Einleitung: Bei Fohlen ist bisher wenig bekannt über die Eisenparameter im Blut. Das Spurenelement Eisen ist für Säugetiere essenziell, seine Hauptaufgabe ist der Sauerstofftransport. Adulte Pferde nehmen das benötigte Eisen mit dem Raufutter auf, welches in der Regel ausreichend hohe Eisengehalte aufweist. Das Hauptmolekül zur Eisenspeicherung ist Gewebe-Ferritin. Das im Serum vorkommende Serum-Ferritin spiegelt die Gesamteisenmenge des Körpers wider. Im Rahmen einer systemischen Entzündung sinkt der Serum-Eisenspiegel, da Eisen ins Gewebe umverteilt wird und in das Gebiet der Entzündung abwandert. Für die Parameter des Eisenstoffwechsels gibt es keine Referenzwerte für Fohlen, für adulte Pferde gibt es lediglich einen Referenzbereich für Serum-Eisen von 1,00-3,61 mg/l. Es gibt keine Studien, bei denen die Eisenparameter von Fohlen im Alter von ein bis sechs Monaten bestimmt wurden. Ziel der Studie: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Parameter des Eisenstoffwechsels im Serum bei akuter systemischer Entzündung bei ein bis sechs Monate alten Fohlen zu untersuchen. Außerdem sollte überprüft werden, inwiefern diese Veränderung des Eisenstoffwechsels zu einem Abfall der Serum-Eisenwerte führt. Tiere, Material und Methoden: In dieser prospektiven Studie wurden EDTA-Vollblut- und Serumproben von 66 gesunden Fohlen und 84 Fohlen mit einer akuten systemischen Entzündung in Form einer abszedierenden Bronchopneumonie genommen. Die Fohlen waren im Median 109 Tage alt. Die Diagnose 'Bronchopneumonie' wurde mittels Ultraschalldiagnostik gestellt, die Fohlen hatten am Tag der Probennahme einen sonografisch ermittelten Abszesscore von über 15 cm sowie eine rektal gemessene Körperinnentemperatur über 39,0 °C. Die gesunden Fohlen wiesen eine unauffällige klinische Allgemeinuntersuchung sowie Lungenultraschalluntersuchung am Tag der Probennahme sowie in der vorherigen und darauffolgenden Woche auf. Im Labor wurde der Serum-Amyloid-A-Gehalt bestimmt. Die gesunden Pferde wiesen SAA-Werte innerhalb des Referenzbereiches auf, bei den kranken Pferden bestätigte ein Wert > 7µg/ml die Diagnose einer akuten systemischen Entzündung. Aus der EDTA-Vollblutprobe wurde innerhalb von einer Stunde mittels Durchflusszytometrie die Blutleukozytenzahl bestimmt. Die Analyse der Serumproben erfolgte im Labor LABOKLIN mit dem Analysesystem Cobas 8000 von Roche. Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS (IBM Statistics 27). Die Daten der Gesamtpopulation (n = 150) waren nicht normalverteilt. Es wurde ein Mann-Whitney-U-Test als nicht parametrischer Test für zwei unabhängige Stichproben durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu ermitteln. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. Ergebnisse: Bei der Auswertung der Probanden ergab sich für die gesunden Fohlen ein medianer SAA-Wert von 3,50 µg/ml, der der kranken Fohlen liegt mit 541 µg/ml hochsignifikant darüber. Die Bestimmung des Serum-Ferritin-Wertes ergab für die Gruppe der gesunden Fohlen einen Median von 3,80 µg/l (IQR 2,00-4,40 µg/l), der Median für die Gruppe der kranken Fohlen ist mit 4,60 µg/l (IQR 2,48-6,40 µg/l) signifikant (p = 0,003) höher. Die Serum-Eisenwerte der gesunden Fohlen lagen innerhalb des laborinternen Referenzbereichs für adulte Pferde (Median 1,57 mg/l; IQR 1,21-1,79 mg/l), auch die weiteren Bluteisenwerte entsprachen denen adulter Pferde. Die kranken Fohlen zeigten signifikant niedrigere Serum-Eisenwerte (Median 0,550 mg/l; IQR 0,368-0,778 mg/l), signifikant höhere Ferritin- und UIBC-Werte sowie eine signifikant geringere Eisensättigung. Die Auswertung der Leberenzymaktivitäten aus dem Serum ergab für die kranken Fohlen bei allen gemessenen Parametern im Durchschnitt niedrigere Werte als für die gesunden Fohlen. Bei dem Spurenelement Kupfer liegt der Median der gesunden Fohlen mit 18,8 µmol/l (IQR 16,4-20,1 µmol/l) im oberen Bereich der Referenzwerte von 7,9-21 µmol/l, der Median der kranken Fohlen liegt mit 25,7 µmol/l (IQR 23,1-29,0 µmol/l) signifikant über den Werten der gesunden Fohlen (p < 0,001). Schlussfolgerung: Durch eine akute systemische Entzündung kommt es zu einem Abfall des Serum-Eisens durch Umverteilung ins Gewebe und Abwanderung ins Entzündungsgebiet. Da es jedoch sowohl in der Literatur als auch in den Ergebnissen dieser Studie keine Hinweise auf einen absoluten Eisenmangel beim Fohlen gibt, sollte von einer Eisensupplementation in jedem Fall abgesehen werden.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Vorkommen und chemische Eigenschaften von Eisen 2 2.2 Eisenmetabolismus 2 2.2.1 Absorption 2 2.2.2 Transport 3 2.2.3 Speicherung, Mobilisierung 4 2.2.4 Exkretion, Verlust 5 2.3 Physiologische Funktionen 6 2.4 Feststellung des Eisenstatus 7 2.5 Eisenbedarf des Pferdes 9 2.6 Eisengehalt von Futtermitteln 10 2.7 Eisenmangel 11 2.8 Supplementation von Eisen 12 2.9 Eisenüberschuss, Toxizität 12 2.10 Bakterieller Eisenstoffwechsel 13 2.11 Entzündung 14 2.11.1 Abszedierende Bronchopneumonie 15 2.12 Eisenstoffwechsel bei systemischer Entzündung 16 2.12.1 Ferritin als Akute-Phase-Protein 17 2.12.2 Serum-Eisen als Entzündungsmarker 17 3 Publikation 19 3.1 Vergleich des Eisenstatus im Serum von gesunden Fohlen und Fohlen mit Bronchopneumonie 19 4 Diskussion 30 5 Zusammenfassung 34 6 Summary 36 7 Literaturverzeichnis 38 Danksagung 47 / Introduction: Little is known about iron parameters in the blood of foals. The trace element iron is essential for mammals, its main task is the transport of oxygen. Horses take up the required iron with roughage, which has sufficiently high iron contents. The main molecule for iron storage is tissue ferritin. The serum ferritin found in the serum reflects the total amount of iron in the body. In the context of systemic inflammation, serum iron levels decrease as iron is redistributed to the tissues and migrates to the area of inflammation. There are no reference values for the parameters of iron metabolism for foals, for adult horses there is only a reference range for serum iron from 1.00-3.61 mg/L. There are no studies in which the iron parameters of foals were determined at the age of one to six months. Aim of the study: The aim of the present work was to investigate the parameters of serum iron metabolism in acute systemic inflammation in one- to six-month-old foals. In addition, it was to be determined to what extent this change in iron metabolism leads to a drop in serum iron levels. Animals, material, and methods: In this prospective study, EDTA whole blood and serum samples were collected from 66 healthy foals and 84 foals with acute systemic inflammation in the form of abscessed bronchopneumonia. The median age of the foals was 109 days. The diagnosis 'bronchopneumonia' was made by ultrasound diagnosis, the foals had a sonographically determined abscess score of more than 15cm as well as a rectally measured internal body temperature of more than 39.0 °C on the day of sampling. The healthy foals had an unremarkable clinical general examination and lung ultrasound on the day of sampling and in the previous and following week. In the laboratory, the serum amyloid A content was determined, a value > 7µg/mL confirmed the diagnosis of acute systemic inflammation. From the EDTA whole blood sample, the blood leucocyte count was determined within one hour by flow cytometry. The serum samples were analyzed in the LABOKLIN laboratory using the analyzer Cobas 8000 from Roche. Statistical analysis of the data was performed with SPSS (IBM Statistics 27). The data of the total population (n = 150) were not normally distributed. A Mann-Whitney U test was performed as a non-parametric test for two independent samples to determine significant differences between the groups. The significance level was set at p < 0.05. Results: The evaluation of the blood samples showed a median SAA level of 3.50 µg/mL for the healthy foals, the median of 541 µg/mL for the sick foals was significantly higher than in healthy foals. The determination of serum ferritin showed a median of 3.80 µg/l (IQR 2.00-4.40 µg/l) for the group of healthy foals, the median for the group of sick foals was significantly (p = 0.003) higher at 4.60 µg/l (IQR 2.48-6.40 µg/l). The serum iron values of the healthy foals were within the laboratory reference range for adult horses (median 1.57 mg/l; IQR 1.21-1.79 mg/l). The other blood iron values also corresponded to those of adult horses. The sick foals showed significantly lower serum iron levels (median 0.550 mg/l; IQR 0.368-0.778 mg/l), significantly higher ferritin and UIBC levels and significantly lower iron saturation. The evaluation of liver enzyme activities from the serum showed lower values on average for the sick foals than for the healthy foals for all measured parameters. For the trace element copper, the median of the healthy foals with 18.8 µmol/l (IQR 16.4-20.1µmol/l) is in the upper range of the reference values of 7.9-21µmol/l, the median of the sick foals with 25.7 µmol/l (IQR 23.1-29.0 µmol/l) is significantly higher than the values of the healthy foals (p < 0.001). Conclusion Acute systemic inflammation causes a drop in serum iron due to redistribution into the tissues and migration into the area of inflammation. However, since there is no evidence of an absolute iron deficiency in foals, either in the literature or in the results of this study, iron supplementation should be avoided in any case.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Vorkommen und chemische Eigenschaften von Eisen 2 2.2 Eisenmetabolismus 2 2.2.1 Absorption 2 2.2.2 Transport 3 2.2.3 Speicherung, Mobilisierung 4 2.2.4 Exkretion, Verlust 5 2.3 Physiologische Funktionen 6 2.4 Feststellung des Eisenstatus 7 2.5 Eisenbedarf des Pferdes 9 2.6 Eisengehalt von Futtermitteln 10 2.7 Eisenmangel 11 2.8 Supplementation von Eisen 12 2.9 Eisenüberschuss, Toxizität 12 2.10 Bakterieller Eisenstoffwechsel 13 2.11 Entzündung 14 2.11.1 Abszedierende Bronchopneumonie 15 2.12 Eisenstoffwechsel bei systemischer Entzündung 16 2.12.1 Ferritin als Akute-Phase-Protein 17 2.12.2 Serum-Eisen als Entzündungsmarker 17 3 Publikation 19 3.1 Vergleich des Eisenstatus im Serum von gesunden Fohlen und Fohlen mit Bronchopneumonie 19 4 Diskussion 30 5 Zusammenfassung 34 6 Summary 36 7 Literaturverzeichnis 38 Danksagung 47

Es wird vermutet, dass das Zusammenspiel von NF-κB-Signalen und Autophagie die Entzündung in verschiedenen zellulären Kontexten und als Reaktion auf unterschiedliche Stimuli reguliert. Der molekulare Mechanismus, durch den diese beiden Signalwege bei der Regulierung der Entzündungsreaktion zusammenwirken, ist jedoch noch nicht bekannt. Mithilfe biochemischer Analysen und bildgebender Verfahren haben wir zum ersten Mal die Interaktion zwischen dem autophagischen Marker LC3 und der NF-κB/p65-Untereinheit als Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass die Anhäufung von LC3 im Zellkern nach der NF-κB-Aktivierung mit p65 interagiert, was durch die Ubiquitinierung des p65-Proteins gefördert und durch den Cargo-Rezeptor p62 erkannt wird. Zusammengenommen weisen diese Daten auf eine neue Rolle von p62 beim Transport von im Kern ubiquitiniertem p65 zu Autophagosomen hin, wo es abgebaut wird, um die entzündungsbedingte NF-κB-Hyperaktivierung zu kontrollieren. Diese Erkenntnisse sind wichtig für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen Krankheiten, die mit einer gestörten Autophagie und einer konstitutiven NF-κB-Aktivität einhergehen. Die NF-κB-Signalübertragung spielt nicht nur eine entscheidende Rolle bei Entzündungen und der Tumorbildung, sondern ist auch für Entwicklungsprozesse wichtig. Durch die Etablierung von 3D-Organoid-Kulturen aus dem Dünndarm und unter Verwendung verschiedener Mauslinien weisen wir im zweiten Teil der Arbeit nach, dass NF-κB eine wichtige Funktion bei der Zelldifferenzierung und der Erhaltung von Stammzellen in vivo und ex-vivo spielt. Wir konnten zeigen, dass die Proliferation und das Absterben von Darmepithelzellen (IEC) bei Mäusen mit ubiquitärer Unterdrückung der NF-κB-Aktivität unverändert sind, während die Zahl der Becherzellen auf Kosten der Paneth-Zellen zunimmt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Ergebnisse eine neue IEC-immanente Rolle von NF-κB bei Entscheidungen über das Zellschicksal und die Differenzierung aufzeigen, die über die Regulierung der Wnt-Signale und der Sox9-Expression stromabwärts von NF-κB erfolgt. Die hier beschriebenen Erkenntnisse verbessern unser Verständnis der NF-κB-Funktionen in der Stammzellbiologie, die, wenn sie dereguliert sind, auch Auswirkungen auf die Entzündung des Darms und die Tumorentstehung haben. / The interplay between NF-κB signaling and autophagy has been suggested to regulate inflammation in different cellular contexts and in response to different stimuli. However, the molecular mechanism by which these two pathways interact to regulate the inflammatory response remains elusive. By using biochemical analysis and imaging techniques, we characterized for the first time the interaction of autophagic marker LC3 and NF-κB/p65 subunit in response to different stress conditions. We demonstrated that the accumulation of LC3 within the nucleus interacts with p65 following NF-κB activation, which is promoted by ubiquitination of p65 protein and recognized by the cargo receptor p62. Together, these data identify a novel role for p62 in trafficking nuclear-ubiquitinated p65 to autophagosomes for degradation to control inflammation-driven NF-κB hyperactivation. These findings are important for developing novel therapeutic strategies against diseases involving defective autophagy and constitutive NF-κB activity. In addition to its critical role in inflammation and tumor formation, NF-κB signaling is essential in developmental processes. Establishing 3D organoid culture from the small intestine and using different mouse lines, we prove in the second part of the thesis that NF-kB plays an important function in cell differentiation and stem cell maintenance in vivo and in ex-vivo. We demonstrated that while intestinal epithelial cell (IEC) proliferation and death are unaltered in mice with ubiquitous suppression of NF-κB activity, goblet cell numbers increase at the expense of Paneth cells. In summary, our results revealed a novel IEC-intrinsic role of NF-κB in cell fate decisions and differentiation which occur via regulation of Wnt signaling and Sox9 expression downstream of NF-κB. The findings described here improve our understanding of NF-κB functions in stem cell biology which, when deregulated, also have an impact on intestinal inflammation and tumorigenesis.

Die vorliegende Habilitationsschrift faßt publizierte Ergebnisse zum Themenschwerpunkt der Immunszintigraphie mit Antigranulozyten-Antikörpern bzw. Antikörperfragmenten zur Entzündungsdiagnostik bei Problemindikationen und zur Knochenmarkszintigraphie zusammen. In der Diagnostik der subakuten Endokarditis und der Prothesenendokarditis ermöglichen Immunszintigraphie mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper und die transösophageale Echokardiographie zusammen einen zuverlässigen Entzündungsnachweis auch bei denjenigen Patienten, bei denen jeweils eine der beiden Methoden versagt. Bei Patienten mit Fieber unbekannter Genese ist die Immunszintigraphie der Sonographie und dem CT im frühen Nachweis abdomineller Abszesse überlegen. Bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen stellt der szintigraphische Ausschluß entzündlicher Herde eine wichtige Information auf dem Weg zur Diagnose einer seronegativen Autoimmunerkrankung dar. Schließlich erlaubt die Immunszintigraphie mit differenzierter Betrachtung photopenischer Läsionen im hämopoetisch aktiven Knochenmark bei Patienten mit einer metastasierenden neoplastischen Erkrankung als Fieberursache einen frühen Nachweis maligner Knochenmarkherde. Für die Diagnostik entzündlicher Darmerkrankungen sind die immunszintigraphischen Verfahren mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper und mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment wegen bei beiden Methoden vorliegender unspezifischer Darmaktivität und fallweise beobachteter, falsch negativer Ergebnisse nicht geeignet. Bei Patienten mit Low-grade-Entzündungen der Knochen und Gelenke und vorangegangenen Gelenkoperationen weist die Immunszintigraphie mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment eine überaus hohe Sensitivität, jedoch geringe Spezifität auf. Der klinische Nutzen dieser Immunszintigraphie könnte im Nachweis oder Ausschluß einer Low-grade-Entzündung im untersuchten Gelenk bei Patienten mit rheumatoider Arthritis oder anderen, zeitgleich vorliegenden Entzündungen außerhalb des Gelenkes liegen. In der Knochenmarkdiagnostik mittels der Immunszintigraphie mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper wurde eine hoch signifikante inverse Korrelation des Uptake-Index mit dem Alter der Probanden festgestellt. Bei Patienten mit Panzytopenie war der Uptake-Index im Vergleich zum altersentsprechenden Normalkollektiv signifikant erniedrigt und wies eine hohe Trennschärfe gegenüber dem Normalbereich auf. Als Alternative zum NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper untersuchten wir die Immunszintigraphie mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment in der Knochenmarkdiagnostik. Das Verfahren gestattet jedoch nur eine qualitative, unvollständige Darstellung einiger Areale hämopoetisch aktiven Knochenmarks, während der Fab'-Knochenmark-Uptake-Index für die klinische Anwendung nicht brauchbar ist. / The present habilitation thesis summarises the author´s own published results on the thematic focus of immunoscintigraphy using antigranulocyte antibodies or antibody fragments for diagnosing infection in problematic indications and for bone marrow scintigraphy. In diagnosing subacute infective endocarditis and prosthetic valve endocarditis the combined application of both immunoscintigraphy using the NCA-95-antigranulocyte antibodies and transesophageal echocardiography reliably proves infection even in patients with negative results in one of the methods applied. In patients with fever of unknown origin immunoscintigraphy is superior to both sonography and CT in the early detection of abdominal abscesses. In patients suffering from autoimmune diseases the scintigraphic exclusion of infection is an important step towards verifying a serologically negative autoimmune disease. Finally, immunoscintigraphy with differentiated analysis of photopenic lesions in the haemopoietically active bone marrow allows an early detection of malignant marrow involvement in patients with metastasising neoplastic disease. Immunoscintigraphy with either NCA-95-antigranulocyte antibodies or NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragments is not suitable for diagnosing inflammatory bowel disease because of nonspecific bowel activity encountered in either method and because of falsely negative results observed occasionally. In patients with low-grade bone-and-joint infection and previous joint surgery immunoscintigraphy using the NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragment is highly sensitive but lacks specificity. The clinical benefit of this method might consist of proving or excluding low-grade infection in the investigated joint in patients suffering from rheumatoid arthritis or other, contemporaneous inflammation outside of the joint under investigation. In investigating bone marrow diseases with the help of immunoscintigraphy using NCA-95-antigranulocyte-antibodies a highly significant inverse correlation of the uptake index with patient age was observed. In patients with pancytopenia the uptake index was significantly lower than in an age-matched normal group and displayed a clear-cut differentiation from the normal uptake range. The NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragment was investigated as an alternative to the NCA-95-antigranulocyte-antibody in diagnosing bone marrow disease. However, this method allows just a qualitative, incomplete evaluation of certain bone marrow regions, while the Fab´ uptake index is not suitable for clinical use.

Hintergrund: Abdominale Adhäsionen entstehen vor allem durch Operationen. Sie können ernste Beschwerden auslösen, wie Dünndarmileus, Infertilität und chronische Schmerzen. Eine allgemein anerkannte Prophylaxe und/oder Therapie existiert trotz intensiver Forschung nicht. Steigende Lebenserwartung und erweiterte Operationsindikationen verschärfen das Problem. Ziel: Diese Studie soll zeigen, dass der Angiogeneseinhibitor Thalidomid postoperative Verwachsungen im Tiermodell hemmt ohne die Wundheilung zu gefährden. Methoden: 40 New Zealand White Kaninchen wurden bei einem operativen Eingriff einmalig intraperitoneal mit Thalidomid oder einem Placebo behandelt. Nach drei oder sieben Tagen wurden die Tiere erneut operiert. Danach wurden Adhäsionsbildung und Angiogenese beurteilt. Von TNF-alpha, einem wichtigen Mediator für Adhäsionen, wurden die Serumspiegel ermittelt. Die Wundheilung wurde durch visuelle Inspektion sowie durch Bestimmung von Berstungsdruck und –stelle kontrolliert. Ergebnisse: Thalidomid hemmt postoperative Adhäsionen. In der Therapiegruppe hatten 75 Prozent der Tiere keine und 25 Prozent minimale Adhäsionen. In der Kontrollgruppe dagegen traten bei knapp 50 Prozent der Tiere mäßige oder dichte Adhäsionen auf. Drei Mechanismen scheinen für die adhäsionsinhibierende Wirkung von Thalidomid verantwortlich zu sein: Hemmung der Angiogenese, Modulation der Fibrinolyse und Reduzierung der Entzündungsreaktion. Das Operationsergebnis gefährdet Thalidomid nicht. Bei der Inspektion wiesen alle Kaninchen regelgerechte Wundverhältnisse auf. Die ermittelten Berstungsdrücke und -stellen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Therapie- und Kontrollgruppe. Schlussfolgerungen: Wegen der entscheidenden Rolle der Angiogenese für die Wundheilung, aber auch wegen der teratogenen Effekte von Thalidomid, muss die adhäsionsinhibierende Wirkung von Thalidomid vor einem klinischen Einsatz in weiteren Tierversuchen verifiziert werden. Überprüft werden sollte dabei, ob neben den drei diskutierten Mechanismen, weitere vor allem immunmodulatorische Prozesse die Adhäsionshemmung bewirken. / Background: Abdominal adhesions mainly result from surgery. They can cause severe trouble like small bowel obstruction, female infertility and chronic pain. A generally recognised prevention and/or therapy does not exist despite intensive research. Increasing life expectancy and a wider range of indications for operations make matters worse. Objective: The purpose of the study is to demonstrate that the angiogenesis inhibitor thalidomide inhibits postsurgical adhesions in an animal model without impacting wound healing. Methods: 40 New Zealand White rabbits were treated once in an operation intraperitoneal with either thalidomide or with a placebo. After three or seven days the animals again underwent an operation. Thereafter the adhesions formation and angiogenesis was assessed. The level of TNF-alpha, an important mediator for adhesions, in blood was measured. The wound healing was controlled by visual inspection and the determination of the bursting pressure und location. Resuts: Thalidomid inhibits postsurgical adhesions. In the therapy sample 75 per cent of the animals had no and 25 per cent had minimal adhesions. In the control sample almost 50 per cent of the animals had moderate or dense adhesions. Three mechamisms appear to be responsible for thalidomide to inhibit adhesions: the inhibition of the angiogenesis, the modulation of the fibrinolysis and the reduction of the inflammation. The result of the operation was not impacted by thalidomide. All rabbits showed normal wound healing. The bursting pressure and location did not differ significantly between the therapy and the control sample. Conclusions: Because of the importance of the angiogenesis for wound healing as well as the teratogenic effects of thalidomide, thalidomide must be further analysed in animal tests before being applied in clinical practice. As part of this it should be examined whether in addition to the three mechansims discussed, other proceeses, in particular immune modulating processes contribute to inhibit adhesions.

Die Pathogenese der Hypertonie und der Arteriosklerose sind multifaktorieller Prozesse, welche die Interaktion von genetischen und Umweltfaktoren involviert. Die molekularen Mechanismen an den Gefäßen sind ähnlich, jedoch nicht im Detail verstanden. Bei beiden Gefäßerkrankungen ist das Endothel der zentrale Angriffspunkt, der zu einer chronischen Entzündungsreaktion führt, ist. Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB ist der Hauptschalter bei der Aktivierung der Gene, die zu der Aktivierung von Leukozyten und zu der Entwicklung der Entzündungsreaktion führen. Die hier aufgezeigten Untersuchungen befassen sich mit dieser Problematik und sind in 4 Teilprojekte gegliedert. Teilprojekt 1 befasst sich mit der physiologischen Funktion von Bcl-3, einem Mitglied der IkappaBalpha Familie. Da über die Funktion von Bcl-3 wenig bekannt ist, sollte mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid Systems neue Interaktionspartner identifiziert werden. Insgesamt würden fünf Proteine identifiziert, die alle binäre Komplexe in vitro (Co-Immunopräzipitation und GST-puldown) und im Yeast-Two-Hybrid bilden. Wir konnten zeigen, dass Bcl-3 mit den Ankyrin Repeats zur gleichen Zeit mit (mindestens) zwei Proteinen interagieren kann. Die endogene Aktivität von p50/Bcl-3 Komplexe wird durch die Transfektion der Interaktionspartner gesteigert. Den größten Effekt hat dabei Jab1. In transienten Transfektionen modulieren Jab1, Tip60, Bard1 und Pirin modulieren die Transkriptionsaktivität von Bcl-3 in verschiedenen Zellinien und mit verschiedenen Reporterkonstrukten. Den stärksten aktivierenden Effekt auf p50/Bcl-3 übt Tip60 aus. Tip60, Jab1 und Pirin können ebenfalls in vivo mit Bcl-3 co-immunoprezipitiert werden, wenn beide Proteine transient transfiziert werden. Auf Grund dieser Ergebnisse spekulieren wir, dass Bcl-3 eine Adapterfunktion ausübt, die NF-kappaB p50/p52 mit anderen Transkriptionsfaktoren (NF-1, c-jun, thyroid rezeptor, HIV-Tat) bzw. basalen Transkriptionsfaktoren (Histonacetylasen, RNA Polymerasen) verbindet. Teilprojekt 2 hat sich mit neuen Risikofaktoren für die koronare Herzerkrankung beschafft. Es gibt Hinweise, dass ein infektiöses Agens neben etablierten Risikofaktoren ursächlich an der Pathogenese und Progredienz der Arteriosklerose beteiligt ist. Unter den möglichen Erregern haben Untersuchungen der letzten Jahre gezeigt, dass Chlamydia pneumoniae das infektiöse Agens sein könnte. Infektion mit C. pneumoniae führte zu einer Aktivierung von pro-koagulatorischen Faktoren (Tissue Faktor und PAI-1) und Zytokinen (Interleukin 6). vermehrt expremiert werden. Wir konnten zudem eine vermehrte membranständige Expression von Rho-A und Rac-1 nachweisen, welche durch Statine gehemmt wurde. Zudem zeigte sich eine vermehrte Sauerstoffradikalfreisetzung nach Infektion mit C.pneumoniae. Die untersuchten Faktoren werden durch den Transkriptionsfaktor NF-kappaB reguliert, der ebenfalls nach Infektion induziert wurde. IkappaBalpha wurde degradiert. Alle Prozesse wurden durch Zugabe von Statinen reduziert. Wir zeigen einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch eine C. pneumoniae Infektion das lokale Milieu in der arteriosklerotischen Plaque derart verändert wird, dass Prozesse gefördert werden, die zu einer instabilen Koronarsituation führen können. Ziel des Teilprojekts 3 war es, neue molekulare Mechanismen bei der Pathogenese Angiotensin II-vermittelter Endorganschäden herauszufinden. Wir haben dazu ein transgenes Tiermodell (dTGR) untersucht, welches das humane Renin- und Angiotensinogen-Gen überexprimiert und 3 bis 5-fach erhöhte Ang II-Spiegel aufweist. Ang II stimulierte die Transkriptionsfaktoren NF-kappaB und AP-1, sowie von ihnen regulierte pro-entzündliche Proteine. Wir sind der Hypothese nachgegangen, ob Entzündungsreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese spielen könnten. Sowohl anti-entzündliche Inhibitoren, wie Aspirin in hoher Dosierung, die die Aktivierung von NF-kappaB verhindern, verringerten die Organschäden. Pleiotrope Eigenschaften des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers Cerivastatin verminderten, cholesterinunabhängig, die Organschädigung. Auch hier ist der zu Grunde liegende Mechanismus eine Hemmung der Ang II induzeirten Entzündungsreaktion. Teilprojekt IV befasst sich mit der Präeklampsie, einer schwangerschaftsspezifischen Erkrankung, die durch das erstmalige Auftreten von arterieller Hypertonie und Proteinurie nach der 20. Schwangerschaftswoche charakterisiert ist. Die Präeklampsie ist unverändert eine der häufigsten Ursachen für mütterliche und kindliche Morbidität und Mortalität. Wir haben festgestellt, dass Schwangere mit Präeklampsie spezifische, agonistische Antikörper gegen den Angiontensin-II-AT1-Rezeptor (AT1-AA) entwickeln. Dieser Autoantikörper ist gegen die zweite extrazelluläre Schleife des AT1-Rezeptors gerichtet. Wir konnten zeigen, dass AT1-AA eine Aktivierung von NF-kappaB und AP-1 bewirken. Zudem konnten wir nachweisen, das vermehrt reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induziert werden und dass dieser Prozess über die NADPH-Oxidase vermittelt ist. Auch konnten wir zeigen, dass die Expression der NADPH oxidase durch den AT1-AA induziert wird. Präeklamptische Plazenten weisen eine stärkere Produktion von ROS und eine vermehrte Expression der NADPH oxidase auf als gesunde Kontrollplazenten. Die Autoantikörper könnten einen wesentlichen endothelialen Schädigungsmechanismus bei Präeklampsie darstellen. Die konsekutive Aktivierung von NF-kappaB und AP-1 eine wichtige, mögliche Ursache, dass eine chronische vaskuläre Entzündungsreaktion iniitiert und unterhalten wird. / Atheroscleosis and hypertension are considered to be a complex process involving the interaction of genetic and environmental factors and the interplay between several cell types. Besides established risk factors for atherosclerosis and hypertension induced vascular pathology, chronic inflammation is regarded as a key event in the pathogenesis. The transcription factor family NF-kappaB is a key regulator of abroad rage of genes involved in inflammatory processes, proliferation and apoptosis. Aim of the investigations is to identify molecular mechanisms in vascular biology in order to understand pathophysiological vascular processes. The investigations are divided into 4 projects In project 1 we tried to identify the physiological role of the proto-oncoprotein Bcl-3, which is a member of the IkappaB family,. To gain insight into specific nuclear functions of Bcl-3 we have isolated proteins that interact with its ankyrin repeat domain. Using the yeast two-hybrid-system we identified four novel binding partners of Bcl-3 in addition to NF-kappaB p50 and p52, previously known to associate with Bcl-3. The novel Bcl-3 interactors Jab1, Pirin, Tip60 and Bard1 are nuclear proteins which also bind to other transcription factors including c-Jun, nuclear factor I (NFI), HIV-1 Tat or the tumor suppressor and PolII holoenzyme component Brca1, respectively. Bcl-3, p50, and either Bard1, Tip60 or Pirin are sequestered into quarternary complexes on NF-kappaB DNA binding sites, whereas Jab1 enhances p50-Bcl-3-DNA complex formation. Furthermore, the histone acetylase Tip60 enhances Bcl-3-p50 activated transcription through an NF-kappaB binding site, indicating that quarternary complexes containing Bcl-3 interactors modulate NF-kappaB driven gene expression. These data implicate Bcl-3 as an adaptor between NF-kappaB p50/p52 and other transcription regulators and suggest that its gene activation function may at least in part be due to recruitment of the Tip60 histone actetylase. Project 2 concentrated on investigating novel mechanism in arteriosclerosis. Recent reports link C. pneumoniae infection of arteriosclerotic lesions to the precipitation of acute coronary syndromes, which also feature tissue factor and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) overexpression. We investigated whether or not C. pneumoniae can induce thrombogenicity by upregulation of procoagulant proteins. Human vascular endothelial and smooth muscle cells were infected with a strain of C. pneumoniae isolated from an arteriosclerotic coronary artery. Tissue factor, PAI-1, and interleukin-6 expression was increased in infected cells. Western blotting We could show, that C.pneumoniae infection resulted in increased cell membrane-associated RhoA and Rac1, implying increased prenylation of these proteins. This effect was blocked by statin but circumvented by mevalonate. Cytochrome C assays showed that infected VSMCs produced increased reactive oxygen species that was blocked by statin. Infection increased nuclear transcription factor-kappaB expression in VSMCs that was dose-dependently suppressed by statin. Infected VSMCs produced and released RANTES and MCP-1. Statin dose-dependently blocked this production both at the mRNA and protein levels. These data provide evidence that C. pneumoniae infection can induce procoagulant protein and proinflammatory cytokine expression. This cellular response is accompanied by activation of NF-kappaB. Our results demonstrate how C. pneumoniae infection may initiate acute coronary syndromes. In project 3 we investigated molecular mechanism in Angiotensin II induced endorgan cardiovascular endorgan damage. Therefore we established a double transgenic rat (dTGR) model, in which rats transgenic for the humanangiotensinogen and renin genes are crossed. We show evidence that Ang II stimulates NF-kappaB and AP-1, which are involved with initiating chemokine and cytokine expression, leading to the above cascade in this model. Various pharmacological, such as the endothlin-1 receptor blocker bosentan, the immunosuppressant cyclosporin, the NF-kappaB inhibitor PDTC, the aldosteron antagonist spironolactone all ameliorated the ANG II-induced end-organ damage. However, all inhibitors were able to reduce NF-kappaB activation and inflammation. Stain also reduced cholesterol-independent the cardiovascular endorgan damage in dTGR. The pleiotrophic effects of statins reduced NF-kappaB and AP-1 activity, indicating that the local Angiotensin II induced inflammatory reaction is the key event in initiating the endorgan damage. Project 4 is focused on preeclampsia. Preeclampsia occurs after the 20th week of gestation and features hypertension and an increased peripheral vascular resistance; the mechanisms are unknown. The is a major cause of maternal and fetal morbidity We recently described autoantibodies (AT1-AA) directed at the AT1 receptor in the serum of preeclamptic patients, whose placentas are commonly infarcted and express tissue factor (TF). We proved AT1-AA specificity by coimmunoprecipitating the AT1 receptor with AT1-AA but not with nonspecific IgG. Angiotensin (Ang) II and AT1-AA both activated extracellular signal-related kinase, AP-1, and the TF promoter transfected VSMC and Chinese hamster ovary cells, but only when the AP-1 binding site was present. We then demonstrated TF expression in VSMC exposed to either Ang II or AT1-AA. All these effects were blocked by losartan. Nonspecific IgG or IgG from nonpreeclamptic pregnant women had a negligible effect. AT1-AA increased ROS production and the NADPH oxidase components, p22, p47, and p67 phox in Western blotting. AT1-AA activated NF-kappaB. IkappaBalpha expression was reduced in response to AT1-AA. The p22, p47, and p67 phox expression in placentas from preeclamptic patients was increased, compared with normal placentas. Furthermore, NF-kappaB was activated in placentas from preeclamptic women. We conclude that AT1-AA and Ang II both stimulate the AT1 receptor and initiate a signaling cascade resulting in TF expression. NADPH oxidase is potentially an important source of ROS that may upregulate NF-kappaB in preeclampsia These results show an action of AT1-AA on human cells that could contribute to the pathogenesis of preeclampsia. We suggest that AT1-AA through activation of NADPH oxidase could contribute to ROS production and inflammatory responses in preeclampsia.

Malaria ist die Erkrankung, die durch Infektion eines Säugetiers mit dem eukaryotischen Parasiten Plasmodium entsteht. Die Symptome dieser Erkrankungen reichen von Fieber und Gelenkschmerzen bis zu schweren Organschäden in Hirn, Lunge, Niere und Leber bei einem geringen Teil der Erkrankten. Diese klinischen Symptome treten nur auf, während der Parasit sich asexuell in roten Blutzellen vermehrt. Die Zerstörung von Erythrozyten und die daraus resultierende Freisetzung von Zytokinen sind die Verursacher der malariatypischen wiederkehrenden Fieberzyklen. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Gewebsschäden führt, ist hingegen nur unzureichend bekannt. Eine notwendige Bedingung für das Auftreten von Gewebeschäden ist, dass infizierte rote Blutzellen an das Endothel der Mikrovaskulatur bin. Die Schwere der Erkrankung ist direkt mit dem extrazellulären Auftreten von Stoffen verbunden, die normalerweise von neutrophilen Granulozyten im Zellinnern gespeichert werden. Neutrophile sind dafür bekannt sind, ein ganzes Arsenal an Waffen bereitwillig durch Degranulierung oder programmierten Zelltod einzusetzen. In dieser Studie berichten wir von einem direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem aktiven inflammatorischen Zelltod (NETose) von Neutrophilen und der Entstehung von Organschäden bei einer Plasmodium-Infektion. Wir zeigen, dass NETs in Zirkulation freigesetzt und von extrazellulären DNase verdaut werden. Dadurch werden systemisch Aktivierungssignale für eine weitere Immunantwort zur Verfügung gestellt und es kommt zur Freisetzung von Zytokinen, Notfallgranulopoese und der Hochregulierung von zellulären Adhäsionsmarkern auf Endothelzellen. Dies erlaubt das Binden von infizierten Erythrozyten und Immunzellen an die Mikrovaskulatur bestimmter Organe. Wir zeigen außerdem, dass eine Intervention mit der Entstehung von NETs oder der Freisetzung neuer Neutrophiler diesen Prozess unterbindet und einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz darstellt. / Malaria is the disease caused by an infection of a mammalian host by the mosquito borne eukaryotic parasite Plasmodium. The symptoms of the disease are diverse, ranging from fever and rigor in most patients to severe damage in solid organs such as brain, lung, kidney and liver in a small fraction of the afflicted. Clinical symptoms of the disease only occur when the parasite undergoes asexual replication within the red blood cells of the host. Destruction of these cells and subsequent release of cytokines are responsible for the recurring fever cycles of mild malaria. The mechanism underlying the occurrence of tissue damage however, remain mostly elusive. The adhesion of infected red blood cells to the endothelial wall of the microvasculature in the affected organs is a necessary requirement and pathology is associated with the activation of specific immune cells residing within the blood stream. Severity of disease is linked to extracellular accumulation of neutrophil proteins. Neutrophils are abundant white blood cells, known to readily deploy an arsenal of weaponry either by degranulation or by externalization of chromatin. In this study we report a direct causal relationship between the active inflammatory neutrophil cell death (NETosis) and the development of organ damage during a Plasmodium infection. We show that NETs are released in circulation, digested by extracellular DNase and thereby supply immune activation signals that drive inflammation. The systemic dissemination of these factors leads to the release of cytokines, emergency granulopoiesis and upregulation of cellular adhesion markers on endothelial cells thereby allowing for the binding of both infected red blood cells and immune cells to the microvasculature of specific organs. Furthermore we supply evidence, that repression of NETosis or inhibition of granulopoiesis abrogate these processes and present promising therapeutic strategies.

Inflammation causes a plethora of diseases, putting an immense burden on patients, society and health care providers. A majority of these diseases can still not be treated satisfactorily. Nevertheless, inflammation exhibits, often tissue- and disease-specific, hallmarks that can be targeted for diagnosis and therapy. Depicting and identifying these sites of inflammation not only enables scientific examination but can also enable functional imaging and stratification of patients. Therefore, within the scope of this work, the first CXCR2-PET tracer has been developed for the functional imaging of neutrophils, utilising Fluorine-18 as radionuclide and squaramide ligands as molecular platform for target addressing. Several fluorinated “cold” ligands were synthesised and tested for their affinity to hCXCR2. For the most promising candidate 29b, an indirect labelling procedure was developed. The resulting PET-radiotracer [18F]29b showed specific time-dependent binding to CXCR2 in HEK cells and human neutrophils. Initial rat biodistribution studies and dynamic PET/CT imaging indicated good renal clearance and metabolic stability of [18F]29b. Neuroinflammation describes the inflammatory response of the CNS, in which reactive microglia play a major role in neurodegeneration. To address neuroinflammation and therefore neurodegeneration therapeutically, BChE/CB2R hybrid ligands, as well as BChE-selective ligands have been designed and synthesised. BChE is able to surrogate for AChE. Additionally, its inhibition or KO has been connected to neuroprotective properties in vivo and is therefore an important target for the treatment of neurodegenerative diseases such as AD. While BChE will probably become a key player in the treatment of AD, the combination with another disease-related target, CB2R, to obtain an overadditive effect in vivo seems highly promising due to the immunomodulatory effect of CB2R agonists. Both approaches have been realised utilising a novel structural motif based on 2-benzylbenzimidazoles in combination with phenylcarbamates. First, compounds selective towards hBChE were designed, guided by computational studies using GOLD. Synthesis and subsequent testing on hChEs revealed nanomolar inhibition of hBChE, while showing high selectivity over hAChE and hCB2R. Non-toxic compound 52d showed excellent in vivo efficacy in both spatial working memory, as well as passive avoidance. The residual affinity of compound 52d for hCB2R was then subsequently optimised to develop “balanced” BChE/CB2R hybrid ligands, exploring two different carbamate introduction points to the 2-benzylbenzimidazole core while using small carbamate moieties, resulting in two multifaceted sets of compounds. After binding studies on ChEs and CBRs, two “balanced” and subtype-selective BChE/CB2R hybrid ligands were then evaluated in detail, compounds 60d and 66d. Both compounds were characterised as pseudo-irreversible inhibitors of hBChE through kinetic studies on hBChE and partial agonist of hCB2R through functional assays on hCB2R. As described 2- benzylbenzimidazole compounds show structural similarity to etonitazene, both compounds were tested in a MOR-βarr2 assay, in which no activity was detected. Subsequent treatment of microglial cells which were stimulated by LPS showed a clear immunomodulatory and neuroprotective effect, which was not observed for CB2R-deficient HT-22 cells, therefore indicating a CB2R-mediated effect. Due to its balanced profile, agonism on hCB2R, immunomodulatory effect and absence of toxicity, in vivo behavioural studies of compound 60d were performed in which the cognitive impairments in mice were induced by ICV injection of Aß25-35. Compound 60d showed an active dose range from 0.3- 3.0 mg·kg−1 and a complete prevention of Aß25-35-induced learning impairments for both spatial 38 working memory and long-term contextual memory at 3.0 mg/kg. While combination studies showed that BChE/CB2R hybrid targeting indeed leads to synergistic effects in vivo, initial PK studies in mice using ligands 60d and 66d, proved good BBB-permeability of both compounds, underlining the potential of designed BChE/CB2R hybrid ligands for the therapy of neurodegenerative diseases. Summarised, inflammation and its associated molecular hallmarks have been addressed diagnostically and therapeutically using small molecules as either reporters or influencers of disease. Reported studies have the potential to not only help understanding inflammation scientifically, but also to optimise patient stratification and medication of people suffering from neurodegeneration. / Der Prozess der Entzündung ist die Ursache einer Vielzahl von Krankheiten, welche eine immense Bürde für Patienten, Gesellschaft und Gesundheitssystem darstellen. So ist es nicht verwunderlich, dass mit der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung und der koronaren Herzkrankheit zwei der drei häufigsten Todesursachen weltweit entzündungsassoziiert sind.2 Eine Vielzahl dieser entzündungsassoziierten Krankheiten kann immer noch nicht ausreichend behandelt werden, jedoch sind Entzündungen durch gewebe- und krankheitsabhängige Kennzeichen identifizierbar, welche für Diagnose und Therapie adressiert werden können. Die Darstellung und Identifizierung dieser krankheitsspezifischen Entzündungsstellen ermöglicht nicht nur das Beantworten wissenschaftlicher Fragestellungen, sondern kann auch für bildgebende Verfahren und die Stratifizierung von Patienten genutzt werden. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit der erste CXCR2-PET Tracer entwickelt, um neutrophile Granulozyten zu markieren und zu quantifizieren. Hierzu wurden 18F als Radionuklid und Quadratsäurediamide als CXCR2-Liganden genutzt. Diverse fluorierte , „kalte“ Liganden wurden synthetisiert und bezüglich ihrer CXCR2-Affinität getestet. Für die vielversprechendste Verbindung 29b wurde eine indirekte Markierungsmethode entworfen. Der daraus resultierende Tracer [18F]29b zeigte zeitabhängige und spezifische Bindung an CXCR2 in untersuchten HEK-Zellen. Erste Biodistributionsstudien und dynamische PET/CT deuteten eine gute, renale Ausscheidung und hohe metabolische Stabilität des Radiotracers an. Neuroinflammation beschreibt die Reaktion des zentralen Nervensystems auf Entzündungsprozesse bei welchen vor allem Mikroglia eine große Rolle spielen, insbesondere bezüglich der Neurodegeneration. Um eben jene Neuroinflammation und damit Neurodegeneration therapeutisch zu adressieren, wurden sowohl BChE/CB2R-Hybridliganden, als auch selektive BChE-Inhibitoren designt und synthetisiert. BChE ist in der Lage als Surrogat für AChE zu agieren und die Inhibition oder der Knockout der BChE resultierte in neuroprotektiven Effekten in vivo, weshalb BChE eine wichtige Zielstruktur für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen darstellt. Während die Inhibition der BChE vermutlich eine größere Rolle bei der zukünftigen Behandlung der Alzheimer-Krankheit spielen könnte, stellt die Kombination mit einer weiteren, krankheitsassoziierten Zielstruktur eine vielversprechende Behandlungsoption dar. Durch eine solche Hybridisierung könnten, neben dem immunmodulierenden Effekt von CB2R-Agonisten, überadditive Effekte erzielt werden. Beide Ansätze wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht, wobei ein strukturelles Motiv, 2-Benzylbenzimidazol in Verbindungen mit Phenylcarbamaten für beide Konzepte genutzt wurde. Zunächst wurden hBChEselektive Verbindungen entworfen, wobei molekulares Docking mittels GOLD genutzt wurde. Nach Synthese der Verbindungen wurden die potentiellen Inhibitoren an beiden Cholinesterasen getestet. Hierbei wurden nanomolare hBChE-Inhibitoren gefunden, welche selektiv gegenüber hAChE und hCB2R waren. Die nicht-toxische Verbindung 52d zeigte exzellente Wirksamkeit in vivo sowohl bezüglich des räumlichen Arbeitsgedächtnis, als auch bezüglich des nicht-räumlichen Langzeitgedächtnisses. Die verbleibende CB2R-Affinität von Verbindung 52d wurde mit dem Ziel der Hybridisierung optimiert, indem zwei strukturelle Punkte zur Einführung von - überwiegend sterisch wenig anspruchsvollen - Carbamaten in das 2-Benzylbenzimidazolgrundgerüst evaluiert wurden. Dies führte zu zwei facettenreichen Sätzen von Verbindungen, aus denen, nach Bindungsstudien an Cholinesterasen und 40 Cannabinoid-Rezeptoren, zwei „ausbalancierte“, subtypselektive Verbindungen, 60d und 66d, im Detail untersucht wurden. Beide Hybridliganden wurden mittels Kinetikstudien als pseudoirreversible hBChE-Inhibitoren charakterisiert. Zudem konnten sie als partielle Agonisten an hCB2R charakterisiert werden. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu Etonitazen wurden die Verbindungen in einem MOR-βarr2-Assay getestet, wobei keine Aktivität gemessen wurde. Anschließende Testung an Microgliazellen zeigte einen immunmodulatorischen Effekt, welcher in CB2R-defizienten Zellen nicht beobachtet werden konnte, was auf einen CB2R-abhängigen Mechanismus hinweist. Wegen dem „ausbalancierten“ Profil, Agonismus an hCB2R, immunmodulatorischen Effekt und fehlender Toxizität, wurde Verbindung 60d in vivo getestet. In verwendeten Verhaltensstudien wurden kognitive Defizite durch ICV-Injektion von Aβ25-35 induziert. In einer Dosierungsspanne von 0.3-3.0 mg/kg konnte Verbindung 60d die Effekte signifikant abmildern, bei 3.0 mg/kg sowohl bezüglich des räumlichen Arbeitsgedächtnis, als auch bezüglich passiver Vermeidung, komplett verhindern. Zusätzliche in vivo Kombinationsstudien mit selektiven Liganden an BChE und CB2R bestätigten einen synergistischen Effekt. Um die Pharmakokinetik von 60d und 66d zu evaluieren, wurden erste PK-Studien an Mäusen durchgeführt. IV-Injektion von jeweils 2 mg/kg der Verbindungen bestätigten gute Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke. Dies unterstreicht das Potential der designten BChE/CB2R-Hybridliganden für die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen. Zusammengefasst wurden Entzündungen und die damit assoziierten Kennzeichen im Kontext dieser Arbeit diagnostisch und therapeutisch adressiert, indem kleine Moleküle entweder als Reporter oder Therapeutikum entwickelt wurden. Dargelegte Ergebnisse zeigen das Potential durch die vorgestellten Verbindungen, entzündungsinduzierte Krankheiten nicht nur grundsätzlich zu erfassen, sondern auch Patienten zu stratifizieren und einen neuen Behandlungsansatz für Neurodegeneration bereitzustellen.

Zusätzlich zu seiner Funktion innerhalb des Gerinnungssystems vermittelt Thrombin inflammatorische Reaktionen. Mastzellen (MZ) sind durch die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie Maus-Mastzell Proteasen (MCPTs mouse mast cell proteases auch als mMCPs bekannt), Zytokinen und Chemokinen. charakterisiert. Da Thrombinrezeptoren, auch als Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) bekannt, von MZ exprimiert werden, wurde untersucht ob eine MZ-Aktivierung über die Thrombin/PAR Interaktion bei einer dermalen Entzündung eine Rolle spielt. Die intrakutane Injektion von Thrombin in die Ohren von C57BL/6 Kit+/+ Mäusen löste eine sofortige kutane Entzündung, einhergehend mit einer starken Ohrschwellung, aus. Im Vergleich dazu war diese Schwellung in MZ-defizienten C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen deutlich stärker, was darauf hindeutet, dass MZ anti-inflammatorisch wirken. Die lokale Rekonstitution von C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen mit knochenmarksgenerierten MZ normalisierte diesen Effekt. Die quantitative histomorphometrische Untersuchung der MZ bestätigte zusätzlich eine starke Degranulation der MZ nach Thrombininjektion nach. PCR-Analysen der MZ wiesen die Expression aller bekannten Thrombin-Rezeptoren. Die Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen von Thrombin oder PAR-agonistischen Peptiden führte zu einer dosis-abhängigen Degranulation der MZ, was nahe legt, dass die Degranulation der MZ für die Limitierung der thrombin-induzierten Entzündung nötig ist. Gestützt wird die Hypothese durch die Tatsache, dass Zellkulturüberstand von degranulierten MZ zu einer Inaktivierung der Thrombinaktivität führt. Des Weiteren führte die Injektion von Thrombin in die Ohren von MCTP4-defizienten Mäusen zu einer deutlich erhöhten Ohrschwellung im Vergleich zur korrespondierenden Wildtyp-Maus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die sofortige thrombin-induzierte Entzündungsreaktion durch kutane MZ kontrolliert wird. Dieser Mechanismus wird teilweise durch MCPT4 vermittelt. / In addition to its function in the coagulation system, thrombin mediates inflammatory reactions. Mast cells (MCs) are characterized by releasing inflammatory mediators like mouse mast cell proteases (MCPTs, also designated mMCPs), cytokines, and chemokines, upon activation. Since thrombin-receptors, also known as Proteinase-activated receptors (PAR), are expressed by MCs, it was questioned whether MC activation via the thrombin/PAR axis plays a role in skin inflammation. Intracutaneous injection of thrombin in ears of C57BL/6 Kit+/+ mice induced immediate inflammatory skin reactions associated with a distinct ear swelling. This swelling was more pronounced in MC-deficient C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice, indicating that MCs are anti-inflammatory, local reconstitution of C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice with C57BL/6 Kit+/+ bone marrow-derived MCs normalized this effect. Additionally thrombin injection resulted in a strong degranulation of MCs assessed by quantitative histomorphometry. PCR analysis of MCs displayed expression of all known thrombin receptors. Stimulation with thrombin or PAR agonistic peptides resulted in a dose-dependent degranulation of MC, suggesting MC degranulation could be necessary for the limitation of thrombin-induced inflammatory responses. Supporting this hypothesis, supernatant from degranulated MCs inactivated thrombin activity. Furthermore, injection of thrombin in ears of C57BL/6 MCPT4-deficient mice, resulted in markedly increased ear swelling compared to the corresponding wild type mice. Together our results suggest that thrombin-induced immediate inflammatory skin reactions are controlled by cutaneous MCs, a mechanism partly mediated via MCPT4.

T-Helfer(Th)-Lymphozyten spielen aufgrund ihrer Expression von Zytokinen eine zentrale Rolle in der Regulation von Immunantworten. Durch die Zytokine fördern die Th-Zellen die Rekrutierung und Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems, den Immunglobulin-Klassenwechsel von B-Zellen und ihre Differenzierung zu antikörper-sezernierenden Plasmazellen. Welche Zytokine eine aktivierte Th-Zelle exprimiert hängt von instruktiven Signalen ab, die sie in der Regel von antigen-präsentierenden Signalen bekommt. Mit den instruktiven Signalen wird ein ganzes Differenzierungsprogramm in den Th-Zellen initiiert, welches am Ende zu einer epigenetischen Prägung des Effektorprogramms führt, sodass die Th-Zelle auch bei nachfolgenden Aktivierungen die gleichen Funktionen ausführt. In dieser Arbeit wurde untersucht wie diese Differenzierungsprogramme zur Pathogenese von chronischen Entzündungen beitragen und wie eine chronische Entzündung wiederum die Differenzierung der Th-Zellen beeinflusst. Des Weiteren haben wir molekulare Adaptationen identifiziert, die selektiv in chronisch aktivierten entzündungsfördernden Th Typ 1 (Th1)-Zellen hochgeregelt werden. Diese Adaptationen, wie die Expression von Twist1 und Hopx, fördern das Überleben der Th1-Zellen am Ort der Entzündung und könnten zur Perpetuation der Entzündung entscheidend beitragen. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass Th-Zellen durch ihre pro-inflammatorische Prägung zwar gut gerüstet sind uns gegen Pathogene zu schützen, im Falle einer Autoreaktivität aber auch Immunpathologie und chronische Entzündungen auslösen können. Allerdings weisen unsere Arbeiten auch daraufhin, dass selektive Anpassungen der Th-Zellen an eine chronische Entzündung auch gleichzeitig Ansatzpunkte für ein therapeutisches Eingreifen bei chronisch-entzündlichen Krankheiten darstellen. / T helper (Th) lymhocytes play a central role in the regulation of immune responses. Through the expression of cytokines, Th cells orchestrate the recruitment and activation of cells of the innate immune system, and induce antibody class switch recombination in B lymphocytes and their differentiation into antibody-secreting plasma cells. Which cytokines an activated Th cell expresses is dependent on instructive signals, the Th cells receives from antigen-presenting cells. Such instructive signals initiate a differentiation program, which in the end leads to the epigenetic imprinting of the effector program, ensuring that the Th cell execute the same functions in subsequent activations. In this thesis, we investigated how such differentiation programs contribute to the pathogenesis of chronic inflammation and how chronic inflammation, in turn, affects the differentiation of the Th cells. Furthermore, we have identified molecular adaptations, which are selectively upregulated in chronically activated pro-inflammatory Th type 1 (Th1) cells. Such adaptations, like the upregulation of Twist1 and Hopx, promote the survival of Th1 cells in the inflamed tissue and could thereby contribute to the perpetuation of the inflammation. Taken together, our data show that Th cells with a pro-inflammatory imprint are well equipped to protect us against pathogens, in case of autoimmunity, however, cause immune pathology and chronic inflammation. At the same time, our work also shows that the selective adaptations of Th cells to chronic inflammation could also be promising targets for novel therapies for the treatment of chronic inflammatory diseases.

Background: Horses are much predisposed and susceptible to excessive and acute inflammatory responses that cause the recruitment and stimulation of polymorphnuclear granulocytes (PMN) together with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the release of cytokines. The aim of the study is to develop easy, quick, cheap and reproducible methods for measuring tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in the equine whole blood cultures ex-vivo time- and concentration dependently. Results: Horse whole blood diluted to 10, 20 and 50 % was stimulated with lipopolysaccharide (LPS), PCPwL (a combination of phytohemagglutinin E, concanavalin A and pokeweed mitogen) or equine recombinant TNF-α (erTNF-α). TNF-α and IL-1Ra were analyzed in culture supernatants, which were collected at different time points using specific enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Both cytokines could be detected optimal in stimulated 20 % whole blood cultures. TNF-α and IL-1Ra releases were time-dependent but the kinetic was different between them. PCPwL-induced TNF-α and IL-1Ra release was enhanced continuously over 24–48 h, respectively. Similarly, LPS-stimulated TNF-α was at maximum at time points between 8–12 h and started to decrease thereafter, whereas IL-1Ra peaked later between 12–24 h and rather continued to accumulate over 48 h. The equine recombinant TNF-α could induce also the IL-1Ra release. Conclusions: Our results demonstrate that similar to PCPwL, LPS stimulated TNF-α and IL-1Ra production time-dependently in whole blood cultures, suggesting the suitability of whole blood cultures to assess the release of a variety of cytokines in health and diseases of horse.