à une augmentation d’expression de P-Sélectine à leur surface. Ce travail a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de la physiopathologie de la thrombose au cours des NMP JAK2V617F. Au cours d’un second axe de travail, nous avons étudié les polynucléaires neutrophiles (PNN) et le phénomène de NETose (formation de neutrophil extracellular traps ou NET) au cours des NMP. Nous avons démontré que la formation de NET était augmentée dans une cohorte de patients avec NMP, tout comme des marqueurs indirects de NETose (ADN plasmatique, MPO-ADN plasmatique). Nous avons mis en évidence que les taux de MPO-ADN plasmatique étaient plus élevés chez les patients avec antécédents de thrombose par rapport aux patients sans. Nous avons confirmé ces résultats à l’aide de deux modèles murins différents dans lesquels nous avons également retrouvé une formation de NET augmentée. Nous avons mis en évidence que cette formation de NET participait à la physiopathologie de la thrombose, l’administration de DNAse entraînant une réduction de la survenue de thrombose. Enfin, nous avons démontré que les plaquettes JAK2V617F stimulaient la production de NET par les PNN JAK2V617F, suggérant une collaboration de ces deux types cellulaires au cours de la physiopathologie de la thrombose des NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are acquired hematologic diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by blood cell proliferation. An activating mutation of the protein JAK2 (JAK2V617F) has been identified in more than 50% of patients. The occurrence of arterial and venous thrombosis is one of the main complications during these diseases. We first studied the consequences of the presence of the JAK2V617F mutation in endothelial cells (EC) on the physiopathology of thrombosis. We used two complementary approaches, in vitro with the use of human venous endothelial cells, and in vivo with the use of a mouse model allowing the presence of the JAK2V617F mutation only in the endothelial compartment: the PDGFb-iCreERT2;JAK2V617F/WT model. We first observed that PDGFbiCreERT2; JAK2V617F/WT mice displayed a higher propensity for thrombosis. This increased thrombus formation was mediated by an increased leukocyte adhesion in presence of JAK2V617F EC, secondary to an increase in P-Selectin expression at their surface. This work made it possible to highlight a new mechanism of the physiopathology of thrombosis during JAK2V617F MPN. Then we studied neutrophils and the phenomenon of NETosis (formation of neutrophil extracellular traps or NET) during MPN. We demonstrated that NET formation was increased in a cohort of patients with MPN, such as indirect markers of NETosis (plasmatic DNA and MPO-DNA). We found that plasma MPO-DNA levels were higher in patients with a history of thrombosis compared to patients without. We confirmed these results using two different mouse models in which we also found increased NET formation. We found that NET formation was involved in the physiopathology of thrombosis, as DNAse administration resulted in a reduction of thrombosis occurrence. Finally, we demonstrated that JAK2V617F platelets stimulated NET formation by JAK2V617F neutrophils, suggesting collaboration of these two cell types during the physiopathology of thrombosis during MPN.

Ce travail scientifique a abordé la problématique du vieillissement des îlots pancréatiques et l’effet de la senescence endothéliale et des microparticules (MPs) sur la fonction des îlots. Nous avons exploré l’impact du vieillissement du pancréas sur la morphologie, le devenir et la fonction de l’îlot pancréatique par analyse comparative entre pancréas de rats jeunes et d’âge moyen et le rôle des MPs endothéliales pro-sénescentes sur la fonction des îlots et leur sénescence prématurée. Nos résultats in vivo montrent que le pancréas est un organe précocement sensible au stress oxydant s’accumulant avec l’âge. Il conduit à la surexpression des marqueurs procoagulants et de senescence sans apparition d’apoptose. In vitro, les MPs de cellules endothéliales sénescentes ont un effet pro-sénescent sur les îlots pancréatiques isolés de rats jeunes avec une activité SA-β-galactosidase caractéristique, la surexpression des marqueurs p53, p21 et p16 et la réduction de la capacité de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. L’ensemble de nos résultats in vivo et in vitro désigne la contribution de la sénescence endothéliale comme une cause probable à la dysfonction de greffon. / This scientific work has tackled the question of the pancreatic islets aging and the effect of endothelial senescence and microparticles (MPs) on islet function. We investigated the impact of aging on pancreas morphology, fate and on the function of the pancreatic islet by comparative analysis between pancreas in young and middle-aged rats, as well as the role of pro-senescent endothelial MPs on islet function and their premature senescence. Our in vivo data show that the pancreas is an early sensitive organ to oxidative stress accumulating with age and leading to overexpression of the procoagulant and senescence markers without appearance of apoptosis. In vitro, MPs of senescent endothelial cells have a pro-senescent effect on pancreatic islets isolated from young rats with characteristic SA-β-galactosidase activity, overexpression of p53, p21 and p16 markers and reducing the ability of insulin secretion in response to glucose. Altogether, our in vivo and in vitro data indicate the contribution of endothelial senescence as a possible contributor to graft dysfunction.