Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire / The endothelin (ET) system is activated in pulmonary arterial hypertension (PAH); indeed, increased plasma levels of ET-1 were detected in patients with various forms of PAH and in various experimental models. The therapeutic value of pharmacological blockade of ET receptors has been demonstrated in various animal models and led to the current approval and continued development of these drugs for the therapy of human PAH. Whether the net effect of either selective ETA receptor blockade or combined ETA/ETB receptor blockade provides greater therapeutic benefit remains a subject of debate. Although the ET system contributes to PAH, we currently incompletely comprehend which local modifications of this system occur as a consequence of PAH, particularly in small resistance arteries, and how this could affect the pharmacological response to ET receptor antagonists. The purpose of the first study was therefore to evaluate potential modifications of the pharmacology of the ET system in rat pulmonary resistance arteries from monocrotaline-induced PAH. Our results reveal striking changes in pulmonary vasculature sensitivity to ET receptor antagonism in PAH that may be related to a reduction in ETB receptor expression. A better understanding of the exact role played by both ETA and ETB receptors on pulmonary resistance arteries might contribute to optimization of PAH treatments. Therefore the aim of the second study was to clarify the role played by both ETA and ETB receptors in ET-1 induced pulmonary vasoconstriction using an antisense (AS) oligonucleotide ex vivo treatment. In this study we have demonstrated that ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries. Furthermore, suppression of ETA receptors potentiated the response to ET-1 suggesting that in control condition the ETA receptor has an inhibitory action on the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction induced by the stimulation of the ETB receptor. Although the deleterious effects of ET-1 on the pulmonary circulation are well established, only a few studies have focused on ET-3 in PAH. Therefore, the purpose of the last study was to evaluate the potential implication of ET-3 in MCT-induced PAH and evaluate the roles of ETA and ETB receptors on ET-3-induced pulmonary vascular reactivity. In control condition, the use of a combination of both ETA and ETB receptor antagonists is necessary to reduce the ET-3 induced pulmonary vasoconstriction. In PAH, we found an increased ET-3 plasma levels and a modification of the pharmacological profile of ET receptor antagonists. Indeed, the use of either the ETA receptor antagonist or the dual antagonist was able to reduce the ET-3 response. The results from these three studies suggest that it is preferable to use a dual antagonist in the treatment of PAH. Indeed, (1) in PAH the use of a dual antagonist is as effective as the use of a selective ETA receptor antagonist (2) ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries and (3) ETB receptor plays an important role in the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction, suggesting that it is necessary to block both receptors to reduce the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction. Keywords: endothelin-1, endothelin-3, pulmonary resistance artery, receptor, endothelin receptor antagonist, dimerisation, phosphorothioate pulmonary arterial hypertension

Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire / The endothelin (ET) system is activated in pulmonary arterial hypertension (PAH); indeed, increased plasma levels of ET-1 were detected in patients with various forms of PAH and in various experimental models. The therapeutic value of pharmacological blockade of ET receptors has been demonstrated in various animal models and led to the current approval and continued development of these drugs for the therapy of human PAH. Whether the net effect of either selective ETA receptor blockade or combined ETA/ETB receptor blockade provides greater therapeutic benefit remains a subject of debate. Although the ET system contributes to PAH, we currently incompletely comprehend which local modifications of this system occur as a consequence of PAH, particularly in small resistance arteries, and how this could affect the pharmacological response to ET receptor antagonists. The purpose of the first study was therefore to evaluate potential modifications of the pharmacology of the ET system in rat pulmonary resistance arteries from monocrotaline-induced PAH. Our results reveal striking changes in pulmonary vasculature sensitivity to ET receptor antagonism in PAH that may be related to a reduction in ETB receptor expression. A better understanding of the exact role played by both ETA and ETB receptors on pulmonary resistance arteries might contribute to optimization of PAH treatments. Therefore the aim of the second study was to clarify the role played by both ETA and ETB receptors in ET-1 induced pulmonary vasoconstriction using an antisense (AS) oligonucleotide ex vivo treatment. In this study we have demonstrated that ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries. Furthermore, suppression of ETA receptors potentiated the response to ET-1 suggesting that in control condition the ETA receptor has an inhibitory action on the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction induced by the stimulation of the ETB receptor. Although the deleterious effects of ET-1 on the pulmonary circulation are well established, only a few studies have focused on ET-3 in PAH. Therefore, the purpose of the last study was to evaluate the potential implication of ET-3 in MCT-induced PAH and evaluate the roles of ETA and ETB receptors on ET-3-induced pulmonary vascular reactivity. In control condition, the use of a combination of both ETA and ETB receptor antagonists is necessary to reduce the ET-3 induced pulmonary vasoconstriction. In PAH, we found an increased ET-3 plasma levels and a modification of the pharmacological profile of ET receptor antagonists. Indeed, the use of either the ETA receptor antagonist or the dual antagonist was able to reduce the ET-3 response. The results from these three studies suggest that it is preferable to use a dual antagonist in the treatment of PAH. Indeed, (1) in PAH the use of a dual antagonist is as effective as the use of a selective ETA receptor antagonist (2) ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries and (3) ETB receptor plays an important role in the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction, suggesting that it is necessary to block both receptors to reduce the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction. Keywords: endothelin-1, endothelin-3, pulmonary resistance artery, receptor, endothelin receptor antagonist, dimerisation, phosphorothioate pulmonary arterial hypertension

Les récepteurs de type B de l'endothéline (ETB) sont présents sur l'enveloppe nucléaire des cardiomyocytes ventriculaires adultes (MVCAs). Il a été démontré que dans les MVCAs et les cellules endothéliales de rat, l’endocytose de l’endothéline marqué à la rhodamine colocalise avec le Lysotracker, un marqueur des lysosomes, mais n'est pas observée sur l’enveloppe nucléaire. Dans cette étude, nous avons caractérisé la localisation subcellulaire et la régulation de la biosynthèse de l’endothéline 1 dans les MVCAs et les fibroblastes cardiaques adultes de rat. Dans les deux types cellulaires les expériences d’immunocytofluorescence ont révélé une immunoréactivité de l’endothéline 1 correspondant à tous les stades de maturation du peptide, et détectable sur ou à proximité de la membrane nucléaire. L'enzyme de conversion d'endothéline 1(ECE1) est une métalloprotéase qui convertit la ̏ big˝ endothéline 1 en un peptide de 21 acides aminés biologiquement actif. L’immunoréactivité de l’ECE1 a été associée avec les tubules-T et les membranes nucléaires ou périnucléaires dans les MVCAs. Par contre, nous avons observé une immunoréactivité de l’ECE1 à la fois dans le noyau et le cytoplasme, mais pas sur la membrane plasmatique, dans les fibroblastes cardiaques à passage 3. L'ARNm de l’ET-1 a été détecté dans les deux types cellulaires. La régulation de la production de l'endothéline est principalement transcriptionnelle. L’application du facteur de croissance transformant ß1 (TGFß1) a augmenté l’ARNm de l’ET-1 dans les MVCAs et l'angiotensine II a stimulé l'augmentation de l’ARNm de l'ET-1 dans les fibroblastes. Dans les MVCAs, l'augmentation de l'ARNm ET-1 a été associée à une élévation du peptide intracellulaire ET-1 et du calcium nucléaire. Ces données suggèrent que l'endothéline endogène est disponible et serait capable d’activer le récepteur ETB nucléaire dans les MVCAs en réponse à des stimuli extracellulaires. / Type B endothelin receptors (ETB) are located in the nuclear envelope of adult ventricular cardiomyocytes (ACVMs). In both ACVMs and endothelial cells, endocytosed rhodamine endothelin colocalized with Lysotracker but was not observed at the nuclear membrane. In this study we have characterized the regulation and subcellular localization of endothelin biosynthesis in ACVMs and adult cardiac fibroblasts. In both cell types immunocytofluorescence experiments revealed endothelin-1 immunoreactivity, comprising all stages of peptide maturation, either on or near the nuclear membrane. Endothelin converting enzyme 1 (ECE1) is a metalloprotease that converts big endothelin to the biologically active 21-amino acid peptide. ECE1 immunoreactivity was associated with the T-tubules and nuclear or perinuclear membranes in ACVMs. In contrast, ECE1 immunoreactivity was observed both in the nucleus and the cytosol, but not at the plasma membrane, in passage 3 cardiac fibroblasts. Endothelin-1 mRNA was detected in both cell types. Regulation of endothelin production is primarily at the level of transcription. Application of TGFβ1 increased ET-1 mRNA in ACVMs whereas angiotensin II was effective in increasing ET-1 mRNA in fibroblasts. In AVCMs, the increase in ET-1 mRNA was associated with an increase of intracellular ET-1 peptide and nuclear calcium. These data suggest that endogenous endothelin is available and may activate nuclear ETB in ACVMs in response to extracellular stimuli.

Endothelin-1 (ET-1) ist ein gefä?aktives Peptid, welches zusätzlich verschiedenste nicht kardiovaskuläre physiologische und pathophysiologische Effekte besitzt. So wurde z.B. beschrieben, dass ET-1 in der Brustdrüse während der Schwangerschaft und Stillzeit exprimiert wird. Zusätzlich zu den bekannten Nährstoffen und Wachstumsfaktoren konnte auch ET-1 in der Muttermilch nachgewiesen werden, was auf eine physiologische Rolle von ET-1 für die Laktation und den säugenden Nachwuchs hinweist. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von ET-1 in der Brustdrüsenentwicklung mit Hilfe von ET-1 transgenen Mäusen aufgeklärt werden. Die eingesetzten transgenen Tiere überexprimieren humanes ET-1 mit den entsprechenden 5''- und 3'' regulatorischen Sequenzen. Mit Hilfe dieser Strategie sollen die ET-1 spezifischen Funktionen während der Brustdrüsenentwicklung untersucht werden. Transgenes ET-1 wurde während der Tragzeit und Stillzeit in der Brustdrüse detektiert. Die Ergebnisse zeigten, dass säugende Neugeborene der ET-1 transgenen Mäuse eine geringere Gewichtszunahme und eine erhöhte Mortalität aufwiesen, welches auf einen Laktationsdefekt hinweist. Die histologische Untersuchung der Brustdrüse während der Tragzeit ergab eine reduzierte Milchkanalausbildung, kollabierte und nicht expandierende Alveoli, vermehrte Adipozytenausbildung und fortbestehende zytoplasmatische Lipidtropfen (CLDs). Zusätzlich war die Expression des Milchproteins WAP reprimiert. Interessanterweise wurde diese Repression nicht durch STAT5, einem beschriebenem Regulator der Milchproteinexpression und Alveolarexpansion, vermittelt, da dessen Aktivität unverändert war. Als Konsequenz dieses Laktationsdefekts konnte eine verfrühte Rückbildung der Brustdrüse festgestellt werden. Diese ging mit einer erhöhten Expression von STAT3 einher. Interessanterweise wies der bekannte Aktivator von STAT3, LIF, ebenfalls eine gesteigerte Aktivität auf, sowohl während der Tragzeit als auch während der Laktation. Zusätzlich zu den beschriebenen Defekten bei der Milchabgabe zeigten histologische Untersuchungen der Brustdrüse eine Laktationshyperplasie während der mittleren Laktationsphase. In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, dass ET-1 Rezeptoren, neben den klassischen Signalwegen dieser G Protein-gekoppelte Rezeptoren, auch mit Tyosinkinaserezeptoren wie z. B. dem EGFR interagieren können. Brustdrüsen von ET-1 transgenen Tieren zeigten eine erhöhte Aktivität sowohl von EGFR als auch von ERK1/2, welches im Zusammenhang mit dem hyperplastischen Phänotyp stehen könnte. Die mögliche tumorfördernde Wirkung von ET-1 wird ferner durch die erhöhte Expression von Amphiregulin, einem EGFR-Liganden, während der Tragzeit und der Laktation verstärkt. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass ET-1 sowohl die Milchsekretion als auch den Milcheinschuss negativ beeinflusst, so dass eine ausreichende Versorgung säugender Jungtiere in der 1. Hälfte der Laktationsperiode nicht mehr gewährleistet ist. Zusätzlich verursachte ET-1 eine Laktationshyperplasie, welche auf die Induktion der EGFR-Achse zurückzuführen ist. Zusammenfassend kann somit festgestellt werden, dass die Ergebnisse auf eine wichtige Rolle von ET-1 in der Brüstphysiologie des Säugers hinweisen. / Endothelin-1 (ET-1) is a potent vasoactive peptide having wide physiological effects on vascular homeostasis and on a variety of pathophysiological processes unrelated to cardiovascular system. It has been noted that ET-1 is expressed in mammary glands during pregnancy and lactation periods. Furthermore, ET-1 is secreted into milk, suggesting additional physiological roles in the lactating mother and in the suckling neonate. Hence, the present study was proposed to elucidate the possible functional roles of ET-1 in mammary gland development employing ET-1 transgenic mice. ET-1 transgenic mice had been generated by using a human genomic ET-1 construct containing 5´ and 3´ regulatory sequences. This transgenic construction strategy grants to analyse the specific functions of ET-1 in normal mammary gland physiology. The transgene expression was found in mammary gland during pregnancy and lactation. ET-1 transgenic mice exhibited a lactational incompetence with reduced weight gain and increased mortality of their newborns, as a result of a secretory defect. In virtue of this defect, ET-1 transgenic mammary glands histologically revealed a reduced ductal outgrowth, collapsed alveoli with a reduced expansion capacity, increased adipocyte accumulation, and persistence of cystoplasmic lipid droplets (CLDs) during lactation. In addition, the expression of the milk protein, WAP, was found to be constantly suppressed in ET-1 mammary glands although the activity of STAT5, which is known to be a regulator of the expression of milk proteins and alveolar expansion, was found to be normal. Furthermore, as a consequence of the secretory defect, ET-1 transgenic mammary glands exhibited focal precocious involution during early stages of lactation along with an increased activity of STAT3. Consistently, the known activator of STAT3, LIF, was strongly upregulated during lactation and pregnancy. Besides the secretory defect of ET-1 transgenic mammary glands, histological analysis revealed a local lactational hyperplasia during the middle of lactation. Alternatively to the classical G protein-coupled receptors GPCR signalling pathways, endothelin receptors are able to communicate with tyrosine kinase receptors such as the epidermal growth factor receptor (EGFR) for which the term receptor transactivation was coined. Mammary glands of ET-1 transgenic animals exhibited an increased activity of the EGFR and ERK1/2, which could contribute to the observed hyperplastic phenotype. In support of the potential tumourigenicity of ET-1, one of the EGFR ligands, amphiregulin, was found significantly upregulated in ET-1 transgenic mammary glands, both during pregnancy and lactation periods. In summary, high levels of ET-1 affect the secretion and the milk let down process. Consequently the normal support of milk for the suckling neonates is severely impaired during the first half of the lactation period. In addition, ET-1 caused lactational hyperplasia in the mammary glands due to the induction of the EGFR axis. This suggests an important role for ET-1 in mammary gland physiology.

L’hypertension artérielle (HTA) est un problème de santé publique. Largement répandue dans le monde, elle touchait 40% des adultes âgés de plus de 25 ans et causait 9.4 millions de décès en 2008. Cette pathologie est la cause la plus commune de décès dans les pays développés et constitue un facteur de risque majeur d’atteintes cardiaques, rénales et cérébrales. Bien qu'étudiés depuis maintenant plus d'un demi-siècle, les mécanismes des atteintes systémiques liées à l'hypertension restent encore peu connus. L'augmentation de la pression artérielle est multifactorielle et découle aussi du dérèglement de certains systèmes tels le système rénine-angiotensine et le système endothéline. De récentes études ont suggéré un rôle de l’immunité innée dans le développement de l’HTA et des lésions qui y sont associées. L’endothéline-1 est un puissant vasoconstricteur. Sa production est déclenchée par différents stimuli dont l’AngII et des cytokines pro-inflammatoires. L’ET-1 agit via deux récepteurs : ETAR et ETBR. Pour ce projet, nous avons généré des souris ne possédant pas le récepteur ETB myéloïde (LysM-Cre Ednrb lox/lox). Ces souris ont été soumises à une perfusion chronique d’AngII associée à un régime hyper-sodé. Nous avons observé que les deux groupes de souris développent la même hypertension et les mêmes atteintes cardiaques. En revanche les atteintes des organes cibles sont moins importantes chez les souris LysM-Cre Ednrb lox/lox. La fonction rénale de ces dernières est préservée et, histologiquement, moins de lésions sont observées. Cette protection semble être due à l’incapacité des cellules myéloïdes à infiltrer les reins. En effet, la chimioattraction des cellules myéloïdes vers ET-1 est dépendante du récepteur ETB myéloïde. De plus, les cellules inflammatoires qui sont observées dans les reins des souris LysM-Cre Ednrb lox/lox présentent un phénotype anti-inflammatoire contrairement à leur contrôles. / Arterial hypertension is a major risk factor for atherosclerosis, coronary artery disease, stroke, and chronic kidney disease (CKD) and is one of the most prominent contributors to death worldwide. However, despite the frequency of hypertension, its cause in the majority of adults is unknown. Hypertension is complex, with no single mechanism entirely explaining the blood pressure (BP) rise in any given model. The past 50 years have seen growing evidence implicating the immune system. Recent data suggest that macrophages (M)/monocytes contribute to, and protect from, hypertension and its associated end organ injury. Endothelin-1 (ET-1) is the most potent endogenous vasoconstrictor. Its production is triggered by multiple stimuli including Ang II and pro-inflammatory cytokines. ET-1 acts by binding to two distinct receptors, the endothelin-A (ETA) and the endothelin-B (ETB) receptors. Interestingly, ET antagonism can blunt BP elevation in an Ang II model suggesting that ET-1 largely mediates the effects of Ang II. Here, we have generated mice specifically lacking ETB receptors on myeloid cells. We have shown that the development of hypertension associated with Ang II infusion is not dependent on these cells. Similarly, the cardiac dysfunction seen after 6 weeks of Ang II was similar between knockout and control mice. Interestingly, mice deficient of ETB receptors on myeloid cells alone were protected from Ang II induced vascular dysfunction and kidney injury. This protection appeared to relate to an inability for ETB receptor deficient Mto infiltrate the kidneys due to impaired chemokinesis towards ET-1. Furthermore, the Minfiltrating he kidney in response to Ang II in myeloid ETB receptor deficient mice overwhelmingly possessed an anti-inflammatory phenotype.

Einige Patienten mit Raynaud-Syndrom, Urtikaria, koronarer Herzkrankheit, Angina pectoris, oder Pulmonaler Hypertonie haben funktionelle Autoantikörper gegen die Thrombin-Rezeptoren PAR1/2 und/oder gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A). In dieser Arbeit wurde die Wirkung solcher Patienten-IgG-Präparate auf Funktionen von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten; humanen, glatten Muskelzellen aus Coronararterien (hCASMC), frisch isolierten, humanen Thrombozyten sowie von Monozyten untersucht. Zum Vergleich wurden die PAR-Agonisten Thrombin und das stimulierende Peptid SFLLRN sowie Endothelin-1 verwendet. Während aufgereinigte ET(A)-Autoantikörper ERK1/2 in Kardiomyozyten nicht aktivierten, bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern hier eine ähnliche Aktivierung wie das Peptid SFLLRN. Überraschenderweise bewirkte Kontroll-IgG eine starke Aktivierung von ERK1/2. Die Coinkubation der Kardiomyozyten mit Antikörper-Präparaten und IL-1beta erhöhte die Phosphorylierung von ERK1/2 in allen Fällen. In hCASMCs bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern und Kontroll-IgGs eine Aktivierung von ERK1/2, ET(A)-Autoantikörper nicht. Die Ergebnisse der Thrombozytenaktivierung durch Patienten-IgG waren unterschiedlich. Versuche mit vorstimulierten Thrombozyten zeigten, dass ein stimulierender Einfluss der Autoantikörper auf präaktivierte Thrombozyten nicht ausgeschlossen werden kann. Ohne Vorstimulation jedoch schien Patienten-IgG eher einen hemmenden Einfluss auf die Thrombozytenfunktion zu haben. Eine Vorinkubation von Monozyten mit Patienten-IgG hatte keinen Einfluss auf die PMA-induzierte Produktion von Superoxidanion im Vergleich zu Kontroll-IgG. Nur bei zwei von fünf Patienten-IgGs konnte eine stimulierende Wirkung anhand der monozytären ERK1/2-Phosphorylierung gefunden werden. Die Schlussfolgerung aus dieser Arbeit liegt darin, dass PAR1/2- und ET(A)-Autoantikörper keine allgemeine Wirkung auf die Funktion von glatten Gefäßmuskelzellen, Thrombozyten und Monozyten zeigten. Die Unterscheidung von Autoantikörper-positiven und -negativen IgG-Präparaten war nur über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten möglich. / Some patients with Raynaud’s syndrome, urticaria, coronary artery disease, Angina or pulmonary hypertension have functional autoantibodies against thrombin receptors PAR1/2 and/or against endothelin receptor ET(A). In this work the effects of such patients’ IgG preparations on functions of ventricular cardiomyocytes of neonatal rats, human smooth muscle cells from coronary arteries (hCASMC); freshly isolated, human platelets as well as monocytes were investigated. For comparison, the PAR agonists thrombin and the stimulating peptide SFLLRN as well as endothelin-1 were used. While purified autoantibodies against ET(A) did not activate ERK1/2 in cardiomyocytes, IgG preparations with autoantibodies against PAR1/2 resulted in a similar activation as the peptide SFLLRN. Surprisingly, control IgG also caused a strong activation of ERK1/2. Coincubation of cardiomyocytes with antibody preparations and IL-1beta increased the phosphorylation of ERK1/2 in all cases. In hCASMCs, IgG preparations with PAR-autoantibodies and control IgGs caused activation of ERK1/2, whereas ET(A)-autoantibodies did not. The results of platelet activation with patients’ IgG were varying. Tests with prestimulated platelets showed, that a stimulating effect of the autoantibodies on preactivated platelets can not be excluded. However, without prestimulation patients’ IgG rather seemed to have an inhibiting effect on platelet function. Preincubation of monocytes with patients’ IgG had no influence on PMA-induced production of superoxide anion compared with control IgG. Only two of five patients’ IgGs showed a stimulating effect on monocytic ERK1/2 phosphorylation. In conclusion, PAR1/2- and ET(A)-autoantibodies showed no common effects on the function of vascular smooth muscle cells, platelets and monocytes. The differentiation of autoantibody-positive and -negative preparations of IgG only was possible by determining the beating rate of cardiomyocytes.

Ziel dieser Arbeit war es, neue Therapieprinzipien zu entwickeln und zu überprüfen, ob diese geeignet sind, ein Rechtsherzversagen nach Implantation eines LVAD bei Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz zu verhindern. Bei Patienten mit chronischem Linksherzversagen erhöht sich der pulmonalvaskuläre Widerstand. Als Ursache wird eine Dysregulation des pulmonalen Gefäßendothels verstanden, die mit einer gestörten Freisetzung von NO und einer erhöhten Expression von Endothelin einhergeht und die bei längerem Bestehen auch strukturelle Veränderungen der Lungenstrombahn nach sich zieht. Bei Patienten mit chronischem Linksherzversagen führt dies zu einer sekundären pulmonalen Hypertonie, die direkt die rechtsventrikuläre Funktion beeinträchtigt und durch eine Vasodilatantientherapie zunächst noch reversibel ist. Nach LVAD-Implantation bei terminaler Herzinsuffizienz steigt häufig der pulmonalvaskuläre Widerstand unter anderem infolge der extrakorporalen Zirkulation weiter an, so daß bei vielen Patienten ein Rechtsherzversagen aufgund der sekundären pulmonalen Hypertonie mit hoher Morbidität und Mortalität auftritt. Weder positiv inotrope Pharmaka noch systemische Vasodilatantien oder gar die sekundäre Implantation eines RVAD konnten das Problem bisher lösen. Einen völlig neuen Therapieansatz stellt die inhalative Verabreichung von NO dar, welches durch die direkte Wirkung auf die glatte Gefäßmuskulatur eine selektive Vasodilatation in der pulmonalen Zirkulation bewirkt und somit konsekutiv die rechtsventrikuläre Nachlast senkt, ohne dabei den systemischen Widerstand zu beeinflussen. Zunächst wurden die klinischen Effekte einer inhalativen NO-Therapie bei Patienten untersucht, die nach Implantation eines LVAD aufgrund einer rechtsventrikulären Dysfunktion bei sekundärer pulmonaler Hypertonie ein postoperatives low-cardiac-output-Syndrom entwickelt hatten. Im ersten Teil der Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß die ausgeprägtesten hämodynamischen Wirkungen bei einer individuellen NO-Dosis zwischen 25 und 40 ppm NO erreicht werden. Bis zu 40 ppm nahmen der pulmonalvaskuläre Widerstand und der pulmonalarterielle Mitteldruck progredient ab, während der Cardiac Index dosisabhängig signifikant stieg, ohne daß dabei eine Änderung der systemischen Druck- und Widerstandsverhältnisse zu bemerken war. Die pulmonalvaskuläre Selektivität der inhaltiven NO-Therapie sowie die teils dramatische hämodynamische Verbesserung waren somit bestätigt. Auch unter Dauerapplikation der jeweils individuell ausgetesteten optimalen NO-Dosierung zeigte sich über den gesamten Behandlungszeitraum die oben beschriebene signifikante hämodynamische Verbesserung mit Abnahme der rechtsventrikulären Nachlast bei gleichzeitiger Zunahme des Cardiac Index. Zusätzlich wurde mittels TEE ein stetiger Anstieg der RVEF und ein Abfall des RVEDV dokumentiert. Somit konnte bei den Patienten unter NO-Therapie zunächst die Katecholamingabe deutlich reduziert und die NO-Behandlung ausgeschlichen werden. Im Verlauf der Therapie kam es weder durch eine abrupte Unterbrechung der NO-Zufuhr bei täglich durchgeführten NO-Auslassversuchen noch bei Beendigung der Therapie zu einer hämodynamischen Verschlechterung, was indirekt die Erholung des rechten Ventrikels belegt. Trotz der insgesamt eindrucksvollen hämodynamischen Verbesserung unter Beatmung mit NO gab es einige Patienten, bei denen trotz hochdosierter Katecholamintherapie und adäquatem Volumenersatz die rechtsventrikuläre Dysfunktion persistierte. Dies wurde darauf zurückgeführt, daß durch Zunahme des Cardiac Index und somit des venösen Rückstromes nach LVAD-Implantation eine Erholung der Rechtsherzfunktion nicht möglich war. Um die Erholung der Rechtsherzfunktion über eine Minimierung der rechtsventrikulären Schlagarbeit zu ermöglichen, wurde ein zu sämtlichen anderen Therapiestrategien kontroverses Konzept entwickelt, das sowohl der rechtsventrikulären Vorlast und Nachlast als auch der inotropen Therapie Rechnung trägt. Statt wie bisher einen hohen Cardiac Index anzustreben wurde jetzt untersucht, ob nicht bei einem postoperativ recht niedrigen Cardiac Index von 2.5 L/min/m2 (( 2.3 L/min/m2 und ( 2.8 L/min/m2) mit daraus folgender Verminderung der Schlagarbeit eine Erholung des rechten Ventrikel möglich ist, ohne dabei jedoch die Organperfusion zu gefährden. Dies beinhaltete neben einer frühzeitig eingeleiteten NO-Beatmung eine minimale Katecholamintherapie und einen restriktiven Volumenersatz. Deshalb wurde mit der NO-Beatmung bereits intraoperativ bei Abgang vom kardiopulmonalen Bypass begonnen. Ein Cardiac Index von circa2.5 L/min/m2 erwies sich bei den analgosedierten und beatmeten Patienten für eine adäquate Organperfusion als ausreichend und zeigte sich darüber hinaus als geeignet, ein Rechtsherzversagen zu verhindern und eine Restitution der rechtsventrikulären Funktion sicherzustellen. Die inhalative NO-Therapie wurde auch hier bei allen Patienten ohne Auftreten eines Rebound-Phänomen beendet. Bekannt ist, daß Endothelin-1 als potenter endogener Vasokonstriktor (Produktion als auch Elimination hauptsächlich in der Lunge) eine pulmonale Hypertonie auslösen kann und damit als Antagonist zum wichtigsten endothelialen Mediator der pulmonalen Vasodilatation, dem NO, betrachtet wird. Zur Klärung weiterer pathophysiologischer Grundlagen wurden die Plasmaspiegel von ET-1 und Big ET-1 unter NO-Therapie nach LVAD-Implantation gemessen. Die präoperativen ET-1- und Big ET-1-Plasmaspiegel waren, wie bei terminaler Herzinsuffizienz zu erwarten, deutlich erhöht und korrelierten mit dem pulmonalvaskulären Widerstand. Dass die höchsten Plasmakonzentrationen von ET-1 intraoperativ gemessen wurden steht in Einklang mit anderen Untersuchungen und wurde mit einer durch den kardiopulmonalen Bypass ausgelösten endothelialen Dysfunktion erklärt. Unter inhalativer NO-Therapie fielen die Plasmaspiegel von ET-1 und Big ET-1 signifikant ab und waren nach Beendigung der Therapie am niedrigsten. Es bestand eine signifikante, inverse Korrelation zwischen der mittleren inhalativen NO-Dosis und den Plasmaspiegeln von ET-1 und Big ET-1. Simultan mit dem Abfall der Plasmaspiegel der Endotheline verbesserte sich die Hämodynamik. Der Abfall des pulmonalarteriellen Druckes korrelierte mit dem Abfall der ET-1-Plasmaspiegel. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, daß eine inhalative NO-Therapie, welche die bei sekundärer pulmonaler Hypertonie pathophysiologisch defiziente endogene NO-Produktion ausgleicht, neben einer pulmonalselektiven Vasodilatation auch zu einer NO-vermittelten Inhibition der Endotheline ET-1 und Big-ET-1 führt. Da auch die Linksherzinsuffizienz durch die mechanische Entlastung mit einem LVAD suffizient behandelt ist, kann sich erneut ein physiologisches Gleichgewicht zwischen den Antagonisten NO und Endothelin in der Lungenstrombahn einstellen, das eine Dysfunktion des pulmonalen Gefäßendothels behebt. Dies erklärt, dass eine NO-Beatmung nur vorübergehend erforderlich ist und nach Beendigung der NO-Inhalation ein Rebound-Phänomen mit Wiederanstieg des pulmonalvaskulären Widerstands und konsekutiver Rechtsherzbelastung ausbleibt. Zur Unterstützung der rechtsventrikulären Funktion nach Implantation eines LVAD wurden folgende Therapieprinzipien etabliert: - Eine inhalative NO-Therapie sollte frühzeitig bereits zum Abgang vom kardiopulmonalen Bypass eingesetzt werden. - Eine intraindividuelle Dosistitration von NO ist sinnvoll um einen optimalen Behandlungseffekt mit der geringst möglichen Dosis zu erzielen. - Die inhalative NO-Therapie senkt selektiv den pulmonalvaskulären Widerstand und verursacht keine systemische Hypotension. Die rechtsventrikuläre Nachlast fällt ab, ohne dass die linksventrikulären Füllungsdrucke pathologisch ansteigen, da der linke Ventrikel durch das LVAD entlastet ist. - Tritt trotz NO-Beatmung eine rechtsventrikuläre Dysfunktion auf, so ist zur weiteren Entlastung des rechten Ventrikels ein niedriger Cardiac Index von circa 2.5 L/min/m2 angezeigt, um den venösen Rückstrom gering zu halten. - Dies ist durch eine minimale Katecholamintherapie und einen restriktiven Volumenersatz zu erzielen. Die Reduktion der rechtsventrikulären Schlagarbeit erlaubt eine Erholung der rechtsventrikulären Funktion. - Die ET-1- und Big-ET-1-Plasmaspiegel fallen um so rascher ab, je langsamer die NO-Dosis reduziert wird, da zwischen den Plasmaspiegeln der Endotheline und der mittleren inhalativen NO-Dosis eine inverse Korrelation gefunden wurde. Daher ist eine schrittweise Entwöhnung der inhalativen NO-Therapie erforderlich, um ein Rebound-Phänomen zu verhindern. - NO-Auslaßversuche sind geeignet, um in kritischen Fällen die Abhängigkeit von einer NO-Beatmung in der Entwöhnungsphase zu überprüfen. - Da eine Dysfunktion des pulmonalen Gefäßendothels nach Beendigung der inhalativen NO-Therapie offensichtlich nicht mehr fortbesteht, ist im weiteren klinischen Verlauf in der Regel nicht mit einer erneuten Rechtsherzbelastung durch einen Anstieg des pulmonalvaskulären Widerstands zu rechnen. / This thesis aimed to develop and evaluate new therapeutic principles to prevent right ventricular failure following LVAD implantation in patients with end-stage heart failure. Pulmonary vascular resistance increases in patients with chronic left ventricular failure. The mechanism is thought to be a dysregulation of the pulmonary vascular endothelium with an impaired release of NO and increased expression of endothelin, which in the long term leads to structural changes in the pulmonary circulation. In patients with chronic left ventricular failure this causes secondary pulmonary hypertension, directly compromising right ventricular function, but initially this is not fixed and is still reversible by vasodilator therapy. Following LVAD implantation in end-stage heart failure, pulmonary vascular resistance may further increase, partially due to cardiopulmonary bypass, and many patients develop frank right ventricular failure due to aggravation of secondary pulmonary hypertension, which is associated with a high morbidity and mortality. Neither positive inotropic drugs nor systemic vasodilators or even the secondary implantation of a RVAD were able to solve the problem. A novel therapeutic approach is the administration of inhaled NO, which directly acts on vascular smooth muscle cells causing selective pulmonary vasodilation and therefore decreases right ventricular afterload without altering systemic vascular resistance. The clinical effects of NO inhalation therapy were first studied in patients presenting with postoperative low cardiac output syndrome after LVAD implantation due to secondary pulmonary hypertension and right ventricular dysfunction. In this first study the greatest hemodynamic effects were demonstrated at individually titrated doses of 25 to 40 ppm NO. The pulmonary vascular resistance and the mean pulmonary artery pressure progressively decreased with increasing doses up to 40 ppm NO, as the cardiac index significantly increased dependent on dosage and without any noticeable change of the systemic arterial pressure or systemic vascular resistance. Thus a selective pulmonary vasodilating effect of inhaled nitric oxide along with a hemodynamic improvement, which in some patients was dramatic, was demonstrated. During continuous administration with the individually titrated optimal dose significant beneficial effects were shown during the entire treatment period with a decrease of the right ventricular afterload and a consequent increase of the cardiac index. In addition, a steady increase of the RVEF and a decrease of the RVEDV were demonstrated by TEE. This permitted us to first lower the catecholamine dose in these patients and then to wean them of the NO therapy. In the course of NO therapy hemodynamic deterioration was provoked neither by acute interruption of NO administration at daily performed "NO-off-trials", nor after weaning of NO therapy, which indirectly proved regeneration of the right ventricle. Although an overall impressive hemodynamic improvement was demonstrated with NO inhalation there were some patients in whom right ventricular dysfunction persisted despite maximal inotropic support and adequate volume replacement. This was thought to be due to the increase in cardiac index and thereby venous return after LVAD implantation preventing restoration of right ventricular function. To permit improvement of right ventricular function by minimizing right ventricular stroke work, a comprehensive concept contradictory to all other treatment strategies was developed, taking right ventricular preload, afterload and inotropic therapy into account. Instead of the intention being to generate a high cardiac index, it was studied whether a relatively low postoperative cardiac index of 2.5 L/min/m2 (= 2.3 L/min/m2 and = 2.8 L/min/m2) which decreases stroke work, enables the right ventricle to regenerate without compromising perfusion to vital organs. This meant early administration of inhaled NO, minimal catecholamine support and restrictive volume replacement. NO inhalation was initiated intraoperatively as soon as weaning from cardiopulmonary bypass had taken place. A cardiac index of 2.5 L/min/m2 proved to be sufficient in the analgosedated and ventilated patients to ensure sufficient organ perfusion and in addition proved to be successful in preventing right ventricular failure and permitting restitution of right ventricular function. Inhaled NO therapy was weaned successfully without rebound phenomena. The potent endogenous vasoconstrictor endothelin-1 (produced and eliminated primarily in the lungs) has been shown to cause pulmonary hypertension and is an antagonist of the most important endothelial mediator of pulmonary vasodilation, NO. To further elucidate the pathophysiology, plasma levels of ET-1 and big ET-1 were measured during NO therapy following LVAD implantation. As expected in end-stage heart failure, the preoperative ET-1 and big ET-1 plasma levels were considerably increased and correlated with the pulmonary vascular resistance. The highest plasma concentrations of ET-1 were measured intraoperatively, which is in keeping with other studies and has been explained by an endothelial dysfunction triggered by cardiopulmonary bypass. Plasma levels of ET-1 and big ET-1 fell significantly during NO therapy and were lowest after termination of inhaled NO. A significant inverse correlation was found between the mean inhaled NO dose and the ET-1 and big ET-1 plasma levels. Hemodynamics improved simultaneously with the drop in plasma levels of the endothelins. The decrease of the pulmonary artery pressures correlated with the decrease of the ET-1 plasma levels. It can be derived from the results that inhaled NO not only induces pulmonary selective vasodilation by replacing a deficient endogenous NO production in secondary pulmonary hypertension, but inhaled NO also inhibits the endothelins ET-1 and big ET-1. In addition, left ventricular failure is effectively treated by mechanical unloading through the LVAD, thus permitting a new physiologic balance to develop between the antagonists NO and endothelin in the pulmonary circulation and ameliorating dysfunction of the pulmonary vascular endothelium. This explains why NO inhalation is needed only as an intermediate therapy and the fact that a rebound phenomenon with increases in pulmonary vascular resistance and consecutive right ventricular constraint does not occur. To support right ventricular function after LVAD implantation, the following therapeutic principles have been established: - Inhaled NO therapy should be started early on weaning from cardiopulmonary bypass. - Intraindividual dose titration is useful to ensure maximal effects with minimal doses. - Inhaled NO selectively decreases pulmonary vascular resistance without inducing systemic hypotension. Right ventricular afterload decreases without pathologically increased left ventricular filling pressures, as the left ventricle is unloaded by the LVAD. - If right ventricular dysfunction presents despite NO inhalation, venous return should be lowered to relieve the right ventricle, by keeping the cardiac index low at around 2.5 L/min/m2. - This is accomplished by minimal inotropic support and restrictive volume replacement. Regeneration of right ventricular function is made possible by a reduction of right ventricular stroke work. - The slower the inhaled NO dose was lowered, the faster the ET-1 and big ET-1 plasma levels fell, as an inverse correlation was found between the plasma levels of the endothelins and the mean inhaled NO dose. Therefore stepwise weaning of inhaled NO therapy is essential in preventing rebound phenomena. - "NO-off-trials" are useful to monitor inhaled NO dependency during weaning from NO therapy in critical cases. - As dysfunction of the pulmonary vascular endothelium obviously does not persist after cessation of inhaled NO therapy, as a rule right ventricular compromise due to an increase in pulmonary vascular resistance does not occur during the further clinical course.

by Chi Fung Yeung. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 83-120). / Abstracts in English and Chinese. / abstract --- p.1 / table of contents --- p.3 / acknowledgments --- p.8 / declaration --- p.9 / list of figures and tables --- p.10 / list of abbreviations --- p.13 / Chapter chapter 1- --- general introduction --- p.15 / Chapter 1.1 --- VASOACTIVE PEPTIDES --- p.18 / Chapter 1.1.1 --- HISTORICAL BACKGROUND --- p.18 / Chapter 1.1.1.1 --- Adrenomedullin --- p.20 / Chapter 1.1.1.2 --- Calcitonin gene-related peptide --- p.21 / Chapter 1.1.1.3 --- Endothelin-3 --- p.22 / Chapter 1.1.2 --- "SYNTHESIS AND RELEASE OF ADRENOMEDULLIN, CALCITONIN GENE RELATED PEPTIDE AND ENDOTHELINS" / Chapter 1.1.2.1 --- SYNTHESIS AND RELEASE OF Adrenomeduulin --- p.24 / Chapter 1.1.2.2 --- SYNTHESIS AND RELEASE OF calcitonin gene related peptide --- p.25 / Chapter 1.1.2.3 --- SYNTHESIS AND RELEASE OF ENDOTHELINS --- p.25 / Chapter 1.1.3 --- "ADRENOMEDULLIN, CALCITONIN GENE RELATED PEPTIDE AND ENDOTHELINS IN THE CNS" --- p.26 / Chapter 1.1.4 --- "RECEPTORS OF ADRENOMEDULLIN, CALCITONIN GENE RELATED PEPTIDE AND ENDOTHELINS AND SIGNAL TRANSDUCTION" --- p.27 / Chapter 1.1.5 --- "BIOLOGICAL ACTIONS OF ADRENOMEDULLIN, CALCITONIN GENE RELATED PEPTIDE AND ENDOTHELINS" / Chapter 1.1.5.1 --- BIOLOGICAL ACTIONS OF ADRENOMEDULLIN --- p.30 / Chapter 1.1.5.1.1 --- haemodynamic effects of adrenomedullin --- p.30 / Chapter 1.1.5.1.2 --- Renal effects of Adrenomedullin --- p.31 / Chapter 1.1.5.1.3 --- Endocrine effects of Adrenomedullin --- p.31 / Chapter 1.1.5.1.4 --- Central effects of Adrenomedullin --- p.32 / Chapter 1.1.5.2 --- CALCITONIN GENE RELATED PEPTIDE / Chapter 1.1.5.2.1 --- haemodynamic effects of calcitonin gene related peptide --- p.33 / Chapter 1.1.5.2.2 --- Renal effects of calcitonin gene related peptide --- p.34 / Chapter 1.1.5.2.3 --- Endocrine effects of calcitonin gene related peptide --- p.34 / Chapter 1.1.5.2.4 --- Central effects of calcitonin gene related peptide --- p.35 / Chapter 1.1.5.3 --- ENDOTHELINS / Chapter 1.1.5.3.1 --- haemodyamic effects of endothelins --- p.36 / Chapter 1.1.5.3.2 --- Renal effects of Endothelins --- p.36 / Chapter 1.1.5.3.3 --- endocrine effects of endothelins --- p.37 / Chapter 1.1.5.3.4 --- Central effects of Endothelins --- p.37 / Chapter 1.1.6. --- PROLIFERATIVE OR ANTI-PROLIFERATIVE EFFECTS --- p.38 / Chapter 1.1.7 --- CLINICAL RELEVANCE OF VASOACTIVE PEPTIDES / Chapter 1.1.7.1 --- Clinical relevance of Adrenomedullin --- p.39 / Chapter 1.1.7.2 --- Clinical relevance of calcitonin gene related peptide --- p.40 / Chapter 1.1.7.3 --- Clinical relevance of Endothelins --- p.41 / Chapter 1.2 --- ASTROCYTES / Chapter 1.2.1 --- Historical background and astrocyte morphology --- p.42 / Chapter 1.2.2 --- Physiological roles of astrocytes --- p.44 / Chapter 1.2.3 --- Pathology of astrocytes --- p.45 / Chapter 1.3 --- NEUROPEPTIDE RECEPTORS AND ASTROCYTES / Chapter 1.3.1 --- Neuropeptide receptors on astrocytes --- p.47 / Chapter 1.3.2 --- Consequences of receptor activation --- p.49 / Chapter 1.4 --- AIMS OF THE THESIS --- p.50 / Chapter CHAPTER 2 --- "GENERAL MATERIALS AND METHODS, AND DATA ANALYSIS" / Chapter 2.1 --- MATERIALS / Chapter 2.1.1 --- ANIMALS --- p.54 / Chapter 2.1.2 --- PEPTIDE HORMONES --- p.54 / Chapter 2.1.3 --- ISOTOPES AND RADIOIMMUNOASSAY KITS --- p.54 / Chapter 2.1.4 --- CULTURE MATERIALS AND CHEMICALS --- p.55 / Chapter 2.1.5 --- PREPARATION OF MATERIALS / Chapter 2.1.5.1 --- Preparation of primary cultures of astrocytes --- p.55 / Chapter 2.1.5.2 --- Preparation of medium and binding buffer --- p.56 / Chapter 2.1.5.3 --- Preparation of 125I-labelled vasoactive peptides --- p.56 / Chapter 2.1.6 --- MEASUREMENT OF CELLULAR CYCLIC AMP --- p.57 / Chapter 2.1.7 --- DETERMINATION OF PROTEIN CONTENT OF CULTURED ASTROCYTES --- p.60 / Chapter 2.2 --- METHODS --- p.61 / Chapter 2.2.1 --- LIGAND BINDING: MEASUREMENT OF 125I-AM AND 125I-CGRP BINDING / Chapter 2.2.1.1 --- Binding kinetics --- p.61 / Chapter 2.2.1.2 --- Determination of specific binding of 125I-AM and 125I-CGRP --- p.61 / Chapter 2.2.1.3 --- Competition binding studies --- p.62 / Chapter 2.2.2 --- "BIOCHEMICAL INTERACTIONS BETWEEN ET3, AM, CGRP AND PKC-ANALOG" / Chapter 2.2.2.1 --- Determination of the production of cAMP in response to AM and CGRP --- p.62 / Chapter 2.2.2.2 --- Determination of the effect of PMA on AM and CGRP-dependent CAMP production --- p.63 / Chapter 2.2.2.3 --- Determination of the effect of the phorbol esters on AM and CGRP-dependent cAMP production --- p.63 / Chapter 2.2.2.4 --- Elucidation of antagonistic effect of staurosporine and Ro31-8220 --- p.64 / Chapter 2.2.2.5 --- Determination of the effects of ET-3 on AM and CGRP- dependent CAMP accumulation --- p.64 / Chapter 2.2.2.6 --- Determination of the effects of PKC inhIBition on ET-3 suppression of AM- and CGRP-induced CAMP responses --- p.64 / Chapter 2.2.2.7 --- Elucidation of antagonistic effect of cycloheximide --- p.65 / Chapter 2.3 --- STATISTIC ANALYSIS --- p.65 / Chapter CHAPTER 3 --- RESULTS / Chapter 3.1 --- BINDING KINETICS OF 125I-AM AND 125I-CGRP --- p.68 / Chapter 3.2 --- SPECIFIC BINDING OF 125I-AM AND 125I-CGRP --- p.68 / Chapter 3.3 --- COMPETITION BINDING --- p.68 / Chapter 3.4 --- DOSE RESPONSE OF ADRENOMEDULLIN AND CGRP- STIMULATED CAMP PRODUCTION --- p.69 / Chapter 3.5 --- EFFECTS OF PHORBOL ESTERS ON AM AND CGRP DEPENDENT CAMP ACCUMULATION --- p.69 / Chapter 3.6 --- EFFECT OF PMA ON AM AND CGRP-DEPENDENT CAMP ACCUMULATION --- p.70 / Chapter 3.7 --- EFFECT OF ET-3 ON AM AND CGRP-DEPENDENT CAMP ACCUMULATION --- p.70 / Chapter 3.8 --- "THE EFFECTS OF STAUROSPORINE, RO 31-8220" --- p.71 / Chapter 3.9 --- EFFECT OF CYCLOHEXIMIDE ON THE SUPPRESSIVE ACTION OF ET3 --- p.72 / Chapter CHAPTER 4 --- DISCUSSION --- p.73 / Chapter CHAPTER 5 --- GENERAL CONCLUSION --- p.80 / REFERENCES --- p.83 / APPENDIX-PUBLISHED PAPER

Pigmentation plays a protective role against damage caused by ultraviolet (UV) irradiation. Humans with fair skin and light hair have a higher susceptibility to UV-induced DNA damage that can lead to the development of skin cancers. The melanocytes found in the skin and hair follicles depend on different signaling molecules for their proper development and pigment production. α-Melanocyte Stimulating Hormone (α-msh) binds to the Melanocortin 1 receptor (Mc1r) to regulate pigment production and the switch between eumelanin and pheomelanin. Lethal yellow mice (Ay) overexpress the agouti signaling protein, which inhibits the binding of α-msh, resulting in a yellow coat color phenotype. Endothelin 3 (Edn3) encodes for a ligand involved in melanocyte development by regulating the differentiation, proliferation and migration of melanocyte precursors. A tetracycline inducible transgenic mouse in which Edn3 was placed under the keratin 5 promoter (K5-tTA;TRE-Edn3-lacZ) displays a hyperpigmentation phenotype due to the accumulation of melanocytes in the skin and an increase in hair pigment. Comparative analysis of dorsal hairs from Ay and Ay; K5-tTA;TRE-Edn3-lacZ mice using high performance liquid chromatography showed that transgenic Edn3 expression significantly increased both eumelanin and pheomelanin. No significant difference in the number of follicular melanocytes between Edn3 transgenic and non-transgenic mice was evidenced by immunofluorescence using an antibody against Tyrosinase related protein 1. Gene expression analysis of hair follicles showed that Edn3 upregulates the expression of melanogenic genes. Deactivation of transgenic Edn3 is possible with doxycycline (dox) treatment. To test if transgenic Edn3 expression is required to rescue and maintain a dark pigmentation phenotype in Ay mice, dox was administered during embryonic and postnatal development to manipulate transgenic Edn3 expression. Results showed that transgenic Edn3 expression is required to maintain a dark pigmentation phenotype after birth but is independent of a developmental requirement. Transgenic Edn3 expression in Mc1re/e mice also resulted in a darkened coat color. Our results indicate that the paracrine expression of Edn3 from keratinocytes is capable of generating and maintaining a dark coat color by the regulation of melanogenic genes independent of Mc1r signaling. The results of this study may open new approaches to the treatment of hypopigmentation disorders.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2009. / Härtill 5 uppsatser. Även tryckt utgåva.