Grado de doctor en ciencias biomédicas / La enzima ADAR1 (Adenosina Deaminasa específica de RNA 1) presenta una expresión aumentada en diversos tumores, incluyendo el cáncer de mama. Múltiples análisis bioinformáticos y experimentales han revelado que la edición del mRNA mediada por esta proteína afecta preferentemente regiones intrónicas o regiones no traducibles del mRNA (UTRs), modificando la expresión o estabilidad de los transcritos editados por esta proteína. Adicionalmente, un grupo significativo de los genes editados en las regiones UTRs por ADAR1 están asociados a la respuesta al daño del DNA y puntos de control del ciclo celular, los cuales han sido relacionados a la progresión del cáncer de mama. A la fecha, no se ha determinado el efecto de la sobreexpresión de ADAR1 y el impacto de la edición de estos transcritos sobre la proliferación y la respuesta al daño del DNA de este tipo de cáncer, donde existe una alta expresión de esta enzima. Así, este trabajo propuso la siguiente Hipótesis: “La expresión de la enzima ADAR1 regula la estabilidad de los mRNAs de genes que participan en la respuesta al daño del DNA y puntos de control del ciclo celular, promoviendo el estrés replicativo y la proliferación celular en adenocarcinoma mamario” proponiendo como objetivo general determinar el efecto de la enzima ADAR1 sobre la expresión de genes asociados a los procesos de respuesta al daño del DNA y control del ciclo celular; y caracterizar su efecto sobre la replicación y proliferación celular, en el adenocarcinoma mamario. Para comprobar esta hipótesis se llevaron a cabo los siguientes objetivos específicos: 1. Analizar el efecto de la expresión de ADAR1, en la expresión y estabilidad de los mRNAs de genes asociados a los procesos de respuesta al daño del DNA y control del ciclo celular en las líneas celulares MCF-7 y ZR-751; 2. Determinar el efecto de la expresión de ADAR1 sobre el estrés replicativo en las líneas celulares MCF-7 y ZR-751; 3. Evidenciar el efecto de la expresión de ADAR1 sobre la proliferación en las líneas celulares MCF-7 y ZR-751; y 4. Analizar la expresión de ADAR1 y la edición de mRNAs de genes que participan en los procesos de respuesta al daño del DNA y control del ciclo celular, en muestras de pacientes con adenocarcinoma mamario. Los resultados muestran que la disminución de la expresión de ADAR1 en células ZR-751 produce cambios significativos en la estabilidad de los mRNAs editados por ADAR1 involucrados en los procesos de respuesta al daño del DNA, replicación y proliferación celular. Estos cambios se relacionaron con una disminución de la proliferación y un incremento en la apoptosis. Adicionalmente, células MCF7 y ZR-751 que presentan una disminución en la expresión de ADAR1, presentan una disminución significativa de la actividad de la cascada transduccional de respuesta al daño en el DNA y una acumulación en la fase S del ciclo celular. Por otro lado, el análisis de una cohorte de pacientes con cáncer de mama (The Cancer Genome Atlas, TCGA), mostró que los tumores presentan un mayor número de variantes, generadas por ADAR, en los UTRs analizados, en comparación a tejido mamario no tumoral. Finalmente, pacientes cuyos tumores presentan una mayor expresión de ADAR1 o número de variantes en sus UTRs, tienen una sobrevida significativamente menor que pacientes con baja expresión ADAR1. Así, este trabajo demuestra que ADAR1 desempeña un papel importante en la progresión de BRCA a través de la regulación de la estabilidad y expresión de genes que están involucrados en la replicación y la proliferación, afectando a la proliferación celular, viabilidad y respuesta al daño del DNA. / The double stranded RNA-specific adenosine deaminase (ADAR1) enzyme has an increased expression in various tumors, including breast cancer (BRCA). Multiple bioinformatic and experimental analyzes have revealed that mRNA editing mediated by ADAR1 preferentially affects intronic or untranslated regions (UTRs) of the mRNA, modifying the expression or stability of the edited transcripts. In addition, a significant group of genes edited in UTRs regions are associated with DNA damage response and cell cycle control points, which have been linked to breast cancer progression. However, the effect of the overexpression of ADAR1 and the impact of the editing of these transcripts on the proliferation and response to DNA damage of this type of cancer, where there is a high expression of this enzyme, has not been determined.This work aims to determine ADAR1 expression role on genes associated in DNA damage response and cell cycle, to further characterize its effect on replicative stress and proliferation in breast cancer. Based on that, the following hypothesis was formulated: "ADAR1 expression regulates the mRNAs stability of genes involved in the DNA damage response and cell cycle check points, promoting replicative stress and cell proliferation in breast cancer". With the following specific aims: 1. To Analyze the ADAR1 expression role on mRNA expression and stability of genes associated with DNA damage response and cell cycle processes in MCF-7 cell lines and ZR-751. 2. To determine the ADAR1 expression effect on replicative stress in MCF-7 and ZR-751 cell lines. 3. To demonstrate the ADAR1 expression effect on proliferation in cell lines MCF-7 and ZR-751 and 4. To analyze the ADAR1 expression pattern and RNA editing on genes involved in the DNA damage response and cell cycle control from patients with breast adenocarcinoma. Our results demonstrate that decreased ADAR1 expression in ZR-751 cells produces significant changes on mRNAs stability of edited transcripts by ADAR1 involved in DNA damage response and DNA replication. Furthermore, ADAR1 knock down cells shown a decreased proliferation, viability and an increased apoptosis, in comparison to control cells. Moreover, MCF7 and ZR-751 knock down cells exhibit a significant decrease of their DNA damage response activation with a significant accumulation on S phase, suggesting an impair cell cycle progression of these cells. Finally, breast cancer patients from The Cancer Genome Atlas shown an increased number of A to G variants, addressable to ADAR1 in their UTRs, compared to control patients from this cohort. Finally, patients with an increased ADAR1 expression or variants counts in their UTRs have shown a decreased overall survival, suggesting that ADAR1 function has an implicit clinical outcome. Taken together, this work shows that ADAR1 plays an important role in BRCA progression through the regulation of mRNA stability and expression from genes that are involved in the replication stress and proliferation, affecting the cell proliferation, DNA damage response and viability allowing the development of malignant phenotypes in breast cancer cells. / 22/11/2019

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El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor. S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat. Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat. / El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A). Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor. Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado. Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato. / The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A). A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS. It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end. A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme. Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis.