TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte. / In this dissertation, membrane bound TNF and its receptor selective muteins are shown to induce gene expression and to selectively bind to TNFR1 and TNFR2. Furthermore, in GST-Fishing experiments membrane bound TNF induced signal transduction leading to NFkB and apoptosis induction was further investigated. Two existing different models of TNFalpha induced apoptosis in the literature were compared, the model of two sequential signaling complexes and the model of compartmentalisation. In this dissertation, it was shown that the model of two sequential signaling complexes is more likely to be able to explain membrane bound TNF induced apoptosis.

Endothelzellen sind ein aktiver Bestandteil der angeborenen Immunabwehr des Menschen gegen mikrobielle Pathogene. Unter ungünstigen Bedingungen kann die Abwehrreaktion sogar zu einer lebensbedrohlichen Sepsis führen. Hier wurde die bislang wenig bekannte Endothelantwort auf den fakultativ humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, einem der häufigsten Verursacher von letaler Sepsis beim Menschen, näher untersucht. Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse von HUVEC nach Exposition mit C. albicans konnten 56 hochregulierte Gene identifiziert werden, während 69 Gene herunterreguliert wurden. Ein bedeutender Anteil der regulierten Gene ist an Prozessen der angeborenen Immunantwort beteiligt und dient hauptsächlich der Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen ergaben eine zentrale Rolle des proinflammatorischen NF-kappaB-Weges bei der Regulation des Candida-induzierten Transkriptoms von Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass C. albicans diesen Signalweg sequenziell aktiviert. Zusätzlich konnte durch die Expression einer dominant-negativen Mutante einer Signalkomponente des NF-kappaB-Signalwegs die Candida-vermittelte Induktion von kappaB-abhängigen Genen gehemmt werden. Mit einem pharmakologischen Ansatz wurde der p38 MAP Kinase-Signalweg als weiterer bedeutsamer Signalweg identifiziert, der die Expression einzelner Candida-Zielgene wie CXCL8/IL-8 moduliert. Schließlich wurde gezeigt, dass die Candida-induzierte NF-kappaB-Aktivierung im untersuchten endothelialen Zellsystem unabhängig von den Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 geschieht, die üblicherweise an der Erkennung mikrobieller Pathogene beteiligt sind. Durch RNA-Interferenz-Experimente konnte jedoch dargelegt werden, dass das Adaptermolekül MyD88 und die Kinase IRAK1, die beide entscheidend an der TLR-vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind, essentiell für die Weiterleitung des Signals in Endothelzellen sind. Nachfolgend konnte mit TLR3 zumindest einer der signaltransduzierenden Rezeptoren identifiziert werden. Als erste umfassende Untersuchung der endothelialen Antwort auf Candida albicans erlaubt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die komplexen Signalmuster von Endothelzellen, die dieser klinisch bedeutende Krankheitserreger auslöst. / Endothelial cells (ECs) actively participate in the innate defence against microbial pathogens. Under unfavourable conditions defence reactions can even turn into life-threatening responses resulting in sepsis. Here the so far largely unknown EC reaction patterns to Candida albicans were studied. C. albicans is a facultative human pathogenic fungus and a major cause of lethality in septic patients. Oligonucleotide microarray analysis revealed 56 genes that were transcriptionally up-regulated and 69 that were suppressed upon exposure of ECs to C. albicans. A major portion of these genes is involved in defence mechanisms of the innate immune system with a high representation of genes serving the recruitment of neutrophils to sites of infection. Further examination of candidate signalling cascades established a central role of the proinflammatory NF-kappaB pathway in the regulation of the Candida-modulated transcriptome of ECs. It was shown that the NF-kappaB signalling pathway becomes activated at various levels. In addition, expression of a dominant negative mutant of a NF-kappaB signalling pathway compound blocked the Candida-induced kappaB-dependent gene expression. Using a pharmacological approach the stress-activated p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway was identified as a second major regulatory pathway which critically contributes to the regulation of selected Candida target genes such as CXCL8/IL-8. Candida-induced NF-kappaB activation is mediated independently of Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 that commonly have been implicated with microbial pattern recognition. Nevertheless, knock-down of the adapter molecule MyD88 and the essential downstream kinase of TLR-, IL-1R- and IL-18R-signalling, IRAK1, suggested that recognition and signalling via a TLR apart from TLR2/TLR4 is crucial for Candida-induced gene expression in primary ECs. Finally, RNAi experiments indicate that most likely TLR3 represents this receptor. These data provide the first comprehensive analysis of endothelial gene responses to Candida albicans and present novel insights into the complex signalling patterns triggered by this important pathogen.

TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, wurde bislang hauptsächlich hinsichtlich seiner dominanten Funktion als Auslöser des apoptotischen Programms untersucht. In neueren Untersuchungen konnte allerdings gezeigt werden, dass TRAIL unter bestimmten Bedingungen auch eine starke Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege induzieren kann. Um die Mechanismen der TRAIL-induzierten nicht-apoptotischen Signaltransduktion genauer zu untersuchen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit besonderes Augenmerk auf die TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB und deren Modulation durch Interferon gamma und FLIP gelegt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Interferon gamma, neben einer synergistischen Wirkung hinsichtlich der TRAIL-induzierten Apoptose, unter nicht-apoptotischen Bedingungen, die durch Caspase-Inhibition oder Bcl2-Überexpression geschaffen wurden, auch eine verstärkende Wirkung auf die TRAIL-induzierten NFkB-Aktivierung in KB-Zellen entfaltet. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass FLIP, ein Inhibitor der Caspase-8-Aktivierung, dessen Expression unter anderem durch Interferon gamma reguliert wird, neben einer Apoptose-inhibierenden Wirkung auch die TRAIL-induzierte NFkB-Aktivierung in KB-Zellen inhibiert, was auf eine gemeinsame Regulation beider Mechanismen auf der Ebene des DISC (Death Inducin Signaling Complex) hindeutet. / TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) is a member of the TNF superfamily and is primarily known for its strong apoptosis inducing capability. However, it could be shown that besides its strong apoptotic potential, TRAIL can also induce non-apoptotic signaling pathways under certain conditions. In this dissertation it is shown that interferon gamma synergistically enhances the TRAIL induced activation of NFkB under non-apoptotic conditions, which were achieved by inhibition of caspases or stable expression of Bcl2 in KB-cells. Furthermore, FLIP, an inhibitor of caspase-8-activation, which is amongst others regulated by interferon gamma, is shown not only to block TRAIL-induced apoptosis but also to inhibit TRAIL-induced NFkB-activation in KB-cells, indicating that both mechanisms are coregulated at the level of the DISC (Death Inducing Signaling Complex).

In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein. / The focus of this study was laid on the analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis of 15 different lymph nodes without prior knowledge of the respective causative organism with help of the SHARP-Screening, a 16S-rRNA-based heterogeneity and phylogenetic analysis. This represents the first study to analyse this problem with the above mentioned SHARP-Screening adapting the method for the utilization of paraffin embedded tissue which consequently allowed the analysis of tissue specimen of which no freezing material was available and which were embedded in routine procedures as well as coloured according to a standard approach. The SHARP-Screening compromises two complementary steps: The first step is the creation of a gene pool of all bacterial genes of the entire DNA extracted from the analysed tissue by the systematic amplification of the 16S-rRNA-gene by means of universal eubacterial primers. The next step after the transformation was the selection of the different phylotypes of the incorporated 16S-rRNA-genes (altogether 400) by analysing the restriction fragment length polymorphism (RFLP). After the sequencing, the 16S-rRNA-genes were identified by comparing them with the known bacterial sequences with help of the “Basic-Local-Alignment-Search-Tool” (BLAST). The SHARP-Screening has proved itself as an adequate method to analyse the entire bacterial flora contained in the tissue sample. In some cases different causative organisms were found in contrast to the expectations which arose from the histological pictures. In this way evidence of gluconacetobacter sacchari could be provided as potential causative agents of a septic granulomatosis, an alternative differential diagnosis to the histologically assumed cat scratch disease. Furthermore, histological pictures of a similar type could be observed with regard to the same identified causative organism. For example, in conjunction with the appearance of edema, necrosis, granulomatosic purulent alterations and a very pronounced sinushistiozytosis in the lymph node tissue, comamonadaceae and accordingly janthinobacteria could consistently be demonstrated. A lot of times not just a single causative organism but a whole spectrum of the lymphadenitis could be identified. Here, however, the existence of the 16S-rRNA cannot be attributed to the existence of vital causative agents. Nevertheless, the frequency of the respective clones allows a semi quantitative assessment of the importance of the corresponding causative agents. Thus the SHARP-Screening proved evidence of homologies to paracoccus yeeii. A species which is often missed with classic methods however can play a pathogenic role. In several cases streptomyces, roseomonas gilardii rosea and stenotrophomonas maltophila, which are often mentioned in literature with regard to immunosuppressed patients, could be demonstrated in connection with the histological suspicion of a malignant tumour. While suspecting a lymphgranuloma venerum, a cyanobacterium species was discovered which according to literature sources enables chlamydia trachomatis to operate the body’s amino acid metabolism. Altogether, the SHARP-Screening is expected to lead to even more profound findings of bacterial diversity and causal causative organism associations with regard to diseases of the lymphatic system.

Dietary antioxidants are believed to play an important role in the prevention and treatment of a variety of diseases associated with oxidative stress. Although there is a wide range of dietary antioxidants, the bulk of the research to date has been focused on the nutrient antioxidants vitamin C, E, and carotenoids. Certain relatively uncommon antioxidants such as lipoic acid (LA), and phenolic compounds such as (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin gallate (ECG), and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), have not been extensively investigated although they may exert greater antioxidant potency than that of carotenoids and vitamins. Extracts from selected plants and plant byproducts may represent rich sources for one or more of such antioxidants and therefore exhibit higher effects than a single antioxidant due to the synergistic effects produced between such antioxidants. However, in the last decade a number of epidemiological, animal and in vitro studies have suggested a protective and therapeutic potency of these antioxidants in a broad range of diseases such as cancer, diabetes, atherosclerosis, cataract and acute and chronic neurological disorders. Inflammation, the response of the host toward any infection or injury, plays a central role in the development of many chronic diseases. Several evidences demonstrated the rise of different types of cancer from sites of inflammation. This suggests that active oxygen species and some cytokines generated in the inflamed tissues can cause injury to DNA and ultimately lead to carcinogenesis. Diethylnitrosamine (DEN) is one of the most important environmental carcinogens, present in a variety of foods, alcoholic beverages, tobacco smoke and it can be synthesized endogenously. In addition to the liver it can induce carcinogenesis in other organs like kidney, trachea, lung, esophagus, fore stomach, and nasal cavity. Several epidemiological and laboratory studies indicate that nitroso compounds including DEN may induce hyperplasia and chronic inflammation which is closely associated with the development of hepatocellular carcinoma. Despite increasing evidence on the potential of antioxidants in modulating the etiology of chronic diseases, little is known about their role in inflammation and acute phase response (APR). Therefore the aim of the present work was to study the protective effect of water and solvent extracts of eight plant and plant byproducts including green tea, artichoke, spinach, broccoli, onion and eggplant, orange and potato peels as well as eight antioxidants agents including EC, EGC, ECG, EGCG, ascorbic acid (AA), acetylcysteine (NAC), α-LA, and alpha-tocopherol (α-TOC) toward acute inflammation induced by interleukin-6 (IL-6) and hepatotoxicity induced by DEN in vitro. The negative acute phase proteins (APP), transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) were used as inflammatory biomarkers analyzed by ELISA, whereas neutral red assay was used for evaluating the cytotoxicity. All experiments were performed in vitro using human hepatocarcinoma cell line (HepG2). Additionally the antioxidant activity was measured by TEAC and FRAP assays, phenolic content was measured by Folin–Ciocalteu and characterized by HPLC. Moreover, the microheterogeneity of TTR was detected using immunoprecipitation assay combined with SELDI-TOF MS. Results of present study showed that HepG2 cells provide a simple, sensitive in vitro system for studying the regulation of the negative APP, TTR and RBP under free and inflammatory condition. IL-6, a potent proinflammatory cytokine, in a concentration of 25 ng/ml was able to reduce TTR and RBP secretion by approximately 50-60% after 24h of incubation. With exception of broccoli and water extract of onion which showed pro-inflammatory effects in this study, all other plant extracts, at specific concentrations, were able to elevate TTR secretion in normal condition and even under treatment of IL-6 where the effect was quite lower. Green tea followed by artichoke and potato peel exhibited the highest elevation in TTR concentration which reached 1.1 and 2.5 folds of control in presence and absences of IL-6 respectively. In general Plant extracts were ordered according their anti-inflammatory potency as following: in water extracts; green tea > artichoke > potato peel > orange peel > spinach > eggplant peel, where in solvent extracts; green tea > artichoke > potato peel > spinach > eggplant peel > onion > orange peel. The antiinflammatory effect of water extracts of green tea, artichoke and orange peel were significantly higher than their corresponding solvent extracts whereas water extracts of eggplant-, potato peels and spinach showed lower effect than their solvent extracts. On the other hand α-LA followed by EGCG and ECG exhibited the highest elevation in TTR concentration compared to other antioxidants. The relation between the anti-inflammatory potential and antioxidants activity and phenolic content for the investigated substances was generally weak. This may suggest the involvement of other mechanisms than antioxidants properties for the observed effect. TTR secreted by HepG2 cells has a molecular structure quite similar to the purified standard and serum TTR in which all the three main variants are contained including native, S-cystinylated and Sglutathionylated TTR. Interestingly, a variant with molecular mass of 13453.8 + 8.3 Da has been detected only in TTR secreted by HepG2. Among all investigated antioxidants and plant extracts, six substances were able to elevate the native preferable TTR variant. The potency of these substances can be ordered as following α-LA > NAC > onion > AA > EGCG > green tea. A weak correlation between elevation on TTR and shifting to the native form was observed. Similar weak correlation has also been observed between antioxidants activity and elevation in native TTR. Although DEN was able to induce cell death in a concentration dependent manner, it requires considerably higher concentrations for its effects especially after 24h. This may be attributed to a lack in cytochrome P450 enzymes produced by HepG2. At selected concentrations some antioxidants and plant extracts significantly attenuate DEN cytotoxicity as following: spinach > α-LA > artichoke > orange peel > eggplant peel > α-TOC > onion > AA. Contrary all other substances especially green tea, broccoli, potato peel, and ECG stimulate DEN toxicity. In conclusion, this study demonstrated that selected antioxidants and plant extracts may attenuate the inflammatory process, not only by their antioxidants potency but also by other mechanisms which remain unclear. They may also play a vital role on stabilizing the tetramic structure of TTR and thereby prevent amyloidosis diseases. Lipoic acid represents in this study unique function against inflammation and hepatotoxicity. Despite the protective effect demonstrated by investigated substances, attention should also be given to the pro-oxidant and potential cytotoxic effects produced at higher concentrations. / Substanzen und Lebensmittelinhaltstoffe mit antioxidativer Wirkung spielen eine entscheidende Rolle in Prävention und Behandlung zahlreicher Erkrankungen, die mit oxidativen Stress assoziiert sind. Dabei stehen v. a. die Lebensmittelinhaltsstoffen Vitamin C (Ascorbinsäure, AA), Vitamin E und die Carotinoide im Zentrum der Forschung. Da einige bislang relativ ungebräuchliche Antioxidantien wie Liponsäure (LA) und phenolische Substanzen wie (-)-Epicatechin (EC), (-)-Epigallocatechin(EGC), (-)-Epicatechingallat (ECG), und (-)-Epigallocatechingallat (EGCG) ein größeres antioxidatives Potential als Carotinoide und die Vitamine C und E aufweisen, geraten diese in zunehmendem Maße in den Fokus der Forschung und wecken auch immer mehr das Interesse gesundheitsbewusster Verbraucher. Einige ausgewählte Pflanzenextrakte und Extrake pflanzlicher Nebenprodukte stellen ergiebige Quellen der oben erwähnten Substanzen dar und zeichnen sich daher durch eine höhere Wirksamkeit aus, die teilweise auch auf synergetische Effekte zwischen diesen Antioxidantien zurückzuführen ist. Eine Vielzahl epidemiologischer Studien sowie zahlreiche Tier- und in-vitro-Experimente deuten daher darauf hin, daß die oben erwähnten Antioxidantien bei einer Vielzahl von Erkrankugen, wie Krebs, Diabetes, Arteriosklerose, Katarakt, akute bzw. chronische neurologische Störungen, ein schützendes und therapeutisches Potential entfalten. Entzündungen, als Antwort eines Individuums auf Infektion oder Verletzungen, spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung vieler chronischer Erkrankungen. So konnten mehrere Studien den Zusammenhang zwischen der Entstehung verschiedener Krebsarten und zugrundeliegender Infektionen belegen. Dies deutet darauf hin, dass reaktive Sauerstoffspezies und einige Zytokinen, die im entzündeten Geweben generiert werden und DNA-Schäden verursachen können, letztendlich auch eine Karzinogenese auslösen können. Diethylnitrosamin (DEN) ist eines der bekanntesten Umweltkarzinogene, daß neben Hepatokarzinomen auch Krebs in Nieren, Trachea, Lunge, Speiseröhre, Magen und Nasenhöhle hervorrufen kann und in vielen Lebensmitteln, alkoholischen Getränke sowie Tabakrauch enthalten ist und darüber hinaus endogen synthetisiert wird. Dabei geht man auf Grundlage mehrere epidemiologischer und Forschungsstudien davon aus, dass durch Nitroso-Verbindungen, u.a. auch DEN, induzierte Hyperplasien und chronische Entzündungen die Entwicklung hepatozellulärer Karzinome begünstigt. Trotz zunehmender Beweise bezüglich des Potentials von Antioxidantien die Ätiologie chronischer Erkrankungen zu modulieren, ist bislang nur sehr wenig über ihre Rolle im Entzündungsprozess und der Akutphasereaktion (APR) bekannt. Deshalb war das Ziel der vorliegenden Arbeit die schützende Wirkung von Extrakten verschiedener Pflanzen und Pflanzennebenprodukten sowie isolierten Antikoxidantien bei akuten Entzündungssituationen zu testen. Dazu wurden wässrige und Lösungsmittelextratke aus acht Pflanzen bzw. deren Nebenprodukten (Grüntee, Artischocke, Spinat, Brokkoli, Zwiebel, Aubergine-, Orangen- und Kartoffelschalen) hergestellt und ihre Wirkung sowie die acht weiterer reiner Antioxidantien (EC, EGC, ECG, EGCG, Ascorbinsäure (AA), Acetylcystein (NAC), LA, und -Tocopherol (TOC) in in-vitro-Modellen der akuten Entzündung, induziert durch interleukin-6 (IL-6), bzw. der Hepatoxizität, induziert durch DEN, getestet.. Transthyretin (TTR) und Retinol-Bindungsprotein (RBP), zwei negative Akutphasenproteine (APP) wurden als Entzündungsbiomarker (Analyse per ELISA) und Neutral-Red-Assay als ein Maß für die Cytotoxizität herangezogen. Alle Experimente wurden in-vitro in einer immortalisierten humanen Hepatokarzinom-Zelllinie (HepG2) durchgeführt. Die antioxidativen Kapazität wurde mittels TEAC und FRAP-Methoden evaluiert und der Gesamtphenolgehalt durch die Folin–Ciocalteu-Methode erfasst, wobei die qualitative Charakterisierung über die HPLC erfolgte. Die Mikroheterogenität des TTR wurde durch Immunopräzipitation in Kombination mit SELDI-TOF-MS Technik analysiert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass HepG2-Zellen ein einfaches und empfindliches in-vitro System zur Regulierung von negativen Akutphasenproteinen, TTR und RBP, unter physiologischen und infllammatorischen Bedingungen darstellen. IL-6, ein potentes Pro-Entzündungszytokine, war bei einer 24stündigen Inkubation mit einer Konzentration von 25 ng/ ml in der Lage die Sekretion von TTR und RBP um ca. 50-60% zu reduzieren. Mit Ausnahme von Broccoli und Wasser Extrakt der Zwiebel, die zeigten, proinflammatorischen Effekt Wirkungen in dieser Studie, die alle anderen Pflanzenextrakten, in bestimmten Konzentrationen, waren in der Lage zu erheben TTR Sekretion im normalen, aber auch bei der Behandlung von IL-6 bei denen die Wirkung war niedriger. Grüntee, gefolgt von Artischocken und Kartoffelschälen zeigte die höchste Erhebung in der TTRKonzentration, die erreicht, 1,1 und 2,5 Falten der Kontrolle in Behandlung und ohne Behandlung von IL-6 bzw. Die wässrigen Pflanzenextrakte lassen sich in der folgenden Reihenfolge des anti-Entzündungspotentials einordnen: Grüntee > Artischocke > Kartoffelschalen > Orangenschalen > Spinat > Aubergineschalen, wogegen bei Lösungsmittelextrakte folgende Reihenfolge ermittelt wurde: Grüntee > Artischocke > Kartoffelnschalen > Spinat > Aubergineschalen > Zwiebel > Orangenschalen. Die schützende Wirkung der wässrigen Extrakte von Grüntee, Artischocke und Orangenschalen war signifikant höher als die der entsprechenden Lösungsmittelextrakte. Wohingegen wässrige Extrakte aus Aubergineschalen, Kartoffelschalen, Spinat und Zwiebel weniger effektiv waren. Auf der anderen Seite, LA gefolgt von EGCG und ECG zeigte die höchste Erhebung in der TTRKonzentration im Vergleich zu anderen Antioxidantien. Somit konnte ein schwacher aber Zusammenhang zwischen antinflammatorischem Potential, antioxidativer Aktivität und Phenolgehalt nachgewiesen werden. Daher ist anzunehmen, dass den beobachteten Effekten anderen Mechanismen zu Grunde liegen. Das durch HepG2-Zellen sezernierte TTR erwies eine molekulare Struktur ähnlich der des verwendeten Standards bzw. des TTR aus humanem Serum auf. Es enthielt alle drei Hauptvarianten, einschließlich der nativen, S-cystinylierten und S-glutathionylierten TTR-Formen. Darüber hinaus wurde nur im in-vitro sezerniertem TTR (TTR aus HepG2-Zellen) eine Variante mit einer molekularen Masse von 13453.8 + 8.3 Da nachgewiesen. Von den untersuchten Substanzen wiesen nur sechs Verbindungen die Fähigkeit auf den Anteil der günstigen nativen TTR-Form zu erhöhen aus. Dabei konnte folgende Wirksamkeitsreihenfolge zugeordnet werden : LA > NAC > Zwiebel > AA > EGCG > Grüntee. Eine schwache Korrelation zwischen der Erhöhung der TTRKonzentration und der Verschiebung zu der nativen Form hin wurde festgestellt. Ein ähnlicher Zusammenhang zwischen der antioxidativen Aktivität und dieser Erhöhung wurde auch beobachtet. Obwohl DEN in der Lage war konzentrationsabhängig den Zelltod zu induzieren, war eine wesentlich höhere Konzentration notwendig, um die volle Wirksamkeit während 24stündiger Inkubation zu gewährleisten. Dies mag auf die mangelnde Ausstattung mit Cytochrom-P450-Enzymen, die in den HepG2 Zellen produziert werden, zurück zu führen sein. Ausgewählte Konzentrationen einiger eingesetzter Substanzen führten zu einer signifikanten Schwächung der DEN-induzierten Zytotoxizität mit folgender Wirksamkeit: Spinat > LA > Artischocke > Orangen- > Aubergineschalen > TOC > Zwiebel > AA. Im Gegensatz dazu, stimulierten alle anderen Substanzen, insbesondere Grüntee, Brokkoli, Kartoffelschalen und ECG, die DEN –induzierten Toxizität. Diese Arbeit zeigt somit, dass ausgewählte Antioxidantien und Pflanzenextrakten in der Lage sind, den antinflammatorischen Prozess sowohl durch ihre antioxidative Wirkung als auch durch bislang nicht aufgeklärten Mechanismen grundlegend zu beeinflussen. Sie könnten daher eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung von Proteinstrukturen übernehmen (gezeigt am Beispiel vom TTR) und in diesem Zusammenhang möglicherweise auch zur Prävention von Krankheiten wie Amyloidosen beitragen. Liponsäure überzeugte in dieser Arbeit durch seine einzigartigen Funktion gegenüber Entzündungssituationen und Hepatoxizität. Wie oft beobachtet und durch diese Studie bestätigt, weisen die verwendeten Subsatzen neben der schützenden anti- auch pro-oxidativen Wirkungen auf, wodurch die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen zur Erfassung der Zytotoxizität beim Einsatz höherer Konzentration verdeutlicht wird.

Die Restenose stellt ein zentrales Problem der interventionellen Kardiologie dar und ist häufigste Komplikation nach perkutanen Angioplastieverfahren. Hauptursache dieser Wiederverengung des Gefäßes ist die Bildung einer Neointima durch die Proliferation transdifferenzierter vaskulärer glatter Muskelzellen und die Sekretion extrazellulärer Matrix. Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Entzündungsreaktion nach der Gefäßverletzung werden als frühe, die Neointimabildung induzierende Prozesse diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Projekte bearbeitet, die Aufschluss über die während der Neointimabildung statt findenden Prozesse geben sollen. Mit Hilfe eines Verletzungsmodells der murinen Femoralarterie wurde der Einfluss der Entzündung und der ROS-Bildung auf die Neointimabildung in der Maus untersucht. Die Behandlung mit dem mitochondrialen Superoxiddismutase-Mimetikum MitoTEMPO verminderte die Bildung der Neointima besser, als die Behandlung mit dem globalen ROS-Fänger N-Acetylcystein. Die stärkste Hemmung der Neointimabildung wurde jedoch durch die Immunsuppression mit Rapamycin erreicht. Interferon-γ (INFγ) ist ein wichtiges Zytokin der Th1-Immunantwort, das in Folge der Gefäßverletzung freigesetzt wird und die proinflammatorischen Chemokine CXCL9 (MIG, Monokine Induced by INF), CXCL10 (IP-10, INF inducible Protein of 10 kDa) und CXCL11 (I-TAC, Interferon inducible T cell-Chemoattractant) induziert. CXCL9, CXCL10 und CXCL11 sind Liganden des CXC-Chemokinrezeptors 3 (CXCR3) und locken chemotaktisch CXCR3 positive Entzündungszellen zum Ort der Gefäßverletzung. Daher wurde die spezielle Bedeutung des Chemokins CXCL10 in der Restenose untersucht. Dazu wurden CXCL10-defiziente Mäuse dem Femoralisverletzungsmodell unterzogen und die Gefäße nach 14 Tagen morphometrisch und immunhistologisch untersucht. CXCL10-Defizienz führte in Mäusen zu einer verminderten Neointimabildung, die mit einer verringerten Inflammation, Apoptose und Proliferation im verletzten Gefäß korrelierte. Neben der Inflammation beeinflusst aber auch die Reendothelialisierung der verletzten Gefäßwand die Restenose. Interessanterweise war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen in den CXCL10-Knockout-Mäusen auch die Reendothelialisierung erheblich verbessert. Offensichtlich ist das CXCR3-Chemokinsystem also in völlig unterschiedliche biologische Prozesse involviert und beeinflusst nicht nur die Bildung der Neoimtima durch die Förderung der Entzündung, sondern auch die Unterdrückung der Reendothelialisierung der verletzten Gefäßwand. Tatsächlich wird der CXCR3 nicht nur auf Entzündungszellen, sondern auch auf Endothelzellen exprimiert. Zur separaten Untersuchung der Rolle des CXCR3 in der Inflammation und der Reendothelialisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen konditionelle CXCR3-Knockout-Mäuse zu generieren, in denen der CXCR3 entweder in Entzündungszellen oder in Endothelzellen ausgeschaltet ist. Zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, mit denen der CXCR3 seine Funktionen vermittelt, wurde zudem untersucht ob dieser mit anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) interagiert. Die Analyse von Coimmunpräzipitaten deutet auf eine Homodimerisierung der beiden CXCR3 Splicevarianten CXCR3A und CXCR3B, sowie auf die Heterodimerbildung von CXCR3A und CXCR3B mit sich, sowie jeweils mit CCR2, CCR3, CCR5 und den Opioidrezeptoren MOR und KOR hin. Die getestete Methode des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) erwies sich jedoch als ungeeignet zur Untersuchung von CXCR3, da dieser in HEK293T-Zellen nicht korrekt transient exprimiert wurde. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass das CXCR3-Chemokinsystem eine zentrale Rolle in unterschiedlichen, die Neointimabildung beeinflussenden Prozessen spielt. Damit könnten der CXCR3 und insbesondere das Chemokin CXCL10 interessante Zielmoleküle in der Entwicklung neuer verbesserter Therapien zur Verhinderung der Restenose darstellen. / Restenosis represents a central problem after coronary angioplasty procedures and is caused by intimal hyperplasia, also called neointima, as a result of transdifferentiation, proliferation of vascular smooth muscle cells and secretion of extracellular matrix. Formation of reactive oxygen species (ROS) and inflammation after vascular injury caused by angioplasty are discussed as early inducers of neointima formation. In several projects the processes causing the development of intimal hyperplasia were investigated. First of all, the impact of inflammation and ROS in neointima formation was investigated using the mouse femoral injury model. The mitochondrial superoxide dismutase mimetic mitoTEMPO could reduce neointima formation better than the global ROS scavenger N-acetylcystein. However, the strongest reduction of neointima formation was achieved by the treatment with the immunosuppressant rapamycin. Interferon-γ(INFγ) is a major cytokine of the Th1 immune response. It is released as a result of vessel injury and induces the proinflammatory chemokines CXCL9 (MIG, Monokine Induced by INF), CXCL10 (IP-10, INF inducible Protein of 10 kDa) and CXCL11 (I-TAC, Interferon inducible T-cell-Chemoattractant), which are ligands of the CXC chemokine receptor 3 (CXCR3) and by this chemotactically recruit CXCR3 positive cells to the site of vessel injury. In this work the special role of CXCL10 in restenosis was investigated. Therefore, CXCL10 decient mice underwent the mouse femoral injury model. The vessels were analysed morphometrically and immunohistologically 14 days after injury. CXCL10 deciency lead to decreased neointima formation that correlated with a reduced recruitment of inflammatory cells as well as diminished numbers of apoptotic and proliferating cells at the site of vessel injury. In addition to inflammation the reconstitution of the endothelium has also impact on the development of restenosis. Interestingly reendothelialisation was strongly improved in CXCL10 decient mice compared to wildtype mice. Obviously the CXCR3 chemokine system is involved in different biological prosesses and impairs neointima formation on one hand by the advancement of inflammation and on the other hand by the suppression of reendothelialisation. In fact the CXCR3 is not only expressed on inflammatory cells but also on endothelial cells. To investigate the role of CXCR3 in inflammation and reendothelialisation separatly the generation of conditional CXCR3 knockout mice with a CXCR3 knockout in T-cells or endothelial cells was started in an additional project. For a better understanding of the molecular mechanisms on which the CXCR3 mediates its biological functions the protein-protein interactions of the CXCR3 with other G-protein coupled recteptors (GPCR) was analysed. Coimmunoprecipitation showed homodimerization of the CXCR3 splice variants CXCR3A and CXCR3B, as well as heterodimerization of CXCR3A and CXCR3B with each other and with the chemokine receptors CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 and the opioid receptors MOR and KOR. The additional tested Fluorecence resonance energy transfer (FRET) method proved to be not suitable to measure interactions of CXCR3, since this receptor could not be expressed correctly on the cell surface after transient transfection. To summarise, the results indicate that the CXCR3 chemokine system plays a central role in different processes that mediate neointima formation. Thus, the CXCR3 and especially the chemokine CXCL10 could be interesting therapeutic targets in the development of new or improved treatments to reduce the risk of restenosis.

Das Selenoprotein Glutathionperoxidase 2 (GPx2) ist ein epithelzellspezifisches, Hydroperoxide-reduzierendes Enzym, welches im Darmepithel, vor allem in den proliferierenden Zellen des Kryptengrundes, exprimiert wird. Die Aufrechterhaltung der GPx2-Expression im Kryptengrund auch bei subadäquatem Selenstatus könnte darauf hinweisen, dass sie hier besonders wichtige Funktionen wahrnimmt. Tatsächlich weisen GPx2 knockout (KO)-Mäuse eine erhöhte Apoptoserate im Kryptengrund auf. Ein Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die physiologische Funktion der GPx2 näher zu untersuchen. In Kryptengrundepithelzellen aus dem Colon selenarmer GPx2 KO-Mäuse wurde eine erhöhte Caspase 3/7-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp (WT) festgestellt. Zudem wiesen diese Zellen eine erhöhte Suszeptibilität für oxidativen Stress auf. Die GPx2 gewährleistet also den Schutz der proliferierenden Zellen des Kryptengrundes auch bei subadäquater Selenversorgung. Des Weiteren wurde im Colon selenarmer (-Se) und -adäquater (+Se) GPx2 KO-Mäuse im Vergleich zum WT eine erhöhte Tumornekrosefaktor α-Expression und eine erhöhte Infiltration von Makrophagen festgestellt. Durch Fütterung einer selensupplementierten Diät (++Se) konnte dies verhindert werden. In GPx2 KO-Mäusen liegt demnach bereits basal eine niedriggradige Entzündung vor. Dies unterstreicht, dass GPx2 vor allem eine wichtige antiinflammatorische Funktion im Darmepithel besitzt. Dem Mikronährstoff Selen werden protektive Funktionen in der Colonkanzerogenese zugeschrieben. In einem Mausmodell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese wirkte GPx2 antiinflammatorisch und hemmte so die Tumorentstehung. Auf der anderen Seite wurden jedoch auch prokanzerogene Eigenschaften der GPx2 aufgedeckt. Deshalb sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welchen Effekt ein GPx2 knockout in einem Modell der sporadischen, durch Azoxymethan (AOM) induzierten, Colonkanzerogenese hat. Im WT kam es in präneoplastischen Läsionen häufig zu einer erhöhten GPx2-Expression im Vergleich zur normalen Darmmucosa. Eine derartige Steigerung der GPx2-Expression wurde auch in der humanen Colonkanzerogenese beschrieben. Das Fehlen der GPx2 resultierte in einer verminderten Entstehung von Tumoren (-Se und ++Se) und präneoplastischen Läsionen (-Se und +Se). Somit förderte GPx2 die Tumorentstehung im AOM-Modell. Acht Stunden nach AOM-Gabe war im GPx2 KO-Colon im Vergleich zum WT eine erhöhte Apoptoserate in der Kryptenmitte (-Se, +Se), nicht jedoch im Kryptengrund oder in der ++Se-Gruppe zu beobachten. Möglicherweise wirkte GPx2 prokanzerogen, indem sie die effiziente Elimination geschädigter Zellen in der Tumorinitiationsphase verhinderte. Eine ähnliche Wirkung wäre auch durch die erhöhte GPx2-Expression in der Promotionsphase denkbar. So könnte GPx2 proliferierende präneoplastische Zellen vor oxidativem Stress, Apoptosen, oder auch der Antitumorimmunität schützen. Dies könnte durch ein Zusammenwirken mit anderen Selenoproteinen wie GPx1 und Thioredoxinreduktasen, für die ebenfalls auch prokanzerogene Funktionen beschrieben wurden, verstärkt werden. Eine wichtige Rolle könnte hier die Modulation des Redoxstatus in Tumorzellen spielen. Die Variation des Selengehalts der Diät hatte im WT einen eher U-förmigen Effekt. So traten in der –Se und ++Se-Gruppe tendenziell mehr und größere Tumore auf, als in der +Se Gruppe. Zusammenfassend schützt GPx2 also die proliferierenden Zellen des Kryptengrundes. Sie könnte jedoch auch proliferierende transformierte Zellen schützen und so die sporadische, AOM-induzierte Colonkanzerogenese fördern. In einem Modell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese hatte GPx2 auf Grund ihrer antiinflammatorischen Wirkung einen gegenteiligen Effekt und hemmte die Tumorentstehung. Die Rolle der GPx2 in der Colonkanzerogenese ist also abhängig vom zugrunde liegenden Mechanismus und wird maßgeblich von der Beteiligung einer Entzündung bestimmt. / The selenoprotein glutathione peroxidase 2 (GPx2) is a hydroperoxide-reducing enzyme that is mainly expressed in the gastrointestinal epithelium, especially in the crypt base were the proliferating cells reside. GPx2 expression is maintained even when the selenium supply is limited, which indicates that GPx2 might have an important function in these cells. Indeed, GPx2 knockout (KO)-mice have an enhanced rate of apoptosis in the crypt base. Therefore one aim of this study was to further elucidate the physiological function of the GPx2. Isolated colonic crypt base epithelial cells of selenium deficient GPx2 KO-mice were found to have a higher caspase 3/7 activity than wild type (wt) cells. Moreover they exhibited an enhanced susceptibility for oxidative stress. Thus GPx2 protects the proliferative crypt base cells of the intestine, especially when the selenium supply is limited. Additionally an enhanced expression of tumor necrosis factor α and an enhanced infiltration of macrophages were detected in the colon of GPx2 KO-mice in comparison to the wt. These effects were observed on a selenium deficient (-Se) and -adequate (+Se) diet, but could be prevented by feeding a selenium supplemented (++Se) diet. Accordingly, GPx2 KO-mice have a basal low grade inflammation. This underlines, that GPx2 has an important anti-inflammatory function in the intestinal epithelium. Selenium deficiency is linked to an increased risk of developing colorectal cancer. In a mouse model of colitis-associated colon carcinogenesis, GPx2 had anti-inflammatory and thus anticarcinogenic effects. However, also procarcinogenic functions of the GPx2 have been observed. Therefore, this study aimed to analyse the role of GPx2 in a model of non-inflammation triggered, sporadic colon carcinogenesis induced by azoxymethane (AOM). In preneoplastic lesions of wt mice, an enhanced expression of GPx2 in comparison to the normal mucosa was frequently observed. An upregulation of GPx2 expression has also been described in human colon carcinogenesis. GPx2 KO mice had less tumors (-Se and ++Se) and less preneoplastic lesions (-Se, +Se) than wt mice. Accordingly GPx2 promotes colon carcinogenesis in the AOM-model. Eight hours after AOM-application, a higher rate of apoptosis was observed in the mid-crypt region of the colon of GPx2 ko mice in comparison to wt mice in the –Se and +Se groups, but not in the ++Se group or in the crypt base. Thus GPx2 might act procarcinogenic by preventing the elimination of cells with DNA-damage in the tumor initiation stage. Similarly, the enhanced GPx2-expression in preneoplastic cells could promote tumorigenesis by protecting these cells from oxidative stress, apoptosis or antitumor immunity. This effect might be enhanced by other selenoproteins like GPx1 or thioredoxin reductases that have also been reported to possess procarcinogenic properties and it might be closely related to the regulation of the redox state of tumor cells. In wt mice, the selenium content of the diet turned out to have a rather U-shaped effect on colon carcinogenesis. In the –Se and ++Se groups, wt mice tended to have more and larger tumors than in the ++Se group. In conclusion, GPx2 protects the proliferating cells of the intestinal crypt base, but it could also protect proliferating transformed cells and thus promote sporadic, AOM-induced colon carcinogenesis. In contrast, GPx2 acted anticarcinogenic in a model of colitis-associated colon carcinogenesis due to its antiinflammatory properties. Thus, the role of GPx2 in colon carcinogenesis depends on the underlying mechanisms, especially on the involvement of an inflammation.

Adipöse Patienten und Typ-2-Diabetiker zeigen ein erhöhtes Risiko für Harnwegsinfekte. Die Ursache der höheren Prävalenz ist noch nicht nachhaltig geklärt. Bekannt ist, dass Typ-2-Diabetiker erhöhte Konzentrationen freier Fettsäuren im Blut aufweisen. Der veränderte Fettstoffwechsel könnte neben bakteriellen Ursachen ein möglicher Grund für abakterielle Entzündungsreaktionen der Harnblase sein. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden zeit- und konzentrationsabhängig kultivierte humane Detrusormyozyten im Vergleich zur Lipopolysaccharid (LPS) induzierten Entzündungsreaktion mit Palmitat stimuliert. Es wurde geprüft, ob eine autokrine und/oder endokrine Regulation des IL-6-Signalwegs vorliegt. Im Fokus standen insbesondere die IL-6- und MCP-1-Expression und deren möglichen regulatorischen Proteine gp80, gp130, NF-κB, STAT3, SOCS3 und MEK1. Die Stimulationsversuche mit LPS und Palmitat zeigen einen differenten zeit- und konzentrationsabhängigen Effekt auf die IL-6- und MCP-1-Expression in den humanen Detrusormyozyten. LPS und Palmitat induzieren eine zeitabhängige autokrine Regulation der IL-6-Signalkaskade über phosphoryliertes STAT3 und Feedback-mechanismen via SOCS3. Sowohl LPS als auch Palmitat bewirken über 48h eine mögliche endokrine Regulation des IL-6-Signalwegs. Zusammenfassend zeigt die Palmitatstimulation zeit- und konzentrationsabhängig einen stärkeren Effekt auf die IL-6-Signalwirkung als die Stimulation mit LPS. / Background: Urinary tract infections (UTI) are more frequent in type-2 diabetes mellitus patients than in subjects with normal glucose metabolism. The mechanisms underlying this higher prevalence of UTI are unknown. However, cytokine levels are altered in diabetic patients and may thus contribute to the development of UTI. Increased levels of free fatty acids (FFA), as observed in obese patients, can induce IL-6 production in various cell types. Therefore we studied the effects of the free fatty acid palmitate and bacterial lipopolysaccharide (LPS) on interleukin-6 (IL-6) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) expression and secretion in cultured human bladder smooth muscle cells (hBSMC). Methodology/Principal Findings: Biopsies were taken from patients undergoing cystectomy due to bladder cancer. Palmitate or LPS stimulated hBSMC were analysed for the production and secretion of the IL-6, gp80, gp80soluble, gp130, MCP-1, pSTAT3, SOCS3, NF-kB and SHP2 by quantitative PCR, ELISA, Western blotting, and confocal immunofluorescence. In signal transduction inhibition experiments we evaluated the involvement of NF-kB and MEK1 in IL-6 and MCP-1 regulation. Palmitate upregulates IL-6 mRNA expression and secretion via NF-kB dependent pathways in a concentration- and timedependent manner. MCP-1 was moderately upregulated by palmitate but was strongly upregulated by LPS involving NF-kB and MEK1 dependent pathways. Soluble IL-6 receptor (gp80soluble) was downregulated by palmitate and LPS, while membrane-bound gp80 was moderately upregulated. LPS increased SOCS3 and SHP2, whereas palmitate only induced SOCS3. Secondary finding: most of the IL-6 is secreted. Conclusions/Significance: Bacterial infection (LPS) or metabolic alterations (palmitate) have distinct effects on IL-6 expression in hBSMC, (i) short term LPS induced autocrine JAK/STAT signaling and (ii) long-term endocrine regulation of IL-6 by palmitate. Induction of IL-6 in human bladder smooth muscle cells by fatty acids may represent a pathogenetic factor underlying the higher frequency and persistence of urinary tract infections in patients with metabolic diseases.

Soft tissue sarcomas account for about 1% of all malignancies. The increase in incidence of soft tissue sarcomas during the recent decades may predominantly be attributed to AIDS-related Kaposi’s sarcoma; when this tumor is excluded, conclusive evidence for an age-adjusted increase is lacking. Beside the well investigated role of the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and the human herpesvirus 8 (HHV-8) in the tumorigenesis of AIDS-related Kaposi’s sarcoma and several inherited disorders, considerable evidence support a relationship between occupational chemicals as vinyl chloride, phenoxyacetic acid herbicides, chlorphenols, dioxin, medicinal measures as Thorotrast exposure and therapeutic irradiation, and the development of soft tissue sarcoma. Hormones and chronic repair processes are further probably sarcoma-promoting factors. Considering the rarity of soft tissue sarcomas despite the vast portion that soft tissues comprise in the human body, additional knowledge on the tumorigenesis of soft tissue sarcomas might considerably contribute to the understanding of the etiologic pathways of malignant tumors in humans. / Weichteilsarkome stellen etwa 1% aller bösartigen Neubildungen. Der in den vergangenen Jahrzehnten beobachtete Inzidenzanstieg geht fast ausschließlich auf die rasante Zunahme an AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkomen zurück. Bei Außerachtlassung dieses Tumors gibt es bisher keinen schlüssigen Beweis für eine wirkliche alterskorrigierte Häufigkeitszunahme der Weichteilsarkome. Neben der gut untersuchten Rolle des HIV-1-Virus und des humanen Herpes-Virus 8 bei der Entstehung des AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkoms und einigen prädisponierenden genetischen Erkrankungen existieren starke Hinweise für einen Zusammenhang zwischen Industriegiften wie Vinylchlorid, Phenoxyessigsäure-Herbiziden, Chlorphenolen, Dioxinen, medizinischen Maßnahmen wie therapeutischer Bestrahlung oder dem Einsatz von Thorotrast, und der Entwicklung von Weichteilsarkomen. Hormone und chronische Reparaturprozesse sind weitere wahrscheinlich fördernde Einflüsse auf die Entstehung von Weichteilsarkomen. Die Tatsache, daß trotz des großen Anteils, den die Binde- und Stützgewebe an der Körpermasse stellen, nur selten maligne Tumoren von diesen Strukturen ausgehen, läßt hoffen, daß ein besseres Verständnis der an der Kanzerogenese von Weichteilsarkomen beteiligten Mechanismen in der Zukunft wichtige Erkenntnisse über die Entstehung menschlicher Tumoren liefern kann. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Der Ersatz von geschädigtem Gewebe durch körpereigene Reparaturprozesse wird auf zellulärer Ebene durch Stammzellen unterstützt. Diese Regenerationsfähigkeit ist allerdings in einigen Geweben nur eingeschränkt vorhanden. So kommt es bei der Sehnenheilung des Pferdes unter konventioneller Therapie zur narbigen Reparation mit hohen Rezidivraten. Die Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine innovative Therapiemethode dar, da die tenogene Differenzierung zum Zellersatz mit anschließender Matrixmodulation führen könnte. Es ist jedoch unklar, ob eine entzündliche Umgebung in diesem Zusammenhang Einfluss auf funktionelle Eigenschaften der MSC hat. In dieser Arbeit wurden erstmalig funktionelle Eigenschaften, mit dem Fokus des tenogenen Differenzierungspotentials, von aus Fettgewebe isolierten equinen MSC, unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine und einer direkten Leukozyten-Ko-Kultur, untersucht. Es wurde ein komplexes In-vitro-Modell entwickelt, um die in vivo vorherrschenden Bedingungen bestmöglich zu berücksichtigen. Es konnte erstmals nachgewiesen werden, dass funktionelle und tenogene Eigenschaften von MSC in einem komplexen In-vitro-Modell unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen oder Leukozyten beeinträchtigt werden. Dies hebt die Notwendigkeit zur Untersuchung der komplexen Zusammenhänge während einer akuten Entzündungsreaktion hervor. Es bleibt zu klären, ob trotz der starken Beeinflussung der tenogenen Eigenschaften der vorherrschende Mechanismus der Stammzell-unterstützten Sehnenheilung die tenogene Differenzierung der MSC sein kann.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Multipotente mesenchymale Stromazellen 2.1.1 Eigenschaften 2.1.2 Quellen und Charakterisierung 2.1.3 Therapeutisches Potential 2.2 Pathologie der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Tiermodell Pferd 2.2.2 Erkrankungen der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.3 Die Bedeutung der Entzündungsreaktion 2.2.4 Die Bedeutung proinflammatorischer Zytokine und Leukozyten 2.3 Therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Sehnenpathologien 2.4 Sehnen-Tissue Engineering 2.5 Induktion der tenogenen Differenzierung von MSC 2.6 Bioreaktorsysteme im Sehnen-Tissue Engineering 3 Zielstellung und Hypothesen 4 Tiere, Material und Methoden 4.1 Mesenchymale Stromazellen 4.1.1 Tiere 4.1.2 Material 4.1.3 Methoden 4.1.3.1 Auftauen von AT-MSC 4.1.3.2 Kultivierung von AT-MSC 4.1.3.3 Passagieren von AT-MSC 4.2 Equine oberflächliche Beugesehnen 4.2.1 Material 4.2.2 Methoden 4.2.2.1 Gewinnung von equinen OBS 4.2.2.2 Dezellularisierung von equinen OBS 4.2.2.3 Zuschnitt zu Sehnenscaffolds 4.3 Leukozyten 4.3.1 Spendertier 4.3.2 Material 4.3.3 Methoden 4.3.3.1 Blutentnahme 4.3.3.2 Leukozytenisolierung durch Dichtegradientenzentrifugation 4.3.3.3 Leukozytenstimulation 4.4 Versuchsaufbau 4.5 Aussaat von Scaffold- und Monolayerkulturen 4.5.1 Material 4.5.2 Methoden 4.5.2.1 Monolayerkulturen 4.5.2.2 Scaffoldkulturen 4.6 Bioreaktor 4.7 Stimulation und Stimulationsmuster 4.8 Zugabe von Zytokinen 4.9 Auswertung 4.10 Phasenkontrastmikroskopie und Zellzahlbestimmung 4.10.1 Material 4.10.2 Methoden 4.10.2.1 Automatisierte Auswerung von Aufnahmen der Phasenkontrastmikroskopie 4.10.2.2 Zellzahlbestimmung 4.11 Lebend/Tot-Färbung 4.11.1 Material 4.11.2 Methoden 4.11.2.1 Lebend/Tot-Färbung der Monolayerkulturen 4.11.2.2 Lebend/Tot-Färbung der Scaffoldkulturen 4.11.2.3 Auswertung 4.12 Histologie 4.12.1 Material 4.12.2 Methoden 4.12.2.1 Fixierung und Paraffineinbettung 4.12.2.2 Mikrotomschnitte 4.12.2.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 4.12.2.4 Auswertung 4.13 Real-Time PCR 4.13.1 Material 4.13.2 Methoden 4.13.2.1 RNA-Isolierung aus Scaffoldkulturen 4.13.2.2 Zellaufschluss der Monolayerkulturen 4.13.2.3 cDNA-Synthese durch Reverse Transkription 4.13.2.4 Real-Time PCR 4.14 Tripotente Differenzierung 4.14.1 Material 4.14.2 Methoden 4.14.2.1 Zellaussaat, Kultivierung und Fixierung 4.14.2.2 Färbung der adipogenen Differenzierung 4.14.2.3 Färbung der osteogenen Differenzierung 4.14.2.4 Färbung der chondrogenen Differenzierung 4.14.2.5 Automatische Auswertung 4.15 Statistische Auswertung 5 Ergebnisse 5.1 Morphologie, Proliferation und Konfluenz der MSC 5.2 Lebend/Tot-Färbung 5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 5.4 Genexpression der muskuloskelettalen Marker 5.4.1 Monolayerkultur 5.4.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 5.4.3 Stimulierte Scaffoldkultur 5.4.4 Vergleichende Analyse der Versuchsreihen 5.5 Tripotente Differenzierung 5.5.1 Adipogene Differenzierung 5.5.2 Chondrogene Differenzierung 5.5.3 Osteogene Differenzierung 6 Diskussion 6.1 Diskussion der verwendeten Methoden 6.2 Diskussion der Ergebnisse 6.3 Schlussfolgerung 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Anhang 10.1 Herstellung von Reagenzien 10.2 RNA-Isolierung mittels RNeasy Mini Kit® 10.3 Färbeprotokolle 10.4 Herstellung von Silikonschalen 10.5 Extreme Ausreißerwerte der Genexpressionsanalysen 10.5.1 Monolayerkultur 10.5.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 10.5.3 Stimulierte Scaffoldkultur Danksagung