Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En el mundo, uno de los patógenos más frecuentemente aislado desde brotes causados por Enfermedades Transmitidas por los Alimentos es Salmonella spp. En Chile, el serotipo que posee la mayor prevalencia es Salmonella Enteritidis (S.E), aislado principalmente desde productos de origen animal como la carne de ave y otros productos cárnicos como las cecinas. Considerando que las medidas para controlar S.E en alimentos son de vital importancia, en este estudio se implementaron cuatro protocolos de inoculación experimental en cecinas, con el fin de disponer previamente de una herramienta fundamental que permita a futuro analizar nuevas tecnologías tendientes a disminuir este patógeno en los alimentos. Así, en este estudio se presentan los resultados de la inoculación experimental con S.E mediante cuatro protocolos en distintos tipos de cecinas, determinando tanto la dosis mínima (102 – 106 UFC/mL) y la mejor técnica de aplicación del inóculo (con homogeneización/sin homogeneización), como la forma de presentación de las matrices (laminado/molido) para lograr porcentajes de positividad a S.E ≥ 80%, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración. Adicionalmente se estudia la eficiencia de la adición de Piruvato de Sodio en los medios de cultivo para la recuperación de S.E en cecinas contaminadas y almacenadas a temperatura de refrigeración. En las cecinas contaminadas se obtuvieron porcentajes de positividad ≥ 80% con la mayoría de los protocolos analizados y con bajas dosis de S.E (102 – 103 UFC/mL). La adición de Piruvato de Sodio no entregó diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) al compararlo con medios de cultivo sin suplemento / Proyecto FONDECYT 1110038

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Salmonelosis es una de las enfermedades transmitidas por alimentos más importantes a nivel mundial. Ocasiona un cuadro gastroentérico y en casos extremos puede ser mortal. En Chile, el serotipo más frecuente es Salmonella Enteritidis, el cual está asociado al consumo de ovo productos, platos preparados, vegetales y carnes, entre ellas la de bovino. El biocontrol de Salmonella spp. en alimentos mediante el uso de bacteriófagos, es una medida complementaria a los métodos de prevención y control utilizados actualmente. En la presente investigación se analizó la actividad lítica de una mezcla de cinco bacteriófagos nativos sobre S. Enteritidis, en carne fresca de bovino contaminada experimentalmente, luego de diez días de almacenamiento. Se utilizaron dosis de contaminación de 103 UFC/mL y de 105 UFC/mL para temperatura ambiente (18 °C) y de refrigeración (2 a 8 °C) respectivamente, aplicando la mezcla de fagos con una MOI de 104. Se logró contaminar la totalidad de las muestras en todos los grupos experimentales. La administración de la mezcla de bacteriófagos logró reducir significativamente (p≤ 0,0001) los recuentos bacterianos promedios en 3,65 log UFC/g (5,29 log UFC/g grupo control versus 1,64 log UFC/g grupo experimental) a temperatura ambiente, y en 3,54 log UFC/g (4,42 log UFC/g grupo control versus 0,88 log UFC/g grupo experimental) a temperatura de refrigeración. Las reducciones bacterianas obtenidas demuestran el efecto lítico de la mezcla de fagos aplicada, sobre S. Enteritidis, en carne fresca de bovino contaminada / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1110038

Salmonella é um dos principais agentes de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) em todo o mundo. No Rio Grande do Sul, uma cepa de Salmonella Enteritidis vem sendo identificada como o principal agente causador de DTA na última década, a qual foi nominada SE86. Quando comparada com outros sorovares de Salmonella, a SE86 demonstrou maior capacidade de adaptação ácida e térmica, além de maior resistência contra diferentes sanificantes. O presente estudo teve como objetivo investigar o envolvimento dos genes rpoS e dps na resistência ao hipoclorito de sódio e do gene ompR na adaptação ácida e resistência térmica da cepa S. Enteritidis SE86. Os genes avaliados foram atenuados pela técnica de Knockout e a expressão dos mesmos foi investigada pela técnica Epitope Tagging - 3 x FLAG. Os resultados demonstraram que a cepa mutante SE86, sem a presença do gene dps ( dps), demonstrou uma maior sensibilidade em relação à cepa SE86 Wild Type (WT), após a exposição ao hipoclorito de sódio a 200 ppm. As proteínas Rpos e Dps foram ativamente expressas nas mesmas condições de exposição ao hipoclorito de sódio, demonstrando assim a relação destes genes com o estresse oxidativo provocado por hipoclorito de sódio na SE86. O envolvimento do gene ompR na resistência térmica foi investigado após a adaptação ácida de SE86 WT e do mutante ompR. As células ácido adaptadas do mutante ompR foram completamente inativadas após 240 minutos de exposição a temperatura de 52º C, enquanto que as células WT resistiram até 300 minutos de exposição. A expressão da proteína OmpR foi observada por Western blotting e confirmou a relação da adaptação ácida com a maior resistência térmica da SE86. / Salmonella is one of the main agents of foodborne diseases worldwide. In Rio Grande do Sul, a clone of Salmonella Enteritidis has been identified as the main cause of foodborne diseases in the last decade, which was named SE86. The the present study aimed to investigate the involvement of rpoS and dps genes in resistance to sodium hypochlorite and ompR gene in acid adaptation and thermal resistance of the strain S. Enteritidis SE86. The genes evaluated were attenuated by knockout technique and their expression was determined by tagged (3XFLAG) strains. The results demonstrated that strain S. Enteritidis SE86 without the presence of dps gene ( dps) showed a higher sensitivity to the wild type strain SE86 (WT) when exposed to sodium hypochlorite at 200 ppm. Furthermore, RpoS and Dps proteins were actively expressed in these experimental conditions, thus demonstrating the relationship of these genes with oxidative stress in S. Enteritidis SE86 caused by sodium hypochlorite. The involvement of ompR gene in thermal resistance was observed after the acid adaptation of S. Enteritidis SE86 WT and ompR since cells adapted acid without the presence of ompR have been completely inactivated when exposed to 240 min at temperature of 52 °C, while WT cells resisted until 300 min of exposure. The expression of the OmpR protein by western blotting confirmed the necessity of the acid adaptation for that S. Enteritidis SE86 resists to high temperatures.

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Marcelo Brocchi / Banca: Jacqueline Boldrin de Paiva / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Karin Werther / Resumo: Salmonella Enteritidis (SE) é responsável pela maioria dos casos de infecções alimentares em seres humanos e, geralmente, está associada ao consumo de produtos de origem avícola. Nas aves, SE coloniza o intestino, podendo sobreviver utilizando como substrato o 1,2 propanodiol (1,2-Pd) disponível neste ambiente, cujo metabolismo é viabilizado pela ação da enzima propanodiol desidratase, codificada por genes do operon pdu. A enzima propanodiol desidratase necessita de cianocobalamina como cofator enzimático, a qual é codificada pelos genes cobS e cbiA. Neste estudo, utilizou-se uma estirpe de SE e duas mutantes, sendo uma com os genes pduC, pduD, pduE defectivos (SE ΔpduCDE) e outra com os genes pduC, pduD, pduE, cobS e cbiA (SE ΔcobSΔcbiAΔpduCDE) inativados, na tentativa de avaliar a importância do 1,2-Pd para a colonização intestinal e invasão de órgãos durante a infecção de aves por SE. No primeiro experimento, estimou-se as quantidades das estirpes em baço, fígado e conteúdo cecal de aves de postura de variedades vermelha e branca. Um segundo ensaio foi realizado para verificação da excreção fecal, por meio de suabes cloacais. Aliado a isso, caracterizou-se a resposta imunológica em aves SPF desafiadas com estirpes de SE acima descritas por meio da avaliação das populações de linfócitos T CD4+ e TCD8+ em fígado e tonsilas cecais e também pela quantificação de genes responsáveis pela expressão das citocinas IL-6, CCL4, CXCLi2 e IL-22 em tonsilas cecais e IL-6 e IL-18 em baço. Observou-se que as estirpes mutantes foram capazes de colonizar o intestino e invadir o baço e fígado da mesma forma que a estirpe selvagem, sendo que as aves de postura de variedade vermelha foram mais susceptíveis a infecção sistêmica. Tanto a estirpe selvagem como as mutantes estimularam o mesmo perfil de resposta imune nas aves SPF. Portanto, os genes pduC, pduD, pduE, cobS e cbiA não são necessários para... / Abstract: Salmonella Enteritidis (SE) is responsible for majority of the cases of foodborne diseases in humans and usually is associated with the consumption of poultry origin products. In birds, SE colonizes the intestine and can survive using 1,2 propanodiol (1,2-Pd) as substrate. The metabolisation of the 1,2-Pd is possible by the action of propanodiol dehydratase enzyme, encoded by genes pdu operon. Cyanocobalamin, which is encoded by genes cobS and cbiA, is the cofactor required by propanodiol dehydratase. In this study, we used one SE wild type strain and two mutants, one with mutations in pduC, pduD and pduE genes (SE ΔpduCDE) and another with mutations of pduC, pduD, pduE, cobS and cbiA genes (ΔcobSΔcbiAΔpduCDE) in attempt to evaluate the importance of 1,2-Pd for intestinal colonization and invasion of organs during infection of birds. In the first experiment, bacterial counts for all strains were obtained from spleen, liver and cecal content of white and brown varieties of commercial egg-layers. In the second assay, faecal shedding of the strains was assessed by cloacal swabs. Additionaly, immunological responses were characterised by the assessment of T CD4+ and T CD8+ cell populations in liver and cecal tonsils from SPF (Specific Pathogen Free) chicks challenged with the three strains. Complementary transcripts of genes encoding the cytokines IL-6, CCL4, CXCLi2 and IL-22 in cecal tonsils, and IL-6 and IL-18 in liver were obtained for relative quantification by qRT-PCR. It was observed that SE mutant strains were able to colonise the intestine and invade spleen and liver in the same way as the wild type strain. Brown variety of birds was more susceptible to systemic infection than white birds. Furthermore, the immune response profiles triggered by the SE wild type and the two mutants in SPF chicks were very similar. Therefore, data for the present study suggest that pduC, pduD, pduE, cobS e cbiA genes would not be essencial to ... / Doutor

Salmonella is a common enteric pathogen and is the most frequently reported bacterial infection in the United States. The two most commonly reported serotypes causing human illness in the United States are Salmonella serotype Typhimurium and Salmonella serotype Enteritidis (SE). The incidence and number of foodborne outbreaks of SE started to increase in the 1970s and by 1994, SE was the most common Salmonella serotype reported to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). SE has been most commonly associated with consumption of shell eggs. Outbreak reports were obtained from the Foodborne Disease Outbreak Surveillance System (FDOSS) and analyzed. The number of outbreaks of SE has declined by 67% since 1990, likely as a result of the combined effect of on-farm interventions, public health policies, and food safety education messages. In addition to the decline in SE outbreaks, study findings demonstrate that there have been changes in the geographical distribution of SE outbreaks in the US. “Simple egg” foods and retail food settings have been the most commonly and consistently associated vehicles and food consumption and preparation settings with SE outbreaks in the US from 1973 to 2008.

Pulsed Electric Field (PEF) processing, a novel, non-thermal food preservation method, has been shown to inactivate both spoilage and pathogenic microorganisms, while minimizing changes in the physical and organoleptic qualities of the food, such as those observed under conventional thermal processing. An understanding of the inactivation mechanisms and kinetics of microorganisms exposed to lethal or sub-lethal PEF treatments would allow industry and consumers to better understand and evaluate the potential of PEF technology as an alternative or complement to traditional methods of food preservation. This study consisted of three sets of experiments which sought to determine: (i) the electrical conductivity (EC) of various liquid food products (apple, orange and pineapple juices, egg white, whole egg and egg yolk) at different temperatures (5--55°C); (ii) the capacity of PEF (15 kV cm-1, 0°C) to inactivate Escherichia coli O157:H7 in dialyzed liquid egg products; and (iii) the effect of PEF (20 or 30 kV cm-1) in combination with temperature (10--40°C) on the inactivation of E. coli and Salmonella Enteritidis in liquid egg yolk (EY), whole egg (WE), or egg white (EW). The treatment chamber design was based in part on regression equations of EC vs. temperature developed in the first set of experiments. After only 0.1 sec of PEF (15 kV cm-1) treatment, l, 3 and 3.5 log reductions of E. coli were noted in dialyzed egg white, egg yolk and whole egg, respectively. Kinetic models of bacterial inactivation were proposed. A 210 mus exposure to PEF (30 kV cm-1 ) resulted in log reductions of 5.0 and 5.0 in egg yolk, 3.9 and 3.6 in WE and, 2.8 and 3.6 in egg white, for E. coli and S. Enteritidis, respectively. A maximum energy of 914 J was required to inactivate S. Enteritidis in WE. In egg white, cells injured by PEF represented 0.9 and 0.4 log for S. Enteritidis and E. coli, respectively. An exponential decay model and an Arrhenius equation were

Die Salmonellose gehört weltweit zu den wichtigsten Zoonosen, und insbesondere Eier sowie Eiprodukte stellen eine der häufigsten Infektionsquellen für den Menschen dar. Es ist von großer Wichtigkeit, sich bei der Bekämpfung der Salmonellose auf Legehennenbestände zu konzentrieren, wo Salmonella (S.) Enteritidis nach wie vor das vorherrschende Serovar darstellt. Derzeit wird die Bruteidesinfektion mit Formaldehydgas durchgeführt. Aufgrund seines kanzerogenen Potentials ist jedoch mit einem baldigen Verbot zu rechnen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, eine alternative Möglichkeit für die Bruteidesinfektion anbieten zu können. Im Hinblick darauf sollte die Wirkung einer Ozonbegasung auf die Reduktion der S. Enteritidis-Zahl auf der Schalenoberfläche überprüft werden. Hierzu wurde die Eioberfläche mit verschiedenen S. Enteritidis-Stämmen unterschiedlicher Kontaminationsdosen (10E5 - 10E6 bzw. 10E2 - 10E4 KbE/Schale) künstlich kontaminiert und anschließend mit einer Ozonkonzentration zwischen 0,3 und 5 % (wt/wt O2), bei unterschiedlicher relativer Luftfeuchtigkeit (unter 30 %, ~70 %) in einer Labor-Kammer begast. Nach Erreichen der gewünschten Konzentration wurden die Eier für eine definierte Einwirkzeit (zwischen 0 und 24 h) in der Kammer belassen. Drei unterschiedliche S.-Stämme sind getestet worden, um stammesspezifische Unterschiede feststellen zu können. Insgesamt sind 26 verschiedene Kombinationsmöglichkeiten mit der hohen und 13 mit der geringeren Kontaminationsdosis untersucht worden, um die Salmonellen 100 %ig zu inak-tivieren, und dabei das Erbgut der Tiere nicht negativ zu beeinflussen. Zusätzlich wurden zur Erhebung der Schlupfrate nach einer Behandlung mit Ozon 4 Praxis-Versuche mit unter-schiedlicher Ozonierungsstärke und Einwirkzeit (0,5 - 1 % Ozon mit 20 - 120 min Einwirkzeit) durchgeführt. Es folgte eine Aufstallung der Küken in verschiedene Haltungssysteme sowie eine regelmäßige Beurteilung der Gewichtszunahme und Legeleistung Tiere, um mögliche ozonbedingte Folgeschäden ausschließen zu können. Des Weiteren sollte die ermittelte Ozonierungsstärke und -zeit auf ihre Wirksamkeit in einer hier entwickelten Prototyp-Kammer untersucht werden. Aus technischen Gründen waren nur Höchstkonzentrationen von 0,7 % zu erreichen, welche in Kombination mit 120 bzw. 180 min Einwirkzeit, in jeweils 6 verschiedenen Versuchen mit oben genannten Kontaminations-dosen, im Hinblick auf die Salmonellenzahlreduktion auf der Schalenoberfläche untersucht wurde. Auch hier erfolgte in 2 weiteren Versuchen die Ermittlung der Schlupfrate nach Begasung bei 0,7 % Ozon in Kombination mit 120 und 180 min Einwirkzeit. Um eine Aussage darüber treffen zu können, ob das Prinzip der Ozonbegasung, neben der Bruteiproduktion, auch auf Konsumeier ausgeweitet werden kann, sind die Eier zusätzlich mit verschiedenen Konzentration-Zeit-Kombinationen begast und anschließend sensorisch beurteilt worden. Folgende Schlussfolgerungen können aus der vorliegenden Arbeit gezogen werden:  Ozonkonzentration, Einwirkzeit und relative Luftfeuchte sind die drei Parameter, die den größten Einfluss auf die Desinfektionswirkung besitzen. Dabei gilt: je höher die Ozonkonzentration und Einwirkzeit gewählt werden, desto höher auch die Keimzahlreduktion. Die relative Luftfeuchte muss hierbei mindestens 70 % betragen.  Stammesspezifische Unterschiede zwischen den drei gewählten S. Enteritidis-Stämmen konnten nicht festgestellt werden.  Die Versuche mit einer Kontaminationsdosis von 5 - 6 log10 auf der Schale führten stets zu höherer Keimzahlreduktion im Vergleich zu den Untersuchungen mit einer Kontami-nationsdosis von 2 - 4 log10, jedoch ließen sich vereinzelte Rest-Keime nur schwierig ent-fernen.  Eine 100 %ige Reduktion der Anzahl von S. Enteritidis ist bei einem Ausgangskeimgehalt von 5 - 6 log10 nicht zu erreichen.  Die Kombination von 1 % Ozonkonzentration (wt/wt O2) zusammen mit 120 min Einwirkzeit führt bei einem Ausgangskeimgehalt von 2 - 4 log10 hingegen zur völligen Inaktievierung von S. Enteritidis auf der Eioberfläche. Eine verminderte Schlupfrate, Legeleistung oder Unterschiede während der weiteren Entwicklung der Tiere sind unter diesen Gegebenheiten nicht zu erwarten.  Von einer möglichen Anwendung der Ozonierung bei Konsumeiern ist abzuraten, da die behandelten Eier sensorische Abweichungen aufwiesen, die beim Verbraucher auf Ablehnung stoßen würden. Ozon kann als Alternativverfahren zur Bruteidesinfektion in Betracht gezogen werden. Die im Labor-Maßstab getesteten Parameter (1 % Ozonkonzentration (wt/wt O2), 120 min Einwirkzeit und ~70 % relative Luftfeuchte) müssen in der großtechnischen Lösung gewährleistet werden, um eine 100 %ige Inaktivierung von S. Enteritidis garantieren zu können. Weiterführende Untersuchungen sind notwendig, um die Wirksamkeit von Ozon in einer praxistauglichen Begasungskammer zu bestätigen.

Unter Verwendung des Testkeimes S. enteritidis, 535 Wernigerode, Phagentyp 4 wurde die Bedeutung des Eiaufschlages für die Kontamination der Eimasse unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß bei einer mit Salmonellen behafteten Eischale das Risiko der Kontamination der Eimasse erheblich sein kann. Sowohl durch die eigenen Untersuchungen mit manuellem Eiaufschlag als auch durch die kritische Betrachtung des maschinellen Eiaufschlags in einem Eiprodukte-Werk wurde deutlich, daß sich in der Praxis ein Eintrag von feinsten Eischale-Partikeln in die Eimasse nicht verhindern läßt. Dabei stellt auch ein geringer Kontaminationsgrad der Eischale mit S. enteritidis ein erhebliches Risiko für die Übertragung in die Eimasse dar. Der Einschlag kotverschmutzter Eier begünstigt die Kontamination der Eimasse. / Using the test germ S. enteritidis, 535 Wernigerode, type of phage 4, the importance of slicing the egg open for the contamination of the egg substance was examined under different conditions. The results show that eggshell with salmonellae can bear a significant risk of contaminating the content of the egg. Both the research based on manual slicing of the eggs and the careful analysis of this process done by machines in a factory for egg-based products made clear that in reality it is impossible to prevent small shell particles from entering the content of the egg. Just a low contamination doses of the egg shell is a considerable risk for transportation of S. enteritidis into the egg content. The slicing of excrement polluted eggs favours the contamination of the egg content.

Dissertation (Ph.D.)--Auburn University, / Abstract. Vita. Includes bibliographic references (p.116-129).

Thesis (M.Sc.)(Microbiology)--University of Pretoria, 2005. / Includes summary. Title from opening screen (viewed March 20, 2006). Includes bibliographical references.