Au cours du développement des lymphocytes B, le locus des chaînes lourdes des immunoglobulines (IgH) subit deux types de réarrangements intra-géniques : 1) La recombinaison V(D)J qui se produit aux stades précoces du développement lymphocytaire et qui cible les régions variables du locus, et 2) la commutation de classe initiée à un stade plus tardif du développement et qui permet aux cellules B d'acquérir de nouvelles fonctions effectrices suite au changement des domaines constants des Ig. Ces deux processus contribuent à la grande diversité du répertoire des anticorps, à la spécificité et à la vigueur de la réponse immunitaire. Durant ces deux processus, la transcription des gènes des Ig, appelée transcription germinale, a un rôle essentiel. Elle est une des clés de l'accessibilité de la chromatine aux enzymes nécessaires à l'initiation des recombinaisons. La transcription germinale est régulée par des éléments cis-régulateurs qui effectuent leur fonction à de longues distances au sein du locus IgH. Parmi ces éléments, la région de contrôle du locus appelée 3'RR (3' regulatory region) est un élément majeur de contrôle de l'expression du locus IgH aux stades tardifs du développement B. Cependant, son rôle aux stades précoces du développement était inconnu. Mon travail de thèse a visé à mieux comprendre la fonction de la 3'RR tout au long du développement des lymphocytes B avec une attention particulière aux stades précoces. Dans une première étude, nous avons analysé le rôle de la 3'RR dans la transcription germinale associée à la recombinaison V(D)J en utilisant une lignée murine dépourvue de la 3'RR. Nous avons d'abord mis au point une technique de PCR quantitative en temps réel afin de quantifier les réarrangements V(D)J. Nous avons ensuite montré que la 3'RR avait en fait une activité répressive sur la transcription sens et anti-sens du domaine variable du locus IgH, et que la transition d'un effet silencer à un effet activateur corrélait avec l'achèvement des réarrangements V(D)J. Dans une deuxième étude, nous nous sommes intéressés à l'effet de la 3'RR sur les promoteurs des gènes constants en utilisant deux modèles murins portant des mutations à des sites stratégiques du locus IgH. L'analyse phénotypique et moléculaire des deux modèles nous a permis de montrer que la 3'RR établissait un domaine transcriptionnellement actif dès les stades précoces du développement. Cependant, l'effet activateur de la 3'RR sur ses promoteurs cibles était bloqué à ces stades par un site de fixation du facteur architectural CTCF. La délétion de ce site ou l'insertion d'un promoteur dans le domaine transcriptionnel de la 3'RR délimité par le site CTCF, aboutissent à une activation prématurée et différentielle des promoteurs cibles. Mes travaux de thèse ont permis de définir, pour la première fois, la fonction de la 3'RR aux stades précoces du développement B, indépendants de l'activation antigénique, et de révéler des mécanismes développementaux plus complexes que la simple induction de la 3'RR initiée par la rencontre de la cellule B avec l'antigène. / During B cell development, the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus undergoes two types of intragenic rearrangements: 1) V(D)J recombination at early stages of B cell development which targets the variable region of the locus, and 2) class switch recombination at the mature B cell stage which enables B cells to acquire novel effector functions upon a change of the constant domain of Ig molecules. Both processes contribute to the wide diversity of antibody repertoire, and to the specificity and robustness of an immune response. Transcription of recombining genes is associated with V(D)J recombination and classswitching. This transcription, called germline transcription, plays a key role in the accessibility of the chromatin of target sequences to the enzymes required for the initiation of recombination. Germline transcription is regulated by cis-acting elements that often act at long distances within the locus. Among these long-range elements, a locus control region called the 3' regulatory region (3'RR) is known to play a major role in IgH locus expression at late stages of B cell development. However, its role at early stages is unknown.The main objective of my PhD work was to contribute to a better understanding of the function of the 3'RR throughout B cell development, with a special focus on early stages. In a first study, we analyzed the role of the 3'RR in the regulation of germline transcription associated with V(D)J recombination by using a mouse line devoid of the 3'RR. We first set up a sensitive real-time PCR to quantify V(D)J recombination. We then went on to show that in fact, the 3'RR mediated a transcriptional silencing activity on both sense and antisense transcription along the variable region of the IgH locus, and that the switch off of this silencing activity correlated with the completion of V(D)J recombination, after which the 3'RR became a transcriptional enhancer. In a second study, we investigated the effect of the 3'RR on germline promoters of the constant genes by using two murine models bearing specific mutations at strategic sites of the IgH locus. Phenotypic and molecular analyses of the two models enabled us to show that the 3'RR establishes a transcriptionally active domain at early stages of B cell development, upon completion of V(D)J recombination. Nonetheless, the activating effect of the 3'RR on constant genes at early stages is insulated by the architectural factor CTCF. Deletion of this CTCFbinding site or insertion of a germline promoter within the 3'RR-mediated transcriptionally active domain, led to specific and premature activation of target germline promoters. My PhD work enabled us to elucidate for the first time the developmentally regulated function of the 3'RR at early stages of B cell development, prior to antigen challenge. It also revealed a more complex picture of the 3'RR function than the hitherto simple induction of the 3'RR upon encounter with antigen.

Ilf3 et NF90, deux protéines de liaison aux ARN localement structurés en double-brin, sont générées par épissage mutuellement exclusif à partir du gène ILF3. Pour chacune d’entre-elles, un épissage alternatif permet la synthèse de deux isoformes, une longue et une courte, qui diffèrent par la présence ou non d’une séquence de 13 acides aminés localisée à leur extrémité N-terminale et qui correspond à un signal de localisation nucléolaire. La particularité de ces deux protéines est de présenter une forte hétérogénéité avec au moins 20 isoformes produites à partir du même gène, 12 pour Ilf3 et 8 pour NF90. Elle est générée par deux mécanismes complémentaires, l’épissage alternatif et les modifications post-traductionnelles dont deux ont été mises en évidence au laboratoire, la diméthylation asymétrique de l’arginine 609/622 présente dans une séquence consensus de type RGG et catalysée par PRMT1 (« protein arginine N-methyltransferase 1 ») ainsi qu’une phosphorylation sur la sérine 190/203. Ce polymorphisme pourrait être à l’origine des différences de localisation subcellulaire observées selon l’isoforme considérée et/ou aurait comme fonction de réguler soit leurs interactions avec leurs partenaires protéiques ou nucléiques, soit leur activité biologique. Par des expériences d’immunofluorescence et de « GST pull-down », il a été montré que ces deux modifications post-traductionnelles d’Ilf3 et de NF90 ne semblent impliquées ni dans leur localisation subcellulaire, ni dans la régulation de leurs interactions avec leurs partenaires protéiques. Du fait des nombreuses fonctions associées aux protéines Ilf3 et NF90 dans la littérature, les modifications identifiées pourraient être impliquées dans la régulation de leurs interactions avec leurs partenaires nucléiques, ADN ou ARN. / Ilf3 and NF90, two double stranded RNA-binding proteins, are generated by exclusive splicing from the ILF3 gene. For each one, a 5? alternative splicing leads to the synthesis of a long and a short isoforms that differ by the presence or not of 13 amino acid sequence at their N-terminus corresponding to a nucleolar localization signal. The characteristic of these two proteins is to exhibit a high degree of heterogeneity with at least 20 isoforms produced from the same gene, 12 for Ilf3 and 8 for NF90. It is generated by two complementary mechanisms, alternative splicing and posttranslational modifications which two have been identified in the laboratory, the arginine 609/622 asymmetric dimethylation present in a RGG consensus sequence and catalyzed by PRMT1 ("protein arginine N-methyltransferase 1") and the serine 190/203 phosphorylation. This polymorphism could explain the various cellular functions described for both proteins and could regulate their subcellular localization and the interaction with protein or nucleic partners. By immunofluorescence and GST pull-down experiments, it was shown that these two posttranslational modifications of Ilf3 and NF90 neither seem involved in their subcellular localization, nor in the regulation of interactions with their protein partners. Because of the many functions associated with Ilf3 and NF90 proteins in the literature, the identified modifications may be implicated in regulating the interactions with their nucleic partners, DNA or RNA.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第21946号 / 理博第4524号 / 新制||理||1650(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)准教授 佐藤 ゆたか, 教授 高橋 淑子, 教授 中務 真人 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

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Cromolyn sodium (CS) has clinically shown to be an effective topical remedy for atopic dermatitis, however its physiochemical properties prevent efficient passive drug delivery beyond the outermost skin layer. This project aimed to optimize CS gel formulations and applications to improve drug delivery to the dermis of skin by examining various topical enhancement strategies. Oleic acid, salcaprozate sodium, and microneedles were investigated as enhancers for their effect on skin permeation of CS. In vitro permeation studies across dermatomed porcine ear skin tested CS gels to determine 24-hour drug permeation profiles and skin layer distribution of drug. Further, extraction method efficiency, the enhancement mechanism of salcaprozate sodium, and gel stability were investigated. It was concluded that microneedle pretreatment delivered the greatest amount of CS to the dermis using a 4% CS gel without chemical enhancement. These results provide a promising option for a commercially available topical treatment of atopic dermatitis.

The TALE factors, comprising the pbx and prep/meis gene families, are transcription factors (TFs) vital to the proper formation of anterior anatomical structures during embryonic development. Although best understood as essential cofactors for tissue-specific TFs such as the hox genes during segmentation, the TALE factors also form complexes with nuclear factor Y (NFY) in the early zygote. In zebrafish, Pbx4, Prep1, and NFY are maternally deposited and can access their DNA binding sites in compact chromatin. Our results suggest that TALE/NFY complexes have a unique role in early embryonic development which is distinct from each factor’s independent functions at later stages. To characterize these TALE/NFY complexes, we employed high-throughput transcriptomic and genomic techniques in zebrafish embryos. Using dominant negatives to disrupt the function of each factor, we find that they display similar, but not identical, loss-of-function phenotypes and co-regulate genes involved in transcription regulation and embryonic development. Independently, the TALE factors regulate homeobox genes and NFY governs cilia-related genes. ChIP-seq analysis at zygotic genome activation reveals that the TALE factors occupy DECA sites adjacent to CCAAT boxes near genes expressed early in development and involved with transcription regulation. Finally, DNA elements containing TALE and NFY binding sites drive reporter gene expression in transgenic zebrafish, and disruption of TALE/NFY binding via mutation or dominant negatives eliminates this expression. Taken together, this data suggests that the TALE factors and NFY cooperate to regulate a set of development and transcription control genes in early zygotic development but also have independent roles after gastrulation.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第19405号 / 医科博第65号 / 新制||医科||5(附属図書館) / 32430 / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 斎藤 通紀, 教授 竹内 理 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第20533号 / 生博第375号 / 新制||生||50(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 杉田 昌彦, 教授 米原 伸, 教授 清水 章 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM