Zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen, kurz EPCs, werden als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen genutzt. In einer prospektiven, randomisierten Cross-over-Studie wurden 18 chronische Dialysepatienten während jeweils vier Wochen mit Low-Flux-HD, High-Flux-HD sowie Hämodiafilatration behandelt. EPCs wurden zu Beginn sowie am Ende jedes Intervalls bestimmt. Trotz deutlicher Unterschiede bezüglich der Toxinentfernung im mittelmolekularen Bereich zeigte sich kein Einfluss auf Qualität und Quantität der EPCs / The number and function of endothelial progenitor cells (EPCs) are associated with the cardiovascular risk. In a prospective, randomized, cross-over trial, 18 maintenance dialysis patients were subjected to four weeks of each low-flux HD (LF-HD), high-flux HD (HF-HD), and online predilution hemodiafiltration (HDF). EPCs were determined at baseline and at the end of each four-week period. Despite a clear separation in middle molecular uremic toxin removal, there was no difference found in the effects of LF-HD, HF-HD, and HDF on EPCs

In dieser prospektiven, Cluster-randomisierten Studie wurde untersucht, inwieweit eine Steigerung der körperlichen Aktivität (mittels zusätzlichem täglichen Sportunterricht an Schulen) die körperliche Leistungsfähigkeit und die Anzahl sowie die migratorische Kapazität der zirkulierenden endothelialen Progenitorezellen (CPCs) beeinflusst. Zielparameter waren die maximale Sauerstoffaufnahme, der Body Mass Index, die Körperzusammensetzung, das Lipidprofil, die motorischen Fähigkeiten, sowie CPCs als ein Surrogatparameter für das kardiovaskuläre Risiko. 182 Kinder (Alter 11,1±0,7 Jahre) aus sieben Gymnasialklassen der sechsten Jahrgangsstufe wurden klassenweise in eine Interventions- (109 Kinder) und eine Kontrollgruppe (73 Kinder) randomisiert. Der Stundenplan der Kinder der Interventionsgruppe sah jeden Tag eine Schulstunde (45 Minuten) Sportunterricht vor, wohingegen die Kontrollgruppe nur die im Lehrplan vorgesehenen zwei Schulstunden Sport pro Woche erhielt. Als Referenzgruppe dienten zusätzlich zwei Klassen eines Sportgymnasiums (29 Schüler), deren Stundenplan 12 Schulstunden Sport pro Woche beinhaltet. Die Ergebnisse wurden mittels Kovarianz und Intraklassenkorrelation berechnet: Nach einem Jahr täglichen Sportunterrichts zeigte sich eine signifikante Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit (VO2max: 3,7ml/kg/min; 95% CI 0,3–7,2) sowie ein deutlicher Anstieg der Konzentration der CPCs (um 97 Zellen/1x 106Leukozyten; 95%CI -0,28–0,13) im Vergleich zu Schülern der Kontrollgruppe. Es zeigte sich ein Trend zu einer Abnahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas von 12,8% auf 7,3% und zu einer Steigerung der motorischen Fähigkeiten der Kinder der Interventionsgruppe (MQ: 4; 95%CI -1 – 8), jedoch beides ohne Signifikanz. Das Lipidprofil der Kinder Interventionsgruppe unterschied sich nicht signifikant (HDL-Cholesterol 0,03mmol/L; 95%CI -0,08 - 0,14). Insgesamt ergab sich ein signifikant positiver Effekt eines täglichen Sportunterrichts auf die körperliche Fitness der Schulkinder sowie die Anzahl der CPCs. Eine Erhöhung der körperlichen Aktivität bei Kindern ist damit eine wichtige und sinnvolle Interventionsmöglichkeit, die bei zukünftigen Primärpräventionsprogrammen unbedingt berücksichtig werden sollte. Langzeitbeobachtungen hinsichtlich des Einflusses auf das kardiovaskuläre Risikoprofil im Erwachsenenalter bleiben abzuwarten.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde mithilfe eines 4 stündigen Radmarathons die zeitabhängige Freisetzung von zirkulierenden Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde den 17 gesunden, gut trainierten Probanden während der Prozedur zu festgelegten Zeitpunkten Blut aus einer Venenverweilkanüle entnommen. Daraus wurden mittels Dichtegradient die mononuklearen Zellen isoliert und im Anschluss mittels Durchflusszytometrie die Konzentration der zirkulierenden Progenitorzellen quantifiziert. Es ließ sich ein signifikanter zeitversetzter Anstieg der Konzentration hämatopoietischer Progenitorzellen (CD34pos und CD133pos) wie auch endothelialer Progenitorzellen (CD34/KDRpos und CD133/KDRpos) ermitteln. Die maximale Konzentrationsänderung wurde nach 210 Minuten erreicht. Als Freisetzungsmediatoren wurden in dieser Arbeit die Konzentration von VEGF und IL-6 bestimmt. Auch hier stellte sich ein signifikanter Anstieg der Spiegel dar. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Zellpopulationen waren spätestens 24 Stunden nach Beendigung des Radmarathons nicht mehr nachweisbar. Des Weiteren ging die Arbeit der Frage nach, wie sich die Konzentration von Mikropartkel und endothelialer Mikropartikel als Marker für einen Endothelzellschaden auswirkt. Ein Anstieg der Konzentration reifer (CD146pos) Endothelzellen wurde verzeichnet. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die sehr beschränkte und kontroverse Datenlage bezüglich der Konzentrationen von Progenitorzellen freigesetzt durch sportliche Aktivität.

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Intaktes Endothel und die ausreichende Funktion der endothelialen NO-Synthase (eNOS) sind Voraussetzungen für gesunde Gefäße. Eine endotheliale Dysfunktion besteht bei Patienten mit kardiovaskulären Risikofaktoren bzw. manifester koronarer Herzerkrankung (KHK). Endotheliale Vorläuferzellen (EPC) sind ein wichtiger Faktor für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Endothels. Im klinischen Teil der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Vorläuferzellen mit zunehmender Schwere der KHK in geringerem Maß im Blut zirkulieren. Die Anzahl der EPC war bei Patienten mit einer koronaren 3-Gefäßerkrankung um 77 % geringer, die Anzahl der kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) um 50,3%, jeweils verglichen mit Patienten ohne KHK. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich die Konzentration des endogenen eNOS-Inhibitors asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) im Plasma mit zunehmender Schwere der KHK erhöhte (0,47 ± 0,02 μmol/l bei fehlender KHK gegenüber 0,58 ± 0,02 μmol/l bei koronarer 3-Gefäßerkrankung). ADMA ist über eine Hemmung der eNOS an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer endothelialen Dysfunktion beteiligt. Über diesen Weg wird vermutlich auch die Funktion der EPC erheblich eingeschränkt. Dies konnten wir anhand der In­vitro­Versuche mit EPC gesunder Spender zeigen. Dabei reduzierte sich unter ADMA-Einfluß die Anzahl der EPC in Kultur, die Anzahl und Größe der CFUs und ihre Funktion bzw. ihre Fähigkeit, sich in gefäßähnliche Strukturen zu integrieren. Eine gleichzeitige Gabe des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Rosuvastatin wirkte in all diesen In-vitro-Versuchen der hemmenden Wirkung von ADMA entgegen. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals eine inverse Korrelation zwischen ADMA-Spiegeln und der Anzahl und Funktion der EPC. Der negative Einfluss auf EPCs ist vermutlich ein wichtiger Mechanismus, über den ADMA der Entstehung und dem Fortschreiten kardiovaskulärer Erkrankungen Vorschub leistet. / Endothelial progenitor cells play a pivotal role in regeneration of injured endothelium, thereby limiting the formation of atherosclerotic lesions. Reduced numbers of EPCs may affect progression of coronary artery disease. Regulation of EPC mobilization and function is mediated in part by nitric oxide (NO). Endogenous inhibitors of NO synthases, such as ADMA, contribute to endothelial dysfunction and injury. We tested the hypothesis that asymmetric dimethylarginine (ADMA) may be an endogenous inhibitor of endothelial progenitor cells (EPCs). We used flow cytometry and in vitro assays to investigate the relationship between EPC number and function with ADMA plasma levels in patients with stable angina. The plasma concentration of ADMA was related to the severity of coronary artery disease and correlated inversely with the number of circulating CD34+/CD133+ progenitor cells (r = -0.69; p < 0.0001) and endothelial colony forming units (CFUs) (r = -0.75; p < 0.0001). Adjusting for all patient characteristics, we confirmed these findings in multivariate regression analyses. In vitro differentiation of EPCs was repressed by ADMA in a concentration-dependent manner. Compared with untreated cells, ADMA reduced EPC incorporation into endothelial tube-like structures to 27 +/- 11% (p < 0.001). Asymmetric dimethylarginine repressed the formation of CFUs from cultured peripheral blood mononuclear cells to 35 +/- 7% (p < 0.001). Asymmetric dimethylarginine decreased endothelial nitric oxide synthase activity in EPCs to 64 +/- 6% (p < 0.05) when compared with controls. Co-incubation with the hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase inhibitor rosuvastatin abolished the detrimental effects of ADMA. CONCLUSIONS: Asymmetric dimethylarginine is an endogenous inhibitor of mobilization, differentiation, and function of EPCs. This contributes to the cardiovascular risk in patients with high ADMA levels and may explain low numbers and function of EPCs in patients with coronary artery disease.

Dysfunktionale Angiogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung mikrovaskulärer Spätkomplikationen bei Diabetespatienten. Ziel der Dissertation ist es, die Auswirkungen der chronischen Hyperglykämie auf die Angiogenese im in vitro Diabetesmodell, sowie den Einfluss einer Proteinkinase C-Inhibition und β2-Adrenozeptorstimulation zu untersuchen. Die Experimente wurden an humanen umbilicalen Endothelzellen im Angiogeneseassay durchgeführt.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1. Diabetes mellitus 1.2. Endothel und Angiogenese 1.3. Diabetes mellitus und Endotheliale Dysfunktion 1.4. Therapeutische Interventionsmöglichkeiten und Forschungsbedarf 2. Fragestellung 3. Material 3.1. Zellkultur 3.2. Angiogeneseassay 3.3. Allgemeine Chemikalien 3.4. Herstellung der einzelnen Lösungen 3.4.1. Allgemeine Lösungen 3.4.2. Zellkultur 3.4.3. Angiogeneseassay 3.5. Software 4. Methoden 4.1. Ethikerklärung 4.2. Versuchsaufbau 4.3. Zellkultur 4.3.1. Gelatinebeschichtung von Zellkulturgefäßen 4.3.2. Präparation von Endothelzellen 4.3.3. Kultivierung und Passage der Endothelzellen 4.4. Angiogenese Assay (3D-Kultur) 4.4.1. Versuchsprotokoll Tag 1 4.4.2. Matrigelherstellung 4.4.3. FITC-Lektin-Färbung 4.4.4. Versuchsprotokoll Tag 2 4.4.5. DAPI-Färbung 4.4.6. Auswertung Angiogenese Assay 4.4.7. Eindeckelung 4.5. Statistische Analyse und Textverarbeitung 5. Ergebnisse 5.1. Menschliche venöse Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVECs) in der Zellkultur 5.2. Der Einfluss von Hyperglykämie (D-Glukose), 3-O-Methyl-D-Glukose und L-Glukose auf die Angiogenese 5.3. Der Effekt von Salbutamol unter normoglykämischen Bedingungen auf die Angiogenese 5.4. Der Effekt von Salbutamol und Bisindolylmaleimid 1 unter hyperglykämischen Bedingungen auf die Angiogenese 6. Diskussion der verwendeten Methoden 6.1. Zellkultur 6.2. Angiogeneseassay 6.3. Simulation des Diabetes mellitus im Zellkulturmodell 7. Diskussion der Ergebnisse 7.1. Effekte der Hyperglykämie auf die Angiogenese 7.2. Endotheliale Dysfunktion, verminderte NO-Bioverfügbarkeit und eingeschränkte Angiogenese 7.3. Pathomechanismen der Hyperglykämie induzierten endothelialen Dysfunktion –Akkumulation reaktiver Sauerstoffverbindungen 7.4. Hyperglykämie induzierte metabolische Signalwege 7.4.1. Steigerung des Polyolweges 7.4.2. Steigerung des Hexosaminweges 7.4.3. Akkumulation von AGEˈs (Advanced glycation end products) 7.4.4. Aktivierung des PKC-Signalweges 7.5. Die Effekte von Pharmaka auf die Angiogenese von unter Hyperglykämie kultivierten HUVEC – PKC-Inhibition durch BIM 7.6. Die PKC-Inhibition als therapeutischer Angriffspunkt 7.6.1. Der Effekt der PKC-Inhibition auf die endotheliale Funktion in Diabetesmodellen 7.6.2. Der Effekt der PKC-Inhibition auf die Angiogenese in Diabetesmodellen 7.6.3. Der Effekt der PKC-Inhibition auf mikrovaskuläre Komplikationen des Diabetes in klinischen Studien 7.6.4. Ein Ausblick 7.7. Die Effekte von Pharmaka auf unter Hyperglykämie kultivierte HUVEC – Der Effekt der Behandlung mit Salbutamol 8. Zusammenfassung der Arbeit 9. Literaturverzeichnis 10. Abbildungsverzeichnis 11. Tabellenverzeichnis

In dieser prospektiven, Cluster-randomisierten Studie wurde untersucht, inwieweit eine Steigerung der körperlichen Aktivität (mittels zusätzlichem täglichen Sportunterricht an Schulen) die körperliche Leistungsfähigkeit und die Anzahl sowie die migratorische Kapazität der zirkulierenden endothelialen Progenitorezellen (CPCs) beeinflusst. Zielparameter waren die maximale Sauerstoffaufnahme, der Body Mass Index, die Körperzusammensetzung, das Lipidprofil, die motorischen Fähigkeiten, sowie CPCs als ein Surrogatparameter für das kardiovaskuläre Risiko. 182 Kinder (Alter 11,1±0,7 Jahre) aus sieben Gymnasialklassen der sechsten Jahrgangsstufe wurden klassenweise in eine Interventions- (109 Kinder) und eine Kontrollgruppe (73 Kinder) randomisiert. Der Stundenplan der Kinder der Interventionsgruppe sah jeden Tag eine Schulstunde (45 Minuten) Sportunterricht vor, wohingegen die Kontrollgruppe nur die im Lehrplan vorgesehenen zwei Schulstunden Sport pro Woche erhielt. Als Referenzgruppe dienten zusätzlich zwei Klassen eines Sportgymnasiums (29 Schüler), deren Stundenplan 12 Schulstunden Sport pro Woche beinhaltet. Die Ergebnisse wurden mittels Kovarianz und Intraklassenkorrelation berechnet: Nach einem Jahr täglichen Sportunterrichts zeigte sich eine signifikante Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit (VO2max: 3,7ml/kg/min; 95% CI 0,3–7,2) sowie ein deutlicher Anstieg der Konzentration der CPCs (um 97 Zellen/1x 106Leukozyten; 95%CI -0,28–0,13) im Vergleich zu Schülern der Kontrollgruppe. Es zeigte sich ein Trend zu einer Abnahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas von 12,8% auf 7,3% und zu einer Steigerung der motorischen Fähigkeiten der Kinder der Interventionsgruppe (MQ: 4; 95%CI -1 – 8), jedoch beides ohne Signifikanz. Das Lipidprofil der Kinder Interventionsgruppe unterschied sich nicht signifikant (HDL-Cholesterol 0,03mmol/L; 95%CI -0,08 - 0,14). Insgesamt ergab sich ein signifikant positiver Effekt eines täglichen Sportunterrichts auf die körperliche Fitness der Schulkinder sowie die Anzahl der CPCs. Eine Erhöhung der körperlichen Aktivität bei Kindern ist damit eine wichtige und sinnvolle Interventionsmöglichkeit, die bei zukünftigen Primärpräventionsprogrammen unbedingt berücksichtig werden sollte. Langzeitbeobachtungen hinsichtlich des Einflusses auf das kardiovaskuläre Risikoprofil im Erwachsenenalter bleiben abzuwarten.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde mithilfe eines 4 stündigen Radmarathons die zeitabhängige Freisetzung von zirkulierenden Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde den 17 gesunden, gut trainierten Probanden während der Prozedur zu festgelegten Zeitpunkten Blut aus einer Venenverweilkanüle entnommen. Daraus wurden mittels Dichtegradient die mononuklearen Zellen isoliert und im Anschluss mittels Durchflusszytometrie die Konzentration der zirkulierenden Progenitorzellen quantifiziert. Es ließ sich ein signifikanter zeitversetzter Anstieg der Konzentration hämatopoietischer Progenitorzellen (CD34pos und CD133pos) wie auch endothelialer Progenitorzellen (CD34/KDRpos und CD133/KDRpos) ermitteln. Die maximale Konzentrationsänderung wurde nach 210 Minuten erreicht. Als Freisetzungsmediatoren wurden in dieser Arbeit die Konzentration von VEGF und IL-6 bestimmt. Auch hier stellte sich ein signifikanter Anstieg der Spiegel dar. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Zellpopulationen waren spätestens 24 Stunden nach Beendigung des Radmarathons nicht mehr nachweisbar. Des Weiteren ging die Arbeit der Frage nach, wie sich die Konzentration von Mikropartkel und endothelialer Mikropartikel als Marker für einen Endothelzellschaden auswirkt. Ein Anstieg der Konzentration reifer (CD146pos) Endothelzellen wurde verzeichnet. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die sehr beschränkte und kontroverse Datenlage bezüglich der Konzentrationen von Progenitorzellen freigesetzt durch sportliche Aktivität.

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Le développement tumoral implique non seulement la cellule cancéreuse mais aussi son environnement qui apporte les facteurs nutritifs nécessaires à la cellule tumorale, fourni le support sur lequel les cellules tumorales se développent mais aussi les facteurs de croissance dont la tumeur dépend.<br />Endocan, une molécule de cet environnement tumoral, est un protéoglycane secrété spécifiquement par la cellule endothéliale et dont l'expression, à l'état normal, est limitée principalement à l'endothélium pulmonaire et rénal. Endocan, par son glycane, interagit avec les facteurs de croissance et stimule la prolifération des cellules épithéliales. Endocan pourrait également intervenir dans la régulation de la migration leucocytaire trans-endothéliale en modulant l'interaction des intégrines (comme par ex le LFA-1) avec leur ligand. Endocan est surexprimé dans un nombre important de localisations tumorales comme le poumon, le sein, le colon et le rein. Dans le cancer du poumon et du sein, endocan fait partie d'un cluster de gènes de mauvais pronostic, sa surexpression étant liée à une mortalité plus précoce ou à des métastases plus fréquentes. <br />Nous avons montré qu'endocan a un effet de promotion de la croissance tumorale et que cette fonction est dépendante de l'interaction de son glycane avec les facteurs de croissance du microenvironnement tumoral.<br />Dans les modèles expérimentaux de cancer chez la souris SCID, nous avons démontré que le blocage d'endocan par l'intermédiaire d'anticorps monoclonaux freine la croissance tumorale, est que ce freinage est associé à un recrutement de leucocytes intra-tumoraux. <br />Dans les cancers broncho-pulmonaires humains nous avons démontré qu'endocan est surexprimé de manière importante et que cette expression est corrélée, avec celle du VEGF. Les taux circulants d'endocan sont également corrélés avec le pronostic des malades, avec une survie plus courte pour les patients ayant des taux élevés d'endocan. De manière intéressante les taux d'endocan étaient corrélés avec la présence de métastases à distance et au niveau ganglionnaire mais pas avec la taille tumorale. Endocan pourrait représenter un marqueur pronostique les cancers bronchopulmonaires et être le reflet de la stimulation angiogénique tumorale. <br />Nous nous sommes également intéressés à une autre pathologie néoplasique pulmonaire qu'est le mésothéliome pleural et les métastases pleurales des carcinomes. Nous avons pu montrer que les taux sériques d'endocan sont aussi liés au pronostic dans les adénocarcinomes métastasés à la plèvre mais pas dans le mésothéliome pleural. Nous avons pu montrer que les peptides solubles dérivés de la mesotheline (SMRP) sont un bon marqueur diagnostique du mésothéliome pleural épithélioïde. L'ostéopontine (une molécule pléiotrope impliquée, entre autres, dans l'adhésion et la survie cellulaire), et qui a été proposée comme marqueur pour le diagnostic précoce du mésothéliome pleural malin n'a que peu d'utilité dans le diagnostic des pleurésies chez les patients exposés à l'amiante. Par contre les deux marqueurs sont des facteurs indépendants de pronostic pour les mésothéliomes pleuraux.