In dieser Masterthese werden Zwischenergebnisse einer dreijährigen Studie vorgestellt, die eine resektive mit einer regenerativen Methode zur Behandlung von Periimplantitis vergleicht. Derzeit liegen Daten über einen sechsmonatigen Beobachtungszeitraum für vier Patienten in der (resektiven) Kontrollgruppe und fünf in der (regenerativen) Testgruppe vor. Patienten beider Gruppen mit einer extensiven Parodontitisvorgeschichte präsentieren sich in der Regel mit größeren Sondierungstiefen. Größere Sondiertiefen zu Beginn der Behandlung zeigen eine Tendenz zu schlechteren Ergebnissen im Verlauf der Beobachtungsphase, wobei der kausale Zusammenhang dazu in einer ähnlichen Pathogenese der Parodontitis und des schlechten Periimplantitisbehandlungserfolges liegen kann, die durch dieselben Risikofaktoren beeinflusst wird (Mundhygiene, genetische Faktoren, Mundflora etc.). Die Wundabdeckung nach der Augmentation scheint eine noch bedeutendere Rolle für die Prognose zu spielen als die Parodontitisvorgeschichte. Wund- und Nahtdehiszenzen sind die häufigsten Komplikationen in der Testgruppe. Bei einem Patienten der Testgruppe entwickelte sich aufgrund einer Wunddehiszenz eine fulminante Infektion und Entzündung, die letztlich zum Verlust des Implantates führte. Sondiertiefen und PES der Testgruppe zeigen drei und sechs Monate nach der Behandlung eine deutliche Verbesserung, wobei der Unterschied in den durchschnittlichen Sondiertiefen zwischen Behandlungsbeginn und drei oder sechs Monate danach z. T. statistisch signifikant war. In der Kontrollgruppe veränderten sich dagegen die Sondiertiefen und der PES nach der Behandlung nicht. Insgesamt sind die Ergebnisse vielversprechend mit deutlichen Verbesserungen des BOP und der Sondiertiefe, jedoch ist der Erfolg der Augmentation von der Operationstechnik abhängig. Für die Beurteilung eines Langzeiterfolges ist es derzeit noch zu früh. / This master thesis presents intermediate results of a three-year study that compares a resective with a regenerative method for the treatment of peri-implantitis. Currently, data are available over a six-month observation period for four patients in the (resective) control group and five in the (regenerative) test group. Patients in both groups with an extensive history of peri-ondotitis present usually with larger probing depths. Larger probing depths at the beginning of treatment show a tendency to result in worse outcomes during the monitoring phase. The causal relationship of this could be a similar pathogenesis of both peri-odontitis and a unfavorable outcome of the peri-implantitis treatment, which is influenced by the same risk factors (oral hygiene, genetic factors, oral flora, etc.). The wound covering after augmentation seems to play an even greater role for the prognosis compared to a history of peri-ondotitis. Wound and suture dehiscence are the most common complication in the test group. In one patient of the test group, a fulminant infection and inflammation developed as a result of wound dehiscence that ultimately led to the loss of the implant. Probing depths and PES in the test group at three and six months after treatment showed a significant improvement compared to the baseline before the treatment. This difference in the average probing depths between baseline and three or six months thereafter was in part statistically significant. In the control group, however, the probing depths and the PES did not change after treatment. Overall, the results are promising with significant improvements in the BOP and the probing depth, but the success of the augmentation depends on the surgical technique. At this point it is still to early to assess long-term success.

Advanced Glycation Endproducts (AGEs) akkumulieren bei zunehmendem Alter. Die Haut ist das einzige Organ der durch ultraviolettes Licht ausgelösten Vitamin D Synthese. Die Akkumulation von AGEs in der Haut könnte die Synthese von Vitamin D stören, während Mikroinflammation und oxidativer Stress (beides mit Vitamin D-Mangel assoziiert), sowohl die toxischen Effekte der AGEs, als auch deren Bildung selbst verstärken könnten. Wir untersuchten zunächst potentielle Zusammenhänge zwischen zirkulierendem Vitamin D3, AGEs im Blut und AGEs in der Haut mit Markern für Inflammation und oxidativem Stress bei Nichtdiabetikern. In der vorliegenden Studie untersuchten wir 146 Probanden (119 gesunde Probanden und 27 Patienten mit arterieller Hypertonie; 73 Männer und 73 Frauen; durchschnittliches Alter 57.0 ± 15.5 Jahre). Mit Hilfe des AGE-Readers wurden die Advanced Glycation Endproducts in der Haut (SAF) gemessen. Außerdem wurde Vitamin D3, AGE-assoziierte Fluoreszenz (AGE-Fl) im Plasma, hoch-sensitives C-reaktives Protein (hs-CRP), Advanced Oxidation Protein Products (AOPPs) und die Nierenfunktion bestimmt. Außerdem wurden in einer Untergruppe von 61 Probanden N-Carboxymethyllysin (CML), der lösliche Rezeptor für AGEs (soluble RAGE) und das lösliche Vascular Adhesion Protein-1 (sVAP-1) bestimmt. Der durchschnittlich gemessene Vitamin D-Spiegel betrug 22.5 ± 8.9 ng/ml. Eine Vitamin D-Insuffizienz (20 – 29 ng/ml) lag bei 43% und ein manifester Vitamin D-Mangel bei 37% vor. Der altersabhängige Anstieg der Haut-AGEs war bei Rauchern und Patienten mit arterieller Hypertonie stärker ausgeprägt. Einen Zusammenhang zwischen der Hautfluoreszenz (SAF) und Vitamin D-Mangel fand sich nicht. Bei Rauchern konnte eine inverse Beziehung zwischen Vitamin D3 und Plasma AGE assoziierter Fluoreszenz sowie dem Soluble Vascular Adhesion Protein-1 nachgewiesen werden. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass bei Probanden mit nichtdiabetischer Stoffwechsellage ein Vitamin D-Mangel nicht zu einer vermehrten Toxizität und Akkumulation der Advanced Glycation Endproducts führt. Nur bei Rauchern wäre solch eine Wechselwirkung denkbar. Weil bei Diabetes mellitus die Akkumulation von Advanced Glycation Endproducts mit vermehrter kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität in Zusammenhang steht, fragten wir uns außerdem ob ein Vitamin D-Mangel mit vermehrter AGE-Bildung und Toxizität bei Diabetikern einhergeht. Hierzu untersuchten wir 276 Diabetiker (160 Männer und 116 Frauen; Alter 65 ± 13.4 Jahre; 43 Typ 1-Diabetiker, 233 Typ 2-Diabetiker) und 121 Nichtdiabetiker (60 Männer und 61 Frauen; Alter 58.6 ± 15.5 Jahre). Die gleichen Parameter wie zuvor wurden bestimmt. Diabetiker zeigten höhere Werte an SAF und AGE-Fl als die Kontrollen. SAF und AGE-Fl korrelierte mit Alter, Diabetesdauer und Einschränkung der Nierenfunktion. Bei den Typ 2-Diabetikern korrelierte der altersabhängige AGE-Anstieg direkt mit hs-CRP und sVAP-1. Die Vitamin D-Spiegel der Diabetiker und Nichtdiabetiker waren beide gleich erniedrigt und lagen im Durchschnitt bei 22.5 ng/ml. Eine Beziehung zwischen Vitamin D und den erhobenen Parametern fand sich außer mit sVAP-1 (bei den Diabetikern) nicht. Zusammenfassend scheint ein Vitamin D-Mangel bei Diabetikern nicht mit vermehrter AGE-Akkumulation und einem Anstieg der Marker für Mikroinflammation und oxidativem Stress, mit Ausnahme von sVAP-1, einherzugehen. / Advanced glycation endproducts (AGEs) accumulate during aging. Skin is the single organ of vitamin D synthesis, induced by ultraviolet B light. Accumulation of AGEs in the skin could interfere with synthesis of the vitamin, whereas the microinflammation and oxidative stress (associated with hypovitaminosis D) could amplify both the toxic effects of AGEs and their production. Clinical data on potential interactions between vitamin D3 deficiency and AGE accumulation are rare. Here we investigated potential associations between levels of circulating vitamin D3 and those of AGEs in blood and skin with regard to markers of inflammation and oxidative stress in nondiabetic subjects. In a cross-sectional study, 146 subjects (119 healthy persons and 27 hypertensive patients; 73 male and 73 female; mean age 57.0 ± 15.5 years) were included. Skin autofluorescence (SAF) and plasma levels of vitamin D3, AGE-associated fluorescence, high-sensitivity C-reactive protein level, and advanced oxidation protein products as well as renal function (estimated glomerular filtration rate) were determined. In a subgroup of 61 patients, N-carboxymethyllysine, soluble receptor of AGEs, and soluble vascular adhesion protein-1 were additionally analyzed. Vitamin D3 level averaged 22.5 ± 8.9 ng/mL. Prevalence of vitamin D insufficiency (20-29 ng/mL) was 43%, and that of deficiency (<20 ng/mL) 37%. The age-dependent rise in SAF was steeper in smokers and in subjects presenting arterial hypertension. No association between SAF and hypovitaminosis D was revealed. Among smokers, an inverse relationship manifested between vitamin D3 and plasma AGE-associated fluorescence as well as soluble vascular adhesion protein-1. Our data suggest that in nondiabetic adults, hypovitaminosis D does not enhance toxicity and accumulation of AGEs. Only in smokers interactions are conceivable. Because in diabetes accumulated advanced glycation end products (AGEs) are involved in the striking cardiovascular morbidity/mortality we also asked whether a hypovitaminosis D associates with an increased formation and toxicity of AGEs in diabetes. Methods. In 276 diabetics (160 M/116 F, mean age 65.0 ± 13.4; 43 type 1-DM and 233 type 2-DM) and 121 nondiabetic controls (60 M/61 F; mean age 58.6 ± 15.5 years) routine biochemistry, levels of 25-hydroxyvitamin D3 (25-(OH)D), skin autofluorescence (SAF), plasma AGE-associated fluorescence (AGE-FL), N-carboxymethyl)lysine (CML), soluble receptor for AGEs (sRAGE), soluble vascular adhesion protein-1 (sVAP-1), high sensitive C-reactive protein (hs-CRP), and renal function (eGFR) were determined. Results. In the diabetics SAF and AGE-Fl were higher than those of the controls and correlated with age, duration of diabetes, and degree of renal impairment. In T2DM patients but not in T1DM the age-dependent rise of SAF directly correlated with hs-CRP and sVAP-1. 25-(OH)D levels in diabetics and nondiabetics were lowered to a similar degree averaging 22.5 ng/mL. No relationship between 25-(OH)D and studied markers except for sVAP-1 was observed in the diabetics. Conclusion. In diabetics hypovitaminosis D does not augment accumulation of AGEs and studied markers of microinflammation and oxidative stress except for sVAP-1.

Thy-1 (CD90) ist ein Oberflächenrezeptor, der bereits 1963 entdeckt wurde. Bis heute ist seine Expression auf zahlreichen Zellen nachgewiesen, in welchen Thy-1 verschiedenste intrazelluläre Signalkaskaden beeinflusst und in seiner Funktionalität folglich große Diversität zeigt. Auch auf Fibroblasten wird Thy-1 konstitutiv exprimiert. Fibroblasten kommen ubiquitär im Körper vor, sind Hauptproduzenten der extrazellulären Matrix und von essentieller Bedeutung für die Gewebshomöstase. Darüber hinaus sind sie auch Modulatoren des Immunsystems. Thy-1 kann auf die verschiedenen Funktionen der Fibroblasten Einfluss nehmen. Dabei kann sich das Ergebnis der Interaktion von Thy-1 mit den Zellfunktionen, in Abhängigkeit der Lokalisation der Fibroblasten, unterscheiden. In Lungen- und dermalen Fibroblasten hemmt Thy-1 die Proliferation und Apoptose dieser Zellen und limitiert so fibrotische Prozesse. Des Weiteren hemmt Thy-1 die Differenzierung von Lungenfibroblasten und wirkt so der Lungenfibrose entgegen. In dermalen Fibroblasten hingegen unterstützt Thy-1 die Differenzierung der Zellen und scheint dadurch eine profibrotische Wirkung in der Pathogenese der Sklerodermie zu besitzen. Darüber hinaus ist nachgewiesen, dass Thy-1 die Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF-α in Lungenfibroblasten und murinen embryonalen Fibroblasten abschwächt und folglich eine antiinflammatorische Wirkung zeigt. Im Vergleich dazu zeigen Thy-1+ Synovialfibroblasten im Vergleich zu der Subpopulation ohne Expression von Thy-1 ein proinflammatorisches Expressionsprofil in einem Mausmodell der rheumatoiden Arthritis. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von Thy-1 auf die Genexpression von dermalen Fibroblasten im Hinblick auf immunmodulatorische und fibrotische Prozesse untersucht. Hierfür wurden Fibroblasten aus Wildtyp-Mäusen und Thy-1 defizienten KO-Mäusen isoliert und anschließend kultiviert. Es fand ein Vergleich der WT Fibroblasten mit den KO Fibroblasten stimuliert, wie auch unstimuliert statt. Stimuliert wurden die Zellen nach einer 24-stündigen Hungerperiode mit TNF-α und IL-1β. Der Vergleich wurde anhand von Daten eines Microarray und Ergebnissen aus quantitativen real-time PCRs vollzogen. Die Ergebnisse des Microarray zeigten eine Assoziation von Thy-1 mit der Expression von Genen, die im Zusammenhang mit inflammatorischen Prozessen und Autoimmunerkrankungen wie der Psoriasis, der rheumatoiden Arthritis und dem systemischen Lupus erythematodes stehen. Dabei bewirkt Thy-1 eine gesenkte Expression entsprechender Gene, was einen antiinflammatorischen Effekt von Thy-1 vermuten lässt. In den Ergebnissen aus dem Microarray und den PCRs zeigte sich bei Abwesenheit von Thy-1 eine erhöhte Expression der Chemokine CCL6, CCL7, CCL8 und CXCL9, der Zytokine IL-18 und IL-33, des Zytokinrezeptors IL-23R und des Proliferations-assoziierten Gens Grem1. Die Ergebnisse der Chemokine CCL6, CCL7, CCL8 und CXCL9 weisen darauf hin, dass Thy-1 die chemotaktische Wirkung dermaler Fibroblasten auf Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, natürlichen Killerzellen und T-Lymphozyten hemmt. Die Chemokine stehen dabei im Zusammenhang mit entzündlichen Prozessen der atopischen Dermatitis, der Psoriasis, der systemischen Sklerose und der rheumatoiden Arthritis, auf deren Pathogenese Thy-1 also einen suppressiven Effekt haben könnte. Dass die Expression von Thy-1 auf dermalen Fibroblasten einen immunmodulatorischen Effekt besitzt, unterstützen auch die Ergebnisse für IL-18, IL-33 und IL-23R. IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin, das eine Entzündungreaktion in Fibroblasten hervorrufen kann. IL-33 ist ein Aktivator der Mastzellen, T-Zellen, basophilen und eosinophilen Granulozyten. Seine Wirkung auf entsprechende Immunzellen ist Teil der Pathogenese der atopischen Dermatitis. IL-23R und sein Bindungspartner IL-23 sind assoziiert mit der rheumatoiden Arthritis und führen zu einer gesteigerten Expression von IL-8, welches wiederum die Migration neutrophiler Granulozyten stimuliert. Da Thy-1 die Expression dieser Gene senkt, lässt sich auch hier eine antiinflammtorische Wirkung vermuten. Darüber hinaus offenbarten die Ergebnisse aus Microarray und PCRs eine gehemmte Expression von Grem1 in Anwesenheit von Thy-1. Für Grem1, sowie IL18 und IL-33 sind Proliferations-unterstützende Wirkungen auf Fibroblasten nachgewiesen. Es ist bereits gezeigt worden, dass Fibroblastenkulturen mit Expression von Thy-1 ein niedrigeres Wachstum zeigen. Die Thy-1-vermittelte Hemmung der Genexpression besagter Gene könnte die antiproliferative Wirkung auf dermale Fibroblasten erklären. Auch ein Zusammenhang zwischen Thy-1 und fibrotischen Prozessen ist zu diskutieren. Für die Gene CCL7, Grem1 und IL-33 ist eine profibrotische Wirkung in der Pathogenese der systemischen Sklerose nachgewiesen. Ebenso stehen CCL6, CCL8 und IL-18 in Zusammenhang mit einer Fibrose-fördernden Wirkung. Da Thy-1 die Expression dieser Gene senkt, ist ein antifibrotischer Effekt denkbar. Es existieren allerdings auch Untersuchungen, die für eine Fibrose-fördernde Wirkung von Thy-1 im Kontext der systemischen Sklerose sprechen. Die genaue Rolle von Thy-1 in Bezug zur Fibrose bleibt folglich unklar. Weiterführend sollten die Ergebnisse der Genexpression aus PCRs und Microarray auch auf Proteinebene untersucht, sowie mögliche intrazelluläre Signalwege über die Thy-1 seine Wirkung entfaltet, exploriert werden. Um die genaue Funktion von Thy-1 in fibrotischen Prozessen der Haut zu ergründen, wäre ein Mausmodell mit Bleomycin-induzierter kutaner Fibrose möglich. Zusammenfassend kann aus den Ergebnissen abgleitet werden, dass die Expression von Thy-1 auf dermalen Fibroblasten in eine antiinflammatorische, die Chemotaxis von Immunzellen hemmende, sowie antiproliferative und antifibrotische Wirkung resultiert. Der Zusammenhang von Thy-1 mit Hauterkrankungen wie der systemischen Sklerose und weiterer Erkrankungen, die auf Autoimmunprozessen beruhen, machen den Zellrezeptor weiterhin zu einem interessanten Forschungsobjekt.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Aufbau und Funktion der Haut 1.1.1 Epidermis 1.1.2 Dermis und Subcutis 1.2 Vorkommen und Funktion von Fibroblasten 1.3 Thy-1 1.3.1 Das Thy-1 Gen 1.3.2 Das Thy-1 Protein 1.3.3 Lösliches Thy-1 1.3.4 Durch Thy-1 vermittelte Signalwege 1.3.5 Expression von Thy-1 1.3.6 Funktion von Thy-1 auf Fibroblasten 2. Aufgabenstellung 3. Material 3.1 Geräte und Hilfsmittel 3.2 Verbrauchsmaterialien 3.3 Chemikalien und Antibiotika 3.4 Zusammensetzung von Puffern und Medien 3.5 Murine Fibroblasten 3.6 Primer 3.7 Kits 3.8 Software 4. Methoden 4.1 Zellbiologische Methoden 4.1.1 Arbeit mit der Zellkultur 4.1.2 Isolation dermaler Fibroblasten aus Mäusen 4.1.3 Bestimmung der Zellzahl 4.1.4 Stimulation der Zellen 4.2 Molekularbiologische Methoden 4.2.1 RNA-Isolation 4.2.2 Reverse Transkription 4.2.3 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 4.2.4 Herstellung der Standard-Plasmide für die qRT-PCR 4.2.5 Genexpressionsanalyse durch mRNA-Microarray 4.3 Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1 Funktionelle Rolle von Thy-1 für die Immunreaktion 5.1.1 Einfluss von Thy-1 auf die Expression von ausgewählten Chemokinen und MMP-13 in dF 5.1.2 Auswirkungen von Thy-1 auf die Expression von IL-6 in dF 5.2 Analyse der Genexpression 5.3 Einfluss von Thy-1 auf Proliferations-assoziierte Gene 6. Diskussion 6.1 Die Bedeutung von Thy-1 für die Modulation der Genexpression inflammatorischer, und immunregulatorischer Gene 6.1.1 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle der Expression von Chemokinen 6.1.2 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle der IL-6 Expression 6.1.3 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle der MMP-13 Expression 6.1.4 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle von immunregulatorischen Mediatoren 6.2 Einfluss von Thy-1 auf die Proliferation von dF 6.3 Mögliche Auswirkungen von Thy-1 auf Erkrankungen der Haut 7. Zusammenfassung Literaturverzeichnis Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Danksagung

Die Adipositasepidemie hat sich in den letzten Jahrzehnten, vor allem in westlichen Ländern, weiter ausgebreitet. Eine chronische Fettgewebeentzündung stellt eine pathophysiologische Schnittstelle von Übergewicht mit den zahlreichen adipositasassoziierten Krankheiten dar. Diese Entzündung ist zwar bereits ausführlich beschrieben, ihr genauer Auslöser allerdings ungeklärt. Das gehäufte Auftreten von crown-like structures (CLS, kronenartige Strukturen) gilt als guter Indikator für eine Fettgewebeentzündung. Diese Strukturen zu untersuchen, gestaltet sich aber, mangels Methoden zur Induktion von CLS, schwierig. In dieser Arbeit verwendeten wir eine transgene Mauslinie, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Makrophagen und über die Cre-ERT2 induzierbar das rot fluoreszierende tdTomato in Adipozyten exprimiert. Zunächst nutzten wir dieses Modell, um die Induzierbarkeit über Tamoxifen (TAM)-Applikation in unserem Organkultursystem von intaktem Fettgewebe zu verifizieren. Drei Tage nach einmaliger Zugabe von TAM ins Kulturmedium exprimierten nahezu alle Adipozyten tdTomato. Die in anderen Arbeiten beschriebene, fast vollständige Induzierbarkeit bleibt also in unserem Organkulturmodell erhalten. Auffällig war allerdings, dass vereinzelt Adipozyten bereits vor der Zugabe von TAM tdTomato exprimierten. Weitere Untersuchungen enthüllten verschieden Faktoren, die die spontane Rekombination in vivo beeinflussen. Weibliche Mäuse wiesen mehr tdTomato exprimierende Adipozyten auf als männliche und homozygote deutlich mehr als heterozygote Tiere. Exprimierten in heterozygoten Männchen ca. 9 % der Adipozyten tdTomato ohne TAM-Applikation, waren es 70% in homozygoten Weibchen. Außerdem stieg der Anteil tdTomato exprimierender Adipozyten mit dem Alter der Mäuse an. Diese nicht induzierte Rekombinaseaktivität kann zu einem hohen Hintergrundsignal in Kontrollgruppen führen und vermindert die TAM-vermittelte Induzierbarkeit vor allem in homozygoten Tieren deutlich. Bei Verwendung von induzierbaren Cre-Rekombinasen ist es daher wichtig, zunächst an Kontrolltieren mit passendem Alter, Geschlecht und Genotyp auf nicht induzierte Rekombinaseaktivität zu testen. Ziel dieser Arbeit war es, das erste Modell zu entwickeln, um gezielt die Formation von CLS in intaktem Fettgewebe zu induzieren. Die Hypothese dafür war, dass die Bildung von CLS kein Artefakt der Fettgewebeentzündung ist, sondern der natürliche Abbaumechanismus von toten Adipozyten, die zu groß für klassische Phagozytose sind. Aus diesem Grund kultivierten wir Fettgewebe von dünnen Mäusen und nutzten die Laser eines Konfokalmikroskops um Adipozyten gezielt zu depletieren. Der verwendete lichtmikroskopische Ansatz erlaubte anschließend, die Makrophagenbewegung in Echtzeit zu dokumentieren. Zwölf Stunden nach induziertem Adipozytentod kam es bereits zur Migration von Makrophagen zur Stelle des Laserschadens. Ab 24 Stunden nach Adipozytentod bildeten diese Makrophagen CLS. Die Präzision des verwendeten Laserschadens erlaubt hierbei die gezielte Depletion einzelner Adipozyten ohne größeren Gewebeschaden, um die Bildung von CLS zu induzieren. Die so induzierten CLS untersuchten wir mittels post hoc Immunfluoreszenzfärbungen auf die Expression verschiedener Marker. Makrophagen in CLS exprimierten die proinflammatorischen Marker CD11c, CD86 und CD9, während die im Gewebe verteilten Makrophagen die antiinflammatorischen Marker CD301 und CD206 exprimierten. Diese Ergebnisse verifizierten wir mit Färbungen von in vivo gebildeten CLS im Fettgewebe dünner Mäuse und beobachteten hier eine vergleichbare Expression der pro- und antiinflammatorischen Marker. Des Weiteren analysierten wir die Art des durch den Laserschaden induzierten Adipozytentods genauer. Die Membran der bestrahlten Adipozyten war gut mit Annevin V anfärbbar, was auf die Externalisierung von membranständigem Phosphatidylserin schließen lässt, während die Kerne keine DAPI-Färbung aufwiesen. Die Phosphatidylserinexternalisierung bei Erhalt der Membranintegrität ist bei apoptotischem Zelltod, in der Regel aber nicht bei nekrotischem Zelltod, zu beobachten. Die induzierte CLS-Bildung scheint also eine Reaktion auf apoptotischen Adipozytentod zu sein. Ein klassisches Modell unterscheidet zwischen proinflammatorischen (M1) und antiinflammatorischen (M2) Makrophagen. Mit fortschreitender Fettgewebeentzündung steigt der Anteil der M1-Makrophagen immer weiter an. Für diesen Anstieg wurden sowohl die Rekrutierung von Blutmonozyten, als auch ein „phenotpical switch“ von residenten Makrophagen postuliert. Da Makrophagen in unseren induzierten CLS die entsprechenden M1-Marker exprimieren und residente Makrophagen außerhalb von CLS stattdessen M2-Marker, liefert unser Modell erstmals direkte Nachweise für den „phenotypical switch“ von Makrophagen in CLS. Die Rekrutierung dagegen ist in unserem ex vivo Organkulturmodell ausgeschlossen. Um sicherzustellen, dass auch CLS in vivo durch residente Makrophagen gebildeten werden, analysierten wir das Fettgewebe von Wildtypmäusen, die sich einen Blutkreislauf mit GFP exprimierenden Parabiosepartnern teilten. So konnten wir zeigen, dass die Makrophagenpopulation im Fettgewebe zwar teilweise durch Monozytenrekrutierung erhalten wird, CLS jedoch nicht verstärkt durch rekrutierte Makrophagen gebildet werden. Auch freie Fettsäuren gelten allgemein als proinflammatorisch. Weder Stimulierung mit Palmitat noch Kontakt zu bei der Kultivierung entstehenden kleineren Fetttröpfen führte in unseren Experimenten zu einer vergleichbaren Änderung des Phänotyps der Makrophagen wie nach Adipozytentod in unserem Modell. Der beobachtete „phenotypical switch“ scheint also direkt mit der Bildung von CLS zusammenzuhängen. Im Fettgewebe von Mäusen, die eine hochkalorische Diät erhielten, konnten wir eine CLS-Bildung mit einem vergleichbaren zeitlichen Ablauf und vergleichbarer Häufigkeit induzieren. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass CLS der biologische Abbauweg für tote Adipozyten sind und kein Entzündungsartefakt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich CD11c gut als Marker eignet, um Makrophagen in induzierten CLS von interstitiellen Makrophagen zu unterscheiden. Dieses Ergebnis nutzten wir, um die Makrophagen zu sortieren und mittels RNA-Sequenzierung den Phänotyp der CLS- bildenden Makrophagen über die verwendeten Marker hinaus zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression vieler weiterer M1-Markerproteine in CD11c positiven Makrophagen, während M2-Gene vermindert exprimiert wurden. Außerdem zeigten die Makrophagen in CLS eine erhöhte Expression von Genen, wie sie laut Literatur durch metabolische Aktivierung (Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose) induziert wurde, sowie eine erhöhte Expression verschiedener Gene des Lipidmetabolismus. Zusätzlich zeigten sich Veränderungen in der Expression einiger Chemokine oder ihrer Rezeptoren, was ein Hinweis auf einen gezielten Mechanismus zur Rekrutierung von Makrophagen zur CLS-Bildung sein könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Adipozytentod die CLS-Bildung in gesundem Fettgewebe ohne Dysfunktion induziert. Damit einher geht der „phenotypical switch“ der Makrophagen in diesen CLS zu einem metabolisch aktivierten Phänotyp. Dieser Phänotyp ist assoziiert mit erhöhter Exozytose von lysosomalen Proteinen und beschleunigtem Lipidstoffwechsel zum Verdau des toten Adipozyten. Andere Gruppen konnten außerdem zeigen, dass metabolisch aktivierte Makrophagen verstärkt proinflammatorische Zytokine, wie TGFβ, TNFα und IL-1β, sezernieren. Der langsame Abbau von Adipozyten in CLS führt also zur Aktivierung von Signalwegen in Makrophagen, wie sie auch bei ineffektiver Phagozytose und sekundärer Nekrose anderer Zellarten zu beobachten ist. Gehemmte Phagozytose führt in anderen Geweben zu einer chronischen Entzündung, vergleichbar mit der adipositasassoziierten Entzündung in dysfunktionalem Fettgewebe. In dieser Arbeit konnten wir weiterhin zeigen, dass Alter, Genotyp und Geschlecht einen großen Einfluss auf die nicht induzierte Aktivität der untersuchten Cre-Rekombinase haben. Außerdem haben wir ein Modell etabliert, um gezielt CLS-Bildung zu induzieren. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir zeigen, dass Adipozytentod auch im Fettgewebe von dünnen Mäusen ohne zu Grunde liegende Fettgewebeentzündung zu CLS-Bildung führt. Makrophagen in CLS weisen zudem einen anderen Phänotyp auf als im Gewebe verteilte Makrophagen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Adipozytentod im Fettgewebe dünner Mäuse lokal einen proinflammatorischen, metabolisch aktivierten Phänotyp induziert, wie er im Fettgewebe von Mäusen nach einer hochkalorischen Diät oder nach Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose beobachtet werden konnte. Diese Arbeit liefert damit Hinweise, dass vermehrter Adipozytentod und durch Fettzellhypertrophie länger bestehende CLS die treibenden Kräfte hinter der chronischen Fettgewebeentzündung sind, die verantwortlich für die diversen, mit Übergewicht vergesellschafteten Krankheiten ist.:1 Einführung 1.1 Fettgewebe 1.2 Adipositas und adipositasassoziierte Krankheiten 1.3 Die Fettgewebeentzündung 1.4 Funktionen von Makrophagen 1.5 Fettgewebemakrophagen 1.6 Crown-like structures 1.7 Efferozytose apoptotischer und nekrotischer Zellen 1.8 Das Cre-loxP-System 1.9 Zielsetzung 2 Publikationen 2.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 2.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Darstellung des eigenen Beitrags des Promovierenden zu den Publikationen 5.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 5.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7 Publikationen im Rahmen der Promotion 8 Danksagung

Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden. / The simultaneous occurrence of ischemic stroke and Takotsubo syndrome (TTS) seems to be a relevant clinical constellation that is not yet sufficiently understood. The pathologies can be understood as being linked via the brain-heart axis, into which the blood-brain barrier (BBB) is integrated as a functional component. The clinical and neurological outcome of these patients appears to be significantly worse than after a solitary ischemic insult. It has been hypothesized that the BBB may be compromised. The predominantly female, postmenopausal patients presented elevated catecholamine levels and inflammatory markers. These conditions were simulated in vitro under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition. Resulting alterations were examined by using an established BBB model: cEND cells of the murine cerebral microcirculation. The BBB integrity was evaluated by investigating specific junction proteins and integrin subunits. All experiments were conducted parallel with estrogen application (E2) in order to investigate a possible BBB protection by the female sexhormone. The separate application of catecholamines (CAT) or inflammatory mediators (INF) led to less BBB damage compared to simultaneous application. This appeared to be time-bound being proportional to the duration of exposure. The effects of OGD and reoxygenation, in the sense of simulated reperfusion therapy, were potentiated by the effects of CAT/INF. Predominantly, OGD and KAT/INF compromised BBB integrity. “Recovery” or “reperfusion injury” occurred after reoxygenation. Protection by E2 was morphologically detectable, especially against OGD, CAT/INF and “reperfusion injury”. This could not be shown at the level of gene or protein expression, respectively. The homeostasis of the CNS would be impaired in vivo, catecholamines and inflammatory mediators would be able to reach the neuronal tissue that had already been damaged by ischemia. Overall, this work contributes to an understanding of the molecular changes in the BBB in the context of the simultaneous occurrence of TTS and ischemia. An experimental basis was created to enable further research into pathogenetic background. Based on this, clinical therapies could be optimized after further in vitro and in vivo research.

Cancer immunotherapy has revolutionized the treatment of tumor patients. However, only a limited number of patients developed a long-term response. Therefore, the identification of biomarkers is urgently required for the effective stratification of patients with solid and hematopoietic tumors, in order to select the most suitable therapy for the patient. These biomarkers can be single molecules, like RNAs, proteins or proteoglycans and frequently are direct mediators or a result of changes in the tumor microenvironment (TME). These include miRNAs, small non coding RNAs (20-24nt), which have a multivalent role and involved in the post transcriptionally control of multiple immune relevant targets thereby contributing to immune escape and tumor progression. Various miRNAs have been found to be deregulated in malignant lesions and might serve as diagnostic, prognostic and predictive biomarkers. Due to the large number of these small RNAs, which could regulate the expression of various molecules, their analysis is a challenge. Therefore, the aim with this PhD thesis is to identify novel biomarkers based on their functional role in immune responses utilizing immune modulatory miRNAs in melanoma and myelodysplastic syndromes (MDS). Relevant miRNAs were identified based on their ability to bind on the target checkpoint molecules of interest (PD-L1, CTLA-4) through the miTRAP method. The ability of these miRNAs to downregulate their target molecules was validated through flow cytometry and changes in the molecules’ function in vitro were assessed. Selected targets were quantified by qPCR and their relation to clinicopathological characteristics and the composition of the tumor immune cell infiltrate of melanoma patients were determined. In silico analysis was utilized for the identification of deregulated miRNAs involved in common pathways of MDS. MiRNAs targeting the NF-kB pathway components TLR4, MYD88, IRAK1, TRAF6 and NFκB1 were quantified in formalin-fixed, paraffin-embedded bone marrow biopsies (BMBs) of healthy controls and MDS patients. The expression levels of the TLR4 ligand, biglycan, were evaluated in MDS/AML cell lines and BMBs, while changes in the BM immune infiltrate were analysed via multi-spectral imaging. Inflammasome components were evaluated in vitro by Western blot analysis and validated in biopsies of MDS patients via multi-spectral imaging. The BGN-mediated pyroptosis was inhibited by drugs or CRISPR/Cas9 knock-out and changes in morphology and the cell population composition determined by flow cytometry and microscopy. Six (6) PD-L1 and seven (7) CTLA-4 specific miRNAs were identified capable of downregulating their respective target molecules, while dual reporter assay confirmed their binding to the 3’ UTR of their targets. Downregulation mediated by the selected miRNAs was sufficient to increase cytotoxicity (PD-L1) and reduce the trogocytotic potential (CTLA-4) of transfected cells. The PD-L1 miRNA signature was capable of predicting melanoma patients’ relapse when combined with CD8+ T cell infiltration and PD-L1 expression, while the CTLA-4 miRNA expression correlated with changes in the CD4+ T cell subset in melanoma patients before and after treatment with anti-CTLA-4 antibodies. The expression of 8 inflammation related miRNAs showed a differential expression pattern between healthy donors and MDS/sAML patients, while the generation of the infla-miR signature increased its diagnostic and prognostic potential. BGN was identified as a mediator of inflammation in MDS along with the miRNAs, showing BGN-mediated pyroptosis in the in vitro model used and in the BMBs. Recombinant BGN was capable of disrupting hematopoiesis in vitro, while the effect could be reversed by inhibitors of the inflammasome pathway and antibodies. Knockdown of BGN in MDS cells induced myeloid differentiation, while patients with high levels of BGN in their bone marrow were deemed detrimental for MDS patients. Identification of immune modulatory miRNAs can allow us to effectively stratify patients, when analysed in parallel with immune infiltration and could be an intervention tool to restore dysregulated pathways in the context of cancer. Moreover, changes in the regulation of miRNAs can indicate systematic changes in the tumor microenvironment and direct us towards the identification of novel biomarkers. All in all, miRNAs are an important tool providing crucial information about the disease and can potentially support the development of new therapeutic means.

Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab. / Since the detection of glutathione peroxidase-2 (GPx2) it was assumed that reducing hydroperoxides is the only function of this enzyme in the crypt ground of the colon. But further studies showed that GPx2 is also highly expressed in tumor tissue. However, it is not known whether it acts a pro- or anticarcinogenic manner at this site. In vitro and in vivo experiments elucidate antiinflammatory features of GPx2, based on these findings additional functions of GPx2 are discussed. In this dissertation the physiological function of GPx2 was investigated. For this purpose in wild type and GPx2-knockout mice, changes of enzyme expression and colon morphology were analyzed. The mice were fed three diets containing different selenium concentrations: selenium deficient, selenium adequate and selenium supplemented. Under physiological conditions the mitosis rate is highest in the proliferating zone in the crypt ground of the colon. The majority of apoptotic cells are located at the tip of the crypt. The knockout of GPx2 significantly increased the rate of apoptosis in the crypt ground. The greatest effect was documented on the selenium deficient diet. Here, changes of the colonic morphology were detectable, because the shift of the proliferating zone towards the tip of the crypt lead to an extension of the crypts. In the wild type mice no apoptotic cells were detected on the crypt ground. Under physiological conditions GPx1, in contrast to GPx2, is mainly expressed on the top of the crypt, and this enzyme is no longer detectable under selenium deficiency. The knockout of GPx2 increased the expression of GPx1 in the crypt ground of the colon on all three selenium diets. It is likely that this over expression of GPx1 compensates for the loss of GPx2. However the massive apoptotic rate in the crypt ground shows that GPx1 can not compensate the complete function of GPx2. These results elucidate that GPx2 not only functions as a hydroperoxide reducer, but that it is also important for the maintenance of the stem cell character and the homeostasis of cells. The question if GPx2 influences the inflammation triggered by the coloncarcinogenic process was next assessed in this dissertation. Therefore the AOM/DSS model was used to trigger the carcinogenic process through inflammation. The amount of aberrant crypt foci (ACF) and tumors in the colon were analyzed in both wild type and GPx2-knockout mice. However initially the inflammation status was compared between the two genotypes. The inflammation of the colon was stronger in the GPx2-knockout mice than in wild type. These results support the postulated antiinflammatory features of GPx2. The loss of GPx2 may influence the inflammation process by decelerating the regeneration of the tissue caused by the increased apoptotic rate in the proliferating zone. Additionally, the GPx2-knockout mice developed more tumors in the colon. Therefore the inflammation of the colon correlated with the development of tumors. The loss of GPx2 may have enhanced both tumor initiation and progression. But the expression of GPx2 also stimulated the growth of tumors. These results indicate that an adequate GPx2-expression can protect from colonic inflammation, and therefore decrease the risk of developing colon cancer. Whether GPx2 acts in a pro- or anticarcinogenic manner appears to depend on the state of the carcinogenic process.

Ziel der Arbeit war es, zu untersuchen, ob parodontalpathogene Mikroorganismen im Myokard des Herzens nachweisbar sind. Dabei wurde die Wechselwirkung der Toxine (Lipopolysaccharide) am myokardialen Gewebe erfasst und auf diese Weise mögliche Entzündungsreaktionen in den Myokardzellen untersucht. Material und Methoden: 30 Patienten (20 Männer, 10 Frauen) mit Aortenklappenstenosen bzw. -insuffizienzen wurden zahnärztlich auf den aktuellen Zahnstatus und Parodontalstatus untersucht. Gingivale Erkrankungen wurden mit Hilfe des PBI erhoben. Anhand der Sondierungstiefen und des klinischen Attachmentlevels erfolgte die Einteilung in keine/ milde Parodontitis, moderate Parodontitis und schwere Parodontitis. Das Herzgewebe wurde mittels Gewebeschnitten von Ventrikel, Atrium und Klappe histologisch aufbereitet und mittels Lichtmikroskop über eine Kamera aufgezeichnet. Für einen Probanden ergaben sich pro Gewebeschnitt und pro Färbung 12 Aufnahmen. Insgesamt ergaben sich nach allen Färbungen aller Gewebeschnitte für einen Patienten 84 Bilder. Es wurde ein Inflammationsscore (0-3) erhoben für die Bewertung der H.E.-Färbung. Parameter für die immunhistochemischen Färbungen wurden durchgeführt für CD68/ Makrophagen und CD14/ LPS- Bindungsprotein-Rezeptor. Diese dienten dem Nachweis von möglichen Wechselwirkungen zwischen Parodontalpathogenen und myokardialen Geweben. Es erfolgte die direkte Zählung der Makrophagen pro Mikroskopie-Gesichtsfeld. Ergebnisse: Bei zahnärztlicher Untersuchung wurde festgestellt, dass 22 Probanden eine leichte oder keine gingivale Erkrankung hatten (Gruppe PBI 1) und 8 Patienten eine fortgeschrittene gingivale Erkrankung vorwiesen (Gruppe PBI 2). An einer schweren parodontalen Erkrankung litten 23 Patienten (Gruppe Parodontitis 2) und nur 7 Patienten wiesen ein moderate, milde oder keine Parodontitis auf (Gruppe Parodontitis 1). Die Ergebnisse der histologischen Untersuchungen der H.E.-Färbung zeigten, dass im Median im Atrium und Ventrikel der Score 2 dominiert. Desweiteren konnten für CD68 und CD14 signifikante Mittelwertunterschiede zwischen der Gruppe Parodontitis 1 und 2 gezeigt werden. Für die Gruppe PBI 1 und 2 konnte weder für den Parameter CD68 noch für CD14 das Signifikanzniveau erreicht werden. Schlussfolgerung: Die histologischen Färbemethoden lassen die Tendenz erahnen, dass höhere Scores und Mittelwerte mit höheren Entzündungsgraden und Destruktionen in Zusammenhang stehen. Gesündere parodontale Verhältnisse sind mit niedrigeren Scores und Mittelwerten verbunden. Zwischen den Gruppen PBI 1 und 2 lag kein statistisch nachweisbarer Unterschied vor. Anders ergab es sich in den Gruppen Parodontitis 1 und 2. Für CD68 (Monozyten/Makrophagen) lag die Signifikanz bei 3% und für CD14 (LPS-Bindungsprotein-Rezeptor) bei 0,8% zwischen den Parodontitis Gruppen. Die entzündlich bedingte Genese von Parodontitis und Herzinsuffizienz lässt schlussfolgern, dass die Parodontitis als Ursache nicht auszuschließen war. Durch die multifaktorielle Entwicklung beider Leiden lässt sich mittels vorliegender Untersuchung kein eindeutiger Kausalzusammenhang nachweisen. Die genauen, noch ungeklärten Assoziationen sollten in weiterführenden Studien erforscht werden.

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Fragestellung: Um die Auswirkungen von genetischen Varianten für CASP1 in vivo analysieren zu können, sollte in dieser Arbeit ein Tiermodell generiert werden. Dadurch könnten die zugrundeliegenden Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten in einem gesamten Organismus aufgeklärt werden, da die Untersuchung von Patientenmaterial nur sehr eingeschränkt möglich ist. Ein Mausmodell stellt eine der besten Alternativen zur Analyse von Primärmaterial dar, da die Immunsysteme von Maus und Mensch sehr ähnlich sind. Ergebnisse: Um die natürliche Expression und Regulation der Procaspase-1 im Mausmodell zu gewährleisten, wurde für die Generierung ein BAC-Transgen verwendet. Mittels homologer Rekombination wurde die künstliche Variante C284A von Casp1 inseriert. Diese führt zu einer Zerstörung des enzymatischen Zentrums der Caspase-1 und zum vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität. Nach zwei Pronukleusinjektionen konnten lediglich drei Gründertiere mit mosaikartiger Expression des zufällig im Genom integrierten Transgens Casp1C284A und in der F1-Generation nur ein Tier mit stabil integriertem Transgen identifiziert werden. Die Nachkommen dieses transgenen Tieres zeigten keine basale Expression von Casp1C284A, jedoch konnte nach Stimulation von BMDCs mit LPS in vitro die Expression sowohl auf RNA- wie auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Ebenfalls eine erhöhte Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 wurde in den Zellen der transgenen Tiere detektiert. Gleichfalls konnte nach Stimulation mit LPS in vivo eine gesteigerte Entzündungsreaktion in den Tieren mit Casp1C284A gezeigt werden, da ein stärkerer und länger anhaltender Abfall der peripheren Körpertemperatur und außerdem eine gesteigerte Sekretion von TNF-α und IL-6 zu verzeichnen war. Eine gesteigerte Inflammation des fetalen Gewebes, ausgelöst durch die integrierte künstliche Variante der Procaspase-1, könnte die Frage nach der geringen Anzahl der generierten Gründertiere beantworten. Hierfür wurde weiterführend eine Maus mit einem konditionalen Casp1C284A-Konstrukts generiert, welches zusätzlich eine zeit- als auch zelltyp-spezifische Expression der Procaspase-1 mit zentraler Mutation ermöglicht. Nach erfolgreichem Screening der ES-Zellen konnten diese in Blastozysten mikroinjiziert und Chimäre identifiziert werden. Eine embryonale Letalität des transgenen Konstrukts konnte durch die Verpaarung der ki-Tiere R26_Casp1C284A mit PGK-Cre-Tieren, die Cre-Rekombinase ubiquitär exprimieren, nahezu ausgeschlossen werden, da die Nachkommen alle lebensfähig waren und eine basale Expression des „knock-ins“ in mehreren Organen und auch in BMDCs nachgewiesen wurde. Ferner konnte nach Induktion einer Inflammation in vivo mit einer subletalen Dosis von LPS ein gesteigerter und länger anhaltender peripherer Temperaturabfall in den ki-Tieren ähnlich zu den transgenen Tieren detektiert werden. Desgleichen wurde eine Tendenz zu einer gesteigerten Sekretion der Zytokine TNF-α und IL-6 verzeichnet. Schlussfolgerungen: Mit dem transgenen Casp1C284A-Mausmodell als auch mit dem konditionalen R26_Casp1C284A-Modell konnte gezeigt weren, dass eine inaktive Variante der Procaspase-1 zur Entstehung einer gesteigerten Inflammation in einem gesamten Organismus führen kann. Somit können die im Rahmen dieser Arbeit generierten Tiermodelle zur Analyse der Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten herangezogen werden. In künftigen Studien kann ferner geklärt werden, ob die Entzündungsreaktionen durch eine verstärkte Interaktion von Casp1C284A mit der Kinase RIP2 verursacht werden und dadurch ähnlich wie im Patienten eine Aktivierung des proinflammatorischen Moleküls NFκB ausgelöst wird. Im Anschluss könnte eine spezifische Inhibierung des RIP2-Signalweges in diesen Mausmodellen getestet werden und schließlich im Patienten Anwendung finden. Die in dieser Arbeit generierten Mausmodelle könnten somit zur Erprobung zukünftiger therapeutischer Konzepte dienen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. Tabellenverzeichnis / Problem: In order to recapitulate the effects of the CASP1 variants found in the patients a mouse model should be generated. The analysis of material from the patients unfortunately is very restricted and therefore the generation of a mouse model represents the best alternative to see if the in vitro hypothesis of the IFG group really applies to an in vivo situation. Results: To generate a transgenic mouse model the artificial variant Casp1C284A was inserted into a BAC to enable a natural expression and regulation of Casp1C284A. This mutation results in a disruption of the active centre and to a complete loss of the enzymatical activity of caspase-1. After two pronuclei injections we received 180 pubs of TG mice. Only three of them harboured transgenic sequences and only one animal in the F1 generation harboured the complete Casp1C284A sequence. Expression analyses of the offspring of this mouse revealed no basal transcriptional expression of the transgene. Hence, protein expression could not be detected in unstimulated cells. However, stimulation with LPS upregulated transcription and low-level translation of Casp1C284A in BMDCs and an elevated secretion of the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 was detected as well. Likewise, after in vivo stimulation of transgenic mice with LPS i.p. the drop of body temperature was significantly enhanced in comparison to the control mice. And also the level of the proinflammatory cytokines was increased. Furthermore, a conditional R26_Casp1C284A construct allowing a temporal or a celltype specific expression of the caspase-1 with the central mutation was generated. Positive screened ES cell clones were injected into blastocysts and thereafter chimera could be identified. An embryonic lethality due to the integration of the enzymatically inactive caspase-1 could be excluded by the crossing with ubiquitious expressing PGK-Cre mice. All the corresponding mice were alive and a basal transcriptional as well translational expression was demonstrated. Concordantly with the results of the transgenic mice the conditional R26_Casp1C284A mice showed an enhanced drop of the body temperature in comparison to control mice after stimulation with sublethal dose of LPS in vivo. Likewise, a trend to an elevated secretion of TNF-α and IL-6 was observed. Conclusion: With the generated transgenic Casp1C284A as well as the conditional R26_Casp1C284A animal models we showed that an inactive variant of the procaspase-1 could result in a proinflammatory cytokine response and a development of an increased inflammation of a whole organism. Thus, these data support the previous postulated model of the IFG group for proinflammatory effects induced by variants of procaspase-1 with reduced enzymatic activity. Hence, the mouse models established in this work are suited for further analysis of the pathomechanism in the patients with ICE fever. For instance the cellular mechanism could be examined if the inflammation is provoked by an increased interaction of the mutated procaspase-1 with the kinase RIP2 and therefore the NFκB activation is increased, respectively. Also a further medicinal inhibition of the RIP2 signaling or other therapeutic testings in this mouse models are conceivable.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. Tabellenverzeichnis